Wysoka trwałość 25-hydroksy-witaminy D w próbkach surowicy

diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics
2012 • Volume 48 • Number 3 • 299-302
Praca oryginalna • Original Article
Wysoka trwałość 25-hydroksy-witaminy D w próbkach
surowicy przetrzymywanych w różnych warunkach
podczas rutynowo wykonywanych pomiarów
immunochemicznych
The high stability of 25-hydroxy-vitamin D in serum samples
kept under different storage conditions during the routine
measurement by immunochemical method
Zbigniew Bartoszewicz, Agnieszka Kondracka, Tomasz Bednarczuk
Katedra i Klinika Chorób Wewnętrznych i Endokrynologii, Warszawski Uniwersytet Medyczny; Zespół Endokrynologii, Zakład Epigenetyki
Człowieka, Instytut Medycyny Doświadczalnej i Klinicznej im. M. Mossakowskiego PAN, Warszawa
Streszczenie
W niniejszej pracy przeanalizowaliśmy zasadność zaleceń dotyczących transportu i przechowywania próbek przeznaczonych
do pomiarów stężenia 25(OH)D rutynowymi metodami immunochemicznymi. Uzyskane wyniki wskazują na wysoką trwałość
25(OH)D w surowicy zarówno w temperaturze pokojowej jak i obniżonej. Nie stwierdzono znaczącego wpływu rozmrażania
próbki, przedłużonego przetrzymywania surowicy nad skrzepem oraz działania promieniowania UV na stabilność 25(OH)D.
Próbki nie wymagają dodatkowych zabiegów zabezpieczających i mogą być bezpiecznie analizowane nawet po kilku dniach
przechowywania na świetle w temperaturze pokojowej.
Summary
In this study we examined the validity of recommendations for the transport and storage of samples during the routine measurement of 25(OH)D by immunochemical methods. The results indicate the high stability of 25(OH)D in serum at room and
reduced temperature. There was no significant effect of multiple freeze-thaw cycles, UV and prolonged keeping the serum
above the clot on the stability of 25(OH)D. Samples do not require additional security procedures and can be safely analyzed
even after several days of storage in the light at room temperature.
Słowa kluczowe:witamina D, testy immunochemiczne, błąd przedanalityczny
Key words:witamina D, immunoassays, preanalytical error
Wstęp
Duże zainteresowanie witaminą D wynikające z kompleksowej roli jaką pełni w organizmie człowieka oraz konsekwencji
jej niedoboru dla naszego zdrowia przyczyniło się do znacznego wzrostu ilości wykonywanych oznaczeń diagnostycznych jej metabolitów. Uważa się, że status zaopatrzenia
organizmu w witaminę D najlepiej odzwierciedla sumaryczne stężenie jej 25-hydroksylowanych form cholekalcydiolu
(25(OH)D3) oraz ergokalcydiolu (25(OH)D2), które jest wystarczająco wysokie do pomiaru metodami immunochemicznymi a nie podlega szybkim zmianom związanym z syntezą
skórną i dietą [1,2]. Z tych powodów pomiar stężenia kalcydiolu (25(OH)D) jest najczęściej wykonywanym oznaczeniem diagnostycznym witaminy D, natomiast w chorobach
związanych z zaburzeniami 1-alfa-hydroksylacji oznaczeniem przydatnym, chociaż trudnym i pracochłonnym do wykonania, jest pomiar stężenia kalcytriolu 1,25(OH)2D [3].
Jeżeli uwzględnimy rolę fizjologiczną wymienionych powyżej
metabolitów, to nazwą witamina D powinniśmy określać tylko
cholekalcyferol i ergokalcyferol, ich 25-hydroksylowane pochodne są prohormonami, w stosunku do hydroksylowanych
w pozycjach 1 i 25 biologicznie czynnych hormonów, nota
bene oddziałujących poprzez receptor, nazywany tradycyjnie receptorem dla witaminy D. Jednak powszechnie przyjęło się, aby zlecenia testów laboratoryjnych przeznaczonych
do oznaczania stężenia hydroksylowanych pochodnych witaminy D określać uproszczoną nazwą „witamina D”, ewentualnie z rozwinięciem 25(OH)D lub 25(OH)D3.
299
Wysoka trwałość 25-hydroksy-witaminy D w próbkach surowicy przetrzymywanych w różnych warunkach ...
Stężenie 25(OH)D mierzone jest zwykle za pomocą metod
immunochemicznych, jakkolwiek nowoczesne metody HPLC,
GC-MS oraz LC-MS/MS coraz częściej mają zastosowanie w
rutynowej diagnostyce. We wszystkich metodach występują problemy związane z wiarygodnością wyników oznaczeń,
które mogą prowadzić do różnej kwalifikacji tego samego
pacjenta a w konsekwencji do nieprawidłowych decyzji terapeutycznych [4]. Znaczenie tych zagadnień widoczne
jest wyraźnie podczas analizy wyników międzynarodowych
sprawdzianów międzylaboratoryjnej kontroli jakości [5].
Równie istotnym elementem wpływającym na wiarygodność
otrzymywanych wyników jest możliwość popełnienia błędu
przedanalitycznego związanego z zabezpieczeniem i przechowywaniem materiału biologicznego do badań. W obiegowej opinii wielu polskich laboratoriów metabolity witaminy D
w surowicy i osoczu są nietrwałe i dlatego próbki wymagają
dodatkowych zabezpieczeń. Kiedy w 2008 roku rozpoczynaliśmy wykonywanie oznaczeń 25(OH)D spotkaliśmy się
z następującymi sugestiami naszych kolegów mających doświadczenie z oznaczeniami witaminy D:
• po pobraniu krwi probówki należy dodatkowo zabezpieczać folią aluminiową przed wpływem światła,
• próbki należy jak najkrócej przechowywać w temperaturze
pokojowej lub w lodówce,
• w przypadku przechowywania w stanie zamrożonym należy używać nie przepuszczających światła probówek typu
„amber”. Powyższe sugestie nie znajdują jednak potwierdzenia w zdecydowanej większości dostępnej literatury
fachowej.
Celem podjętych badań była weryfikacja zasadności restrykcyjnych zaleceń dotyczących transportu i zabezpieczania
próbek oraz określenie wpływu warunków przechowywania
na trwałość 25(OH)D w surowicy.
Materiał i metody
W Laboratorium Kliniki Endokrynologii WUM, realizując wyżej przedstawione restrykcyjne zalecenia dotyczące transportu i przechowywania próbek przeznaczonych do oznaczeń 25(OH)D, podjęliśmy próbę weryfikacji zasadności
takich zaleceń i na przestrzeni 4 lat wykonaliśmy testami
Roche Diagnostics (Vitamin D3 (25-OH) i Vitamin D total)
na automatycznym analizatorze Elecsys 2010 szereg oznaczeń sprawdzających wpływ parametrów przedanalitycznych na wynik pomiaru 25(OH)D. Materiałem były przypadkowe próbki krwi pełnej pobranej na skrzep pochodzące od
pacjentów Centralnego Szpitala Klinicznego WUM. Próbki
były standardowo odwirowywane, surowica przenoszona
do oddzielnych probówek lub pozostawiana nad skrzepem,
probówki podczas doświadczeń zawsze były zamknięte korkiem. Jedna próbka surowicy przeznaczona do oznaczenia
stężenia wyjściowego była zamrażana a pozostałe przetrzymywane na stole laboratoryjnym bez ochrony przed światłem lub w lodówce przez 1, 3, 5 lub 9 dni. Dla części próbek
wykonano również oznaczenia w surowicy i osoczu pochodzącym z tego samego pobrania. Wykonano także doświad300
czenia sprawdzające wpływ promieniowania UV na próbki
surowicy oraz wpływ trzech cykli rozmrażania i zamrażania
próbki z przetrzymywaniem jej po rozmrożeniu przez 3 godziny w temperaturze pokojowej.
Istotność różnic pomiędzy parami wyników (wartość wyjściowa i wartość dla próbki poddanej działaniu badanych czynników) analizowano za pomocą testu Wilcoxona przy użyciu
programu Statistica 9.0 (StatSoft). W celu przedstawienia
graficznego dla każdego uzyskanego wyniku zmianę stężenia w stosunku do wartości początkowej wyrażano jako %
wyjściowej wartości stężenia z zachowaniem znaku: – dla
spadku wartości oraz + dla wzrostu. Dla zmian wyrażonych
w % obliczono odchylenie standardowe i medianę.
Wyniki
Na rycinie 1 podano zakresy zmian stężenia 25(OH)D dla kolejnych wariantów doświadczalnych wyrażone jako podwójne odchylenie standardowe, zaznaczono również medianę
obserwowanych zmian. Mediana zmian stężenia 25(OH)D
wynosiła odpowiednio: surowica w temp. pok. 1 dzień (d)
+1,0%; 3 d -0,2%; 5 d -2,7%; 9 d +0,4%; surowica przetrzymywana nad skrzepem, temp. pok. 1d +3,6%; 3 d +9,2%;
5 d +8,4%; 9 d +2,7%; surowica, lodówka 1d -0,6%; 3
d -2,2%; 5 d -4,6%; 9 d -4,2%; surowica nad skrzepem, lodówka
1d +2,9%; 3 d +1,4%; 5 d +2,9%. Dla próbki trzykrotnie rozmrażanej mediana zmian wynosiła -2,6%. Działanie światła UV przez 10 min skutkowało wartością mediany zmian
+8,7% a silne światło żarówki przez 1 godzinę +4,3%. Stężenie witaminy D w osoczu EDTA nie wykazywało znacznych
różnic w stosunku do stężenia w surowicy (mediana +4,6%).
Zakres zmian w większości wariantów doświadczalnych był
podobny do zmienności dziennej obliczonej z wykorzystaniem wyników oznaczeń dla tej samej próbki powtarzanych
w ciągu 1-5 godzin od rutynowego oznaczenia.
Rycina 1
Zakresy zmienności stężenia witaminy 25(OH)D w próbkach przetrzymywanych w różnych warunkach. Oznaczenia wykonano testami firmy Roche Diagnostics.
Tabela I
Wartości populacyjne stężenia witaminy D wg danych producenta testów (Roche Diagnostics) i wyliczona na ich podstawie dopuszczalna
niestabilność analitu.
Test
Rozmiar populacji referencyjnej
Przedział stężeń dla populacji
referencyjnej
Dopuszczalna niestabilność
Vitamin D3 (25-OH)
n=358, 5-95%
11,1-42,9 ng/ml
2,65 ng/ml
Vitamin D total
n=453, 2,5-97,5%
5,26-47,0 ng/ml
3,48 ng/ml
Dyskusja
Wybrane losowo do badań surowice odzwierciedlały typowy
dla populacji polskiej niedobór witaminy D: zakres stężeń
25(OH)D wynosił 7,2 – 32,6 ng/ml, mediana 13,5 ng/ml. Dla
tak niskich stężeń precyzja pomiaru immunochemicznego
jest stosunkowo niska. Według danych producenta testów
dla stężeń próbek badanych w zakresie 6,8 – 28 ng/ml precyzja wewnątrzseryjna (wyznaczana wg standardów Cinical
Laboratory Standards Institute) wynosi około 5-8% a precyzja międzyseryjna 8,5 – 10,7%. W próbkach testowanych
w naszym laboratorium sprawdzaliśmy powtarzalność wykonując 2 – 4 pomiary podczas 5 godzin i maksymalna zaobserwowana zmiana wynosiła 27%, średnio 11%.
Według powszechnie przyjętych ustaleń maksymalna dopuszczalna niestabilność analitu nie powinna przekraczać
1/12 przedziału zmienności biologicznej, czyli dla witaminy
25(OH)D ok. 3 ng/ml (Tab. I). We wszystkich wariantach doświadczalnych, zarówno dla zmienności dziennej jak i trwałości próbki podczas wielodniowego przetrzymywania powyższy wymóg stabilności był spełniany przez 97% próbek.
Uzyskane wyniki wskazują na wysoką trwałość 25(OH)D
w surowicy, zarówno w temperaturze pokojowej jak i w lodówce. Również w surowicy długotrwale przetrzymywanej
nad skrzepem stężenie 25(OH)D wzrasta tylko w niewielkim
stopniu. Nie stwierdzono znaczącego wpływu rozmrażania
próbki i krótkotrwałego, intensywnego promieniowania UV
na stabilność 25(OH)D w surowicy. Wysoka trwałość 25(OH)
D w surowicy i osoczu jest też opisywana przez innych autorów, zarówno dla próbek przetrzymywanych w lodówce jak
i temperaturze pokojowej oraz 30oC (8, 9). Również próbki
zamrożone są bardzo trwałe, mogą być przetrzymywane powyżej 10 lat w –20oC [10] oraz wielokrotnie rozmrażane [6,
8]. Większość doniesień wskazuje, że dla wielu metod oznaczania stężenia witaminy D wykorzystywanych w celach diagnostycznych różne sposoby pobrania krwi, tzn. na skrzep,
antykoagulanty czy z zastosowaniem żelu separującego nie
wpływają istotnie na wynik oznaczenia [5, 11].
Wydaje się, że wysoką trwałość metabolitom witaminy D
w surowicy nadają białka transportujące: białko wiążące witaminę D (VDBP) oraz albumina, które w przypadku 25(OH)
D wiążą ponad 99% całkowitej puli metabolitu [10]. Trzeba
jednak pamiętać, że znacznie niższą trwałością mogą oznaczać się czyste chemicznie metabolity witaminy D oraz próbki oznaczane testami immunochemicznymi wymagającymi
wstępnej ekstrakcji [7, 10]. Prawdopodobnie w tych przypadkach istnieje potrzeba dodatkowego zabezpieczenia próbek
przed działaniem światła i temperatury. Ma to istotne znaczenie praktyczne ponieważ do oznaczeń witaminy 25(OH)
D coraz częściej stosuje się nowoczesne metody analityczne
HPLC i LC-MS/MS wymagające wstępnego oczyszczania
próbek z fazy stałej (SPE) oraz czystych chemicznie deuterowanych standardów używanych do standaryzacji [12].
Wnioski
Wbrew opinii prezentowanej w niektórych polskich laboratoriach trwałość 25(OH)D w analizowanych próbkach jest
wysoka zarówno w lodówce jak i w temperaturze pokojowej.
Nie stwierdzono znaczącego wpływu rozmrażania próbki,
przetrzymywania jej nad skrzepem oraz promieniowania UV
na stabilność 25OHD. Próbki nie wymagają dodatkowych
zabiegów zabezpieczających i mogą być bezpiecznie analizowane nawet po kilku dniach przechowywania na świetle
w temperaturze pokojowej.
Piśmiennictwo
1. Holick MF. Vitamin D: evolutionary, physiological and health perspectives. Curr Drug Targets 2011; 12: 4-18.
2. Hollis BW. Assessment of circulating 25(OH)D and 1,25(OH)2D:
emergence as clinically important diagnostic tools. Nutr Rev
2007; 65: S87-S90.
3. Hollis BW. Assessment of vitamin D status and definition of normal circulating range of 25-hydroxyvitamin D. Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes 2008; 15: 489-494.
4. Bartoszewicz Z, Kondracka A, Jaźwiec R i wsp. Can we accurately measure the concentration of clinically relevant vitamin D
metabolites in circulation? – The problems and its consequences. Endokrynologia Polska (w druku).
5. Carter GD. Accuracy of 25-hydroxyvitamin D assays: confronting the issues. Curr Drug Targets 2012; 12: 19-28.
6. Antoniucci DM, Black DM, Sellmeyer DE. Serum 25-hydroxyvitamin D is unaffected by multiple freeze-thaw cycles. Clin Chem
2005; 51: 258-260.
7. Zerwekh JE. The measurement of vitamin D analytical aspects.
Ann Clin Biochem 2004; 42: 272-281.
8. Wielders JPM, Wijnberg FA. Preanalytical stability of 25(OH) –
vitamin D3 in human blood or serum at room temperature: solid
as a rock. Clin Chem 2009; 55: 1584-1585.
9. Carter GD, Carter CR, Gunter E, et al. Measurement of vitamin
D metabolites: an international perspective on mathodology and
clinical interpretation. J Ster Biochem Mol Biol 2004; 89-90: 467471.
10. Hollis BW. Measuring 25-hydroxyvitamin D in a clinical environment: challenges and needs. Am J Clin Nutr 2008; 88(suppl):
507-510S.
11. Leino A, Turpeinen U, Koskinen P. Automated measurement of
25-OH vitamin D3 no the Roche Modular E170 analyzer. Clin
301
Wysoka trwałość 25-hydroksy-witaminy D w próbkach surowicy przetrzymywanych w różnych warunkach ...
Chem 2008; 54: 2059-2062.
12. Wallace AM, Gibson S, Hunty A, et al. Measurement of 25-hydroxyvitamin D in the clinical laboratory: current procedures,
performance characteristics and limitations. Steroids 2010; 75:
477-488.
Zaakceptowano do publikacji: 27.08.2012
Adres do korespondencji:
dr Zbigniew Bartoszewicz
Laboratorium Naukowe Katedry i Kliniki Chorób Wewnętrznych i
Endokrynologii
Warszawski Uniwersytet Medyczny
02-097 Warszawa, ul. Banacha 1a
tel.: +48 (22) 5991753, faks: +48 (22) 5991975
e-mail: [email protected]
302