2 h

PODSTAWY BIOTECHNOLOGII
NADPRODUKCJA KWASU CYTRYNOWEGO W KULTURACH Aspergillus niger
(2 h)
1. Przygotowanie podłoża
a) Podłoże melasowe
Przygotować 250 cm3 20% roztworu melasy z dodatkiem 0,06% K4Fe(CN)6 , 0,005%
kwasu fosforowego oraz 1% węgla aktywowanego. Odważoną ilość melasy rozpuścić w
wodzie wodociągowej i przed uzupełnieniem do 250 cm3 dodać odpowiednią ilość
żelazocyjanku potasu (rozpuszczonego wcześniej w wodzie) oraz pozostałe składniki. Całość
uzupełnić do kreski wodą wodociągową. Roztwór melasowy podzielić na dwie porcje po
100cm3. Jedną z nich zakwasić do pH 3,0 za pomocą kwasu siarkowego i przelać do kolby
Erlenmayera. Niezakwaszoną część (100 cm3) podłoża (o pH ok. 7,0) również przenieść do
kolby Erlenmayera .
Otrzymujemy w ten sposób 2 próby fermentacyjne zawierające po 100 cm3 20%
brzeczki melasowej. Kolby zakorkować i wyjałowić.
b) Podłoże syntetyczne
Przygotować 250 cm3 pożywki syntetycznej o składzie:
• Sacharoza (20%)
• NH4NO3 (0,3%)
• KH2PO4 (0,15%)
• MgSO4 (0,1%)
w wodzie destylowanej. Rozlać po 100 cm3 do dwóch kolb stożkowych, jedną kolbę z
podłożem zakwasić do pH 2,5.
Kolby zakorkować i wyjałowić.
c) 20% roztwór sacharozy
Przygotować 250 cm3 20% roztworu sacharozy w wodzie destylowanej, 100 cm3 zakwasić
do pH 3,0 i przelać przygotowane podłoża do kolb Erlenmayera .
Kolby zakorkować i wyjałowić.
d) Podłoże syntetyczne do hodowli wgłębnej
Przygotować 250 cm3 pożywki syntetycznej o składzie:
• 20% roztwór syropu maltozowego z dodatkiem:
• (NH4)2SO4 (0,2%)
• MgSO4 (0,02%)
• KH2PO4 (0,02%)
Rozlać po 100 cm3 do dwóch kolb stożkowych, jedną kolbę z podłożem zakwasić do pH 2,5.
Kolby zakorkować i wyjałowić.
Wymienione podłoża po ostudzeniu zaszczepić konidiami kwasotwórczego szczepu
Aspergillus niger w ilości 1 cm3 gęstej zawiesiny na 100 cm3 podłoża. Inkubować w
cieplarce w temp. 30 0C przez 7 dni.
2. Po okresie inkubacji ocenić wygląd makro- i mikroskopowy grzybni w
poszczególnych próbach.
3. Oznaczenie kwasowości ogólnej.
Kwasowość ogólna jest to suma wszystkich kwasów organicznych, jakie
tworzą się podczas fermentacji cytrynowej, wśród których najwięcej powstaje
kwasu cytrynowego (ponad 90%), reszta to głównie kwas szczawiowy i
glukonowy.
•
•
•
W celu oznaczenia kwasowości ogólnej należy pobrać 2 cm3 płynu pofermentacyjnego i
przenieść do kolby stożkowej na 200 cm3.
Dodać 20 cm3 wody destylowanej i miareczkować 0,1 N NaOH wobec fenoloftaleiny do
pierwszej trwałej zmiany zabarwienia.
Wynik podać w cm3 0,1 N NaOH /100 cm3 pożywki. Aktywna kultura powinna
wykazywać kwasowość ogólną odpowiadającą 30 – 40 cm3 0,1 N NaOH na 2 cm3
roztworu; wymagania normatywne mieszczą się w granicach 20 – 25 cm3 0,1 N NaOH na
2 cm3 roztworu).
Obserwacje, wyniki i wnioski należy przedstawić w formie sprawozdania
Literatura:
1. Gołębiowska J., Kaszubiak H., Pędziwilk Z., Kaczmarek W.: Ćwiczenia z
mikrobiologii, Poznań 2001.
2. Ilczuk Z.: Ćwiczenia z mikrobiologii przemysłowej, UMCS, Lublin, 1997.
3. Sobczak E.: Teoria i ćwiczenia z mikrobiologii ogólnej i technicznej, skrypt SGGW,
Warszawa, 1993.
4. Szostak – Kotowa J.: Ćwiczenia z mikrobiologii ogólnej i przemysłowej, Wyd.
Akademii Ekonomicznej w Krakowie, Kraków 2002.