Opracowanie metody oznaczania patuliny w soku jabłkowym

Ćwiczenie 4-­‐5 Opracowanie metody oznaczania patuliny w soku
jabłkowym
PRACOWNIA DYPLOMOWAIII ROK AGROCHEMII
Zakład Analizy Środowiska, Wydział Chemii, Uniwersytet
Gdański
1
I.
Wstęp teoretyczny
1. Mikotoksyny
Patulina zaliczana jest do jednych z najlepiej poznanych grup mikotoksyn. Zaliczane są one
do naturalnych zanieczyszczeń żywności i surowców wykorzystywanych do jej produkcji. Są
one silnie toksycznymi produktami wtórnego metabolizmu grzybów (pleśni) należących do
rodzajów: Aspergillus, Penicillinum i Fusarium. Tworzą się w okresie wegetacji lub zbioru, a
także w wyniku nieprawidłowego przechowywania licznych produktów żywnościowych.
Zanieczyszczenia mikotoksynami występują głównie w zbożu i jego przetworach, orzechach,
przyprawach, kukurydzy, kawie, kakao, herbacie, owocach suszonych, piwie, winie i mleku.
Patulina natomiast najczęściej wykrywana jest w jabłkach i soku jabłkowym, a w mniejszym
stopniu w owocach z objawami brązowej zgnilizny jak np. banany, ananasy, winogrona,
brzoskwinie, morele i pomidory czy w spleśniałych kompotach i soku gruszkowym.
Ze względu na zróżnicowany charakter toksycznego oddziaływania mikotoksyn na organizmy
wyższe podzielono je na 6 grup: aflatoksyny, ochratoksyna A, patulina, fumonizyny,
deoksyniwalenol i zearalenon. Najbardziej toksyczna spośród wszystkich rodzajów
mikotoksyn jest aflatoksyna B1 (Rys. 1).
patulina
Rysunek 1. Struktura chemiczna wybranych mikotoksyn
Mikotoksyny, które znajdują się w żywności mogą być powodem mikotoksykoz. Dlatego
żywność powinna być wytwarzana, transportowana i przechowywana w odpowiednich
warunkach, tak aby zabezpieczyć ją przed wilgocią oraz niekorzystną temperaturą. Efekt
toksyczny mikotoksyn zależy od rodzaju oraz ilości toksyny, która została spożyta wraz z
produktami żywnościowymi. Długotrwałe narażenie organizmu na mikotoksyny może
powodować różne przewlekłe choroby, np. nowotwory wątroby i nerek. Istnieją również ostre
zatrucia po pobraniu jednorazowo dużej dawki mikotoksyn.
2
Wiele mikotoksyn jest niewrażliwych na obróbkę cieplną, co sprawia że są one stabilne
podczas standardowych procesów przygotowania żywności i mogą pozostać w produkcie
długo nawet po zaniku pleśni. Z tych względów jak i także w związku z wszechobecnością
grzybów strzępkowych, skażenia tymi substancjami nie można całkowicie wyeliminować.
Stąd też konieczne jest z jednej strony przedsięwzięcie odpowiednich działań mających na
celu zapobieganie ich powstawaniu jak i także z drugiej strony monitorowanie ich
występowania w artykułach spożywczych.
Zapobieganie powstawania mikotoksyn polega na zapewnieniu odpowiednich warunków
produkcji pasz i żywności. Dodatkowo, w produkcji pasz stosowane są grzybobójcze środki
chemiczne. W zapobieganiu wytwarzania mikotoksyn biorą udział także naturalne
mechanizmy obronne roślin poprzez wytwarzanie związków antygrzybowych.
W chwili obecnej w Polsce obowiązuje rozporządzenie Komisji (WE) nr 1881/2006 z dnia
19.12.2006 r. ustalające najwyższe dopuszczalne poziomy niektórych zanieczyszczeń w
środkach spożywczych (Dz. Urz. WE L 364 z 20.12.2006).
2. Oznaczanie mikotoksyn w żywności
W oznaczaniu mikotoksyn bardzo ważny jest dobór odpowiedniej techniki izolacji i
wzbogacania analitu z badanych próbek żywności oraz techniki oznaczeń końcowych.
We współczesnej analizie śladowej mamy do czynienia z wykrywaniem substancji na
poziomie
ppm
i
ppb.
Aby
oznaczyć
tak
małe
ilości
substancji
chemicznych
w skomplikowanej matrycy, jaką są próbki żywności jak i środowiskowe, niezbędne jest
przygotowanie procedury składającej się z kilku etapów:
•
pobieranie próbki,
•
przechowywanie,
•
wstępne przygotowanie obejmujące wyodrębnienie od matrycy, zatężanie czy
przekształcanie analitu w postać bardziej trwałą lub dogodną dla końcowego
oznaczania,
•
analiza właściwa,
•
obróbka danych.
Większość metod analitycznych jest niedostatecznie czuła do bezpośredniego oznaczania
śladowych zanieczyszczeń. W większości stosowanych metod analitycznych używa się
próbek ciekłych co wymaga wprowadzenia częściowego lub całkowitego oddzielenia ich od
3
matrycy przed przystąpieniem do analizy właściwej. Takie czynności jak frakcjonowanie,
wydzielanie oznaczanych składników oraz ich zagęszczanie mają na celu wzbogacenie
(zatężenie) analitu powyżej granicy oznaczalności stosowanego układu analitycznego oraz
uproszczenie matrycy przez zastąpienie matrycy pierwotnej wybranym rozpuszczalnikiem lub
gazem. Uwalniamy w ten sposób analit od substancji interferujących w trakcie pomiaru. Przy
stosowaniu w analizie właściwej metod chromatograficznych upraszczanie matrycy ma
również na celu usunięcie z próbki składników silnie adsorbowanych na kolumnie
chromatograficznej, powodujących jej szybkie zużycie oraz substancji eluujących się powoli,
co znacznie wydłuża czas trwania rozdziału analitycznego a tym samym zwiększa zużycie
odczynników.
Do najczęściej stosowanych technik ekstrakcji należy zaliczyć technikę ekstrakcji w układzie
ciecz- ciecz (ang. Liquid – Liquid Extraction, LLE) oraz technikę ekstrakcji ciecz – ciało stałe
(ang. Solid Phase Extraction, SPE).
Natomiast na do ilościowej analizy mikotoksyn wykorzystuje się przede wszystkim techniki
chromatograficzne: chromatografię cienkowarstwową (TLC), chromatografię gazową (GC) i
wysokosprawną
chromatografię
radioimmunologiczne
i
cieczową
(HPLC)
immunoenzymatyczne.
Do
oraz
metody
analiz
immunologiczne:
jakościowych
często
wykorzystywana jest spektrometria mas i połączenia spektrometrii mas z chromatografią
gazową i cieczową.
3. Technika ekstrakcji w układzie ciecz-ciecz
Ekstrakcja rozpuszczalnikiem organicznym jest często stosowaną metodą izolacji śladowych
zanieczyszczeń z wody. Ekstrakcja w układzie ciecz-ciecz może być stosowana w
temperaturze pokojowej lub niższej przez co nadaje się do izolacji substancji nietrwałych. W
doborze rozpuszczalnika do ekstrakcji najważniejsza jest jego zdolność ekstrahowania danej
substancji w określonych warunkach. W ekstrakcji w układzie ciecz – ciecz o podziale
substancji między dwie fazy decyduje współczynnik podziału. Znajomość jego wartości
pozwala wybrać warunki ekstrakcji, jednostopniową (Kc>>1) lub wielostopniową, jeśli
wartość Kc jest znacznie mniejsza.
Podstawową niedogodnością ekstrakcji jest duże zużycie rozpuszczalnika co daje zbyt dużą
objętość ekstraktu w stosunku do potrzeb analizy. Ekstrakt trzeba zatężać przez odparowanie
rozpuszczalnika, co oprócz pracochłonności może być powodem strat analitu. Zatężony
rozpuszczalnik może być źródłem zanieczyszczeń próbki końcowej - minimalna obecność
4
interferenta w rozpuszczalniku (a istnieje niewiele substancji nierozpuszczalnych w
rozpuszczalnikach organicznych na poziomie ppb) powoduje po jego zatężeniu (np.
stukrotnym) pojawienie się sygnału mogącego zdecydowanie zmienić interpretację wyników
oznaczeń.
4. Technika ekstrakcji do fazy stałej
W celu uniknięcia lub zminimalizowania problemów powstających przy stosowaniu
ekstrakcji w układzie ciecz-ciecz opracowano metodę ekstrakcji w układzie ciecz -ciało stałe,
tzw. ekstrakcja do fazy stałej. Termin ekstrakcja do fazy stałej (Solid Phase Extraction,
SPE) oznacza
sposób izolowania analitu w układzie ciecz - ciało stałe oparty na
chromatografii przy użyciu zmodyfikowanych powierzchniowo materiałów krzemionkowych
czy polimerowych, podobnych do tych, które są szeroko stosowane w HPLC. Są to
adsorbenty takie jak żel krzemionkowy, florisil, tlenek glinowy, krzemionka modyfikowana
grupami alkilowym (np. C-18), fenylowymi, cyjanowymi, propyloaminowymi i in. lub fazy
stacjonarne stosowane w chromatografii jonowymiennej (SCX, SAX) czy różnego rodzaju
modyfikacje polimeru diwinylobenzenu (DVB).
Zasada rozdziału metodą SPE zalezy głównie od natury sorbentu. Siłami warunkującymi
oddziaływania między analitem a stałym adsorbentem polarnym (np. żel krzemionkowy,
tlenek glinu) są wiązania wodorowe, oddziaływania dipol-dipol, dipol indukowany-dipol oraz
siły dyspersyjne (van der Waalsa). Ten typ ekstrakcji oparty jest na takich samych zasadach
jak chromatografia adsorpcyjna. Gdy zastosowanym sorbentem jest krzemionka z chemicznie
związaną grupą polarną, np. aminową (układ faz normalnych) lub niepolarną, np.
oktadecylową (układ faz odwróconych) zasada rozdziału jest taka, jak w chromatografii
podziałowej. Należy pamiętać, że w każdym rodzaju chromatografii istnieje możliwość
różnych oddziaływań między grupami funkcyjnymi analitu a powierzchnią sorbentu i mimo,
że mechanizm rozdziału na fazach związanych jest podziałowy, w rzeczywistości przebiega w
dużym stopniu przy udziale procesów adsorpcyjnych.
Celem rozdziału metodą SPE jest przygotowanie próbki do analizy właściwej czyli
wyizolowanie analitu z matrycy w maksymalnie czystej i skoncentrowanej postaci. Może być
to osiągnięte na dwa sposoby: można wyeluować analit, podczas gdy zanieczyszczenia są
zatrzymywane lub odwrotnie, żądany analit jest zatrzymywany na kolumnie, podczas gdy
zanieczyszczenia są usuwane z kolumny. Ekstrakcja do fazy stałej zachodzi tylko wówczas,
gdy wiązanie pomiędzy sorbentem a analitem jest silniejsze niż oddziaływanie wywierane
przez rozpuszczalnik lub matrycę próbki. Anality zatrzymane na złożu można odzyskiwać
5
przez mineralizację złoża, ekstrakcję rozpuszczalnikami organicznymi i rozdział przy użyciu
metod chromatograficznych czy desorpcję termiczną. Do najczęstszych metod należy jednak
ekstrakcja rozpuszczalnikami organicznymi. W procesie wymywania eluent musi posiadać
silniejsze powinowactwo do analitu niż sorbent. Zwykle stosuje się: metanol, aceton,
izopropanol, dichlorometan, pentan, mieszaniny tych rozpuszczalników.
Należy pamiętać, że stosowane w kolumienkach SPE fazy stacjonarne wykonane na bazie
materiałów krzemionkowych są stabilne w zakresie pH 2-7,5; powyżej tej wartości żel
krzemionkowy może się rozpuścić a poniżej mogą ulec hydrolizie wiązania między grupami
silanolowymi a podstawnikami modyfikującymi żel krzemionkowy.
Chemicznie związane fazy stacjonarne posiadają znaczną (od 1 do 5% masy sorbentu)
zdolność umiarkowanie selektywnego wychwytu różnorodnych substancji, co umożliwia
zminiaturyzowanie procesu ekstrakcji. W praktyce używa się najczęściej komercyjnie
przygotowane szklane lub polipropylenowe kolumienki zawierające od 100 mg do 2 g
sorbentu zawartego między dwoma porowatymi filtrami oraz system próżniowy ze statywem
na odbieralniki, manometrem kontrolnym i zaworem regulującym (Rys. 2). Ponadto w skład
systemu wchodzą złącza i zawory umożliwiające łączenie kilku kolumienek tej samej lub
różnej wielkości. Ziarna wypełnienia w kolumienkach SPE mają średnicę 40 µm (większą niż
stosowane w HPLC) a także nieregularny kształt, co umożliwia szybki przepływ fazy
ruchomej.
Rys. 2. Schemat rozdziału na pojedynczej kolumience SPE (A) i zestawie podłączonym
do próżni (B).
6
Ekstrakcja do fazy stałej obejmuje kilka niezbędnych etapów (Rys. 3).
•
Pierwszy etap to przemycie kolumienki wraz z wypełnieniem rozpuszczalnikami
mającymi wartość eluotropową większą niż stosowane eluenty. Usuwa się w ten
sposób substancje (alkeny C16-C24, alkiloftalany, alkany, silanole, siloksany), które
mogą się wyekstrahować z gotowych kolumienek, a ilość ich zależy od producenta.
Objętość rozpuszczalników służących do przemywania kolumienek należy ustalić
doświadczalnie, najczęściej zaleca się wstępne przemywanie rozpuszczalnikami
stosowanymi do elucji w objętości 5-10 razy większej od masy wypełnienia.
•
Następnym etapem jest kondycjonowanie wypełnienia kolumienki (złoża sorbentu),
polegające na przygotowaniu powierzchni sorbentu do efektywnej izolacji i
wzbogacania analitów z wody. Żel krzemionkowy modyfikowany fazą oktadecylową
ma własności lipofilowe (fazy RP nie są zwilżane wodą), dlatego złoże najpierw
przemywa się metanolem lub 2-propanolem a następnie mieszaniną wody i 2propanolu. Do kondycjonowania stosuje się zwykle 5–10 objętości pustych używanej
kolumienki (1 objętość pusta = 1,0–1,2 µl/mg sorbentu). W trakcie kondycjonowania
łańcuchy węglowodorowe ulegają wyprostowaniu oddalając się od powierzchni
sorbentu, tworząc tzw. “szczotkę” o znacznie powiększonej powierzchni aktywnej.
Ważne jest użycie do kondycjonowania rozpuszczalnika o właściwościach najbardziej
zbliżonych do właściwości matrycy badanej próbki (wody dejonizowanej dla próbek
wodnych) oraz utrzymywanie sorbentu w pełni pokrytego rozpuszczalnikiem do
momentu naniesienia próbki (zawsze pierwszą porcję rozpuszczalnika wprowadza się
bez użycia podciśnienia, pozwalając jej “wsiąknąć” w złoże).
•
Kolejnym etapem jest naniesienie na kolumienkę próbki. Jeśli próbka zawiera
zawiesinę, przed naniesieniem należy ją odwirować lub przesączyć, aby uniknąć
zatkania filtru wlotowego kolumienki. Roztwory wodne zawierające analit
przepuszcza się przez kolumienkę z szybkością 1–25 cm3/min przy stosowaniu
odpowiedniego podciśnienia (pompka wodna) lub nadciśnienia (sprężony gaz
obojętny).
•
Następny etap obejmuje usunięcie z przestrzeni między cząstkami sorbentu oraz z
wnętrza jego porów substancji niezwiązanych przez przemycie czystym
rozpuszczalnikiem, w którym znajdował się analit. Można zastosować inne
rozpuszczalniki, o sile eluotropowej większej, jeśli nie spowodują wymycia analitu. W
ten sposób usuwa się ewentualne interferenty pochodzące z matrycy, co zwiększa
7
czystość frakcji analizowanej. Resztki rozpuszczalnika przemywającego usuwa się
przez suszenie strumieniem powietrza (zasysanym przez pompkę wodną). Czas
suszenia zależy od lotności rozpuszczalnika i masy sorbentu i wynosi od 1–20 minut.
•
Ostatnim etapem jest wymycie zatrzymanych na kolumience analitów małą porcją
(zależna od wielkości złoża, zwykle 300 -500 µL) odpowiedniego rozpuszczalnika.
Rys. 3. Etapy pracy techniką SPE
Kolumienki SPE mają następujące zalety:
•
szybkość - kilkukrotnie większa niż w układzie ciecz -ciecz,
•
odtwarzalność - duża, dzięki zmniejszeniu ilości manipulacji z próbką,
•
ekonomiczność – zmniejszone zużycie szkła, odczynników i nakładu pracy,
możliwość wielokrotnego użycia sorbentu, prostota wyposażenia,
•
bezpieczeństwo – znacznie zwiększone na skutek mniejszego zużycia łatwopalnych
rozpuszczalników.
Niestety metoda ta posiada też wady, a do najistotniejszym możemy zaliczyć:
•
tło pozostawione przez użyty rozpuszczalnik,
•
zatykanie złoża poprzez zawiesiny obecne w próbce,
•
czasami słaba odtwarzalność spowodowana różnicami między kolejnymi partiami
sorbentu.
II.
Cel ćwiczenia
Celem ćwiczenia jest porównanie dwóch metod oznaczania patuliny w soku jabłokowym z
wykorzystaniem techniki wysokosprawnej chromatografii cieczowej do oznaczeń końcowych.
Celem ćwiczenia jest także zapoznanie studentów z techniką ekstrakcji w układzie ciecz-ciecz
oraz techniką ekstrakcji SPE, jako podstawowych metod przygotowania próbek ciekłych do
analizy.
8
III.
Wykonanie ćwiczenia
Studenci pracować będą w dwóch grupach. Każda z grup przygotuje próbki soku jabłkowego
do oznaczenia końcowego zgodnie z dwiema opisanymi poniżej procedurami A i B.
Następnie (kolejnym tygodniu) przygotowane ekstrakty zostaną poddane analizie z
wykorzystaniem techniki HPLC-UV w układzie faz odwróconych, metodą krzywej
kalibracyjnej. Na tej podstawie wyznaczony zostanie odzysk analitu z próbek (zgodnie z
równaniem 1), co stanowić będzie podstawię do wybrania najbardziej odpowiedniej metody
oznaczania patuliny w soku jabłkowym.
Odzysk =[(stężenie patuliny w otrzymanym ekstrakcie)/
stężenie patuliny w ekstrakcie przy założeniu 100% odzysku] *100 %
(1)
Przygotowanie próbek do analiz
Każda z grup przygotowuje dwie próbki soku jabłkowego.
W tym celu sok, jeśli nie jest klarowny, należy odwirować przez 10 min, 4000 rpm. Następnie
przygotować po dwie 5 ml próbki soku i postępować zgodnie z opisem przedstawionym
poniżej:
PROCEDURA A
1. Do 5 ml próbki soku należy dodać 10 ml octanu etylu i wytrząsać intensywnie przez 1
min, wykorzystując to tego celu wytrząsarkę vortex; warstwę organiczną przenieść do
kolby sercówki i proces ekstrakcji powtórzyć.
2. Do połączonych ekstraktów dodać 2 ml wodnego 1,5 % roztworu węglanu sodu i
wytrząsać przez 1 min.
3. Poczekać na oddzielenie się faz, a następnie warstwę organiczną przenieść do innej
kolby. Pozostałą w kolbie warstwę wodną ponownie ekstrahować 5 ml octanu etylu
poprzez intensywne wytrząsanie przez 1 min.
4. Zebrane ekstrakty należy osuszyć poprzez dodanie 2,5 g bezwodnego siarczanu sodu.
5. Ekstrakt przesączyć do kolby sercówki i zatężyć ekstrakt do obj. ok. 0,5 ml.
6. Przenieść do naczynka chromatograficznego i pod delikatnym strumieniem azotu
odparować do sucha.
7. Tak przygotowany ekstrakt można przechowywać w zamrażalniku do czasu analiz.
9
PROCEDURA B
1. Należy przygotować kolumienkę SPE typu OASIS HLB (firmy Waters S.A.) do
izolacji i wzbogacania patuliny z soku jabłkowego. W tym celu należy nie dopuścić do
wysuszenia złoża i wszelkie czynności wykonywać sprawnie. W pierwszej kolejności
należy przemyć złoże 5 ml metanolu.
2. W celu przygotowania złoża efektywnej izolacji analitów należy nanieść na
kolumienkę 5 ml wody.
3. W dalszej części nanosimy na złoże 5 ml soku jabłkowego.
4. Gdy próbka całkowicie wniknęła w złoże, kolumienkę należy przemyć 1 ml 1 %
roztworu wodorowęglanu sodu, a następnie 1 ml 1 % kwasu octowego.
5. Po tym zabiegu włączyć pompę wodną i poczekać 10 min celem wysuszenia zloża.
6. Kolumienkę należy umieścić nad naczynkiem chromatograficznym o objętości 4 ml i
nanieść na nią 3 ml mieszaniny acetonitryl: eter dietylowy (2+98) w celu wyeluowania
patuliny ze złoża.
7. Zebrany ekstrakt należy odparować pod strumieniem azotu do sucha i następnie
przechowywać w zamrażalniku do czasu analizy.
Analizy uzyskanych ekstraktów (kolejne ćwiczenia)
Pomiary wykonane zostaną za pomocą techniki HPLC-UV.
Warunki analiz chromatograficznych:
●
oktadecylowa faza stacjonarna – C18
●
detektor UV, długość fali – 276 nm
●
faza ruchoma - ACN:woda zakwaszona kwasem octowym do pH 3,5 (10:90, v/v)
●
natężenie strumenie przepływu fazy ruchomej – 0,7 ml/min
●
objętość dozowanej próbki - 50 µl
Każda z grup zanim przystąpi do analizy przygotowanych wcześniej ekstraktów musi:
1. Przygotować rozwory wzorcowe patuliny w mieszaninie rozpuszczalników
odpowiadającym składowi fazy ruchomej o stężeniu:
5 ml/l;
2 mg/l;
1 mg/l;
0,5 mg/l;
0,25 mg/l;
Roztwory te należy przygotować w naczynkach chromatograficznych o objętości 2 ml,
wychodząc z roztworu wyjściowego patuliny o stężeniu 25 mg/l.
10
Tak przygotowane roztwory należy poddać dwukrotnej analizie HPLC-UV. Na podstawie
uzyskanych wyników należy sporządzić wykres krzywej kalibracyjnej.
2. Przygotować ekstrakty do analizy poprzez rozpuszczenie suchej pozostałości w 250 ul
fazy ruchomej.
3. Tak przygotowane ekstrakty należy poddać 3-krotnej analizie HPLC-UV
4. Ostatecznie należy wyznaczyć odzysk patuliny w obu przetestowanych procedurach
zgodnie z równaniem (1) oraz ocenić, która z nich jest bardziej wydajna.
Literatura:
Kumirska J. i wspołpr., Skrypt elektroniczny „Analiza żywności”, Gdańsk 2011.
Stepnowski P. I współpr.., Skrypt elektroniczny „Techniki separacyjne”, Gdańsk 2011.
Trucksess M.W., Tang Y., Solid-Phase Extraction Method for Patulin in Apple Juice and
Unfiltered Apple Juice, Journal of AOAC International, 82, 1999, 1109-1114.
Gashlan H. M., High performance liquid chromatographic determination of patulin in apple
juice: Investigation of its contamination levels in Saudi Arabia, Scientific Research and
Essay, 4, 2009, 69-72.
ZAKRES WYMAGANYCH WIADOMOŚCI
Podstawowe pojęcia z wysokosprawnej chromatografii cieczowej oraz analizy
miareczkowej.
11