Obserwacje nad hepatoprotekcyjnym wpływem ekstraktu DNA z

/BSERWACJE NAD HEPATOPROTEKCYJNYM WPŒYWEM EKSTRAKTU $.!
ZCZERWIUPSZCZELEGO
/BSERVATIONSOFTHEHEPATOPROTECTIVEUSEOFEXTRACT
FROM$.!BEELARVAE
-GR-AGDALENA7YSZYÊSKA
$RNMED!GATA+ABAŒA†$ZIK
0ROFDRHABNMED%WA3ZAFLARSKA†3TOJKO
$RNPRZYR"ARBARA3TAWIARSKA†0IÃTA
+ATEDRAI:AKŒAD0ATOLOGII7YDZIAŒ&ARMACEUTYCZNYZ/DDZIAŒEM-EDYCYNY,ABORATORYJNEJ
gL’SKI5NIWERSYTET-EDYCZNYW+ATOWICACH
+IEROWNIK0ROFDRHABNMED%WA3ZAFLARSKA†3TOJKO
Abstrakt
Tematem badań była ocena właściwości osłonowych
DNA czerwiu pszczelego. W doświadczeniu użyto
wzorcowych, rekomendowanych przez WHO substancji hepatotoksycznych: kwasu acetylosalicylowego, busereliny oraz czterochlorku węgla.
Badanie przeprowadzono na ciężarnych samicach szczurzych rasy Wistar w wieku około trzech miesięcy, którym podawano dootrzewnowo buserelinę i czerochlorek
węgla oraz sondą żołądkową kwas acetylosalicylowy.
Po 21 dniach zwierzęta usypiano i pobierano wątroby
do oceny histopatologicznej. Materiał utrwalany był
w płynie Bouina, następnie zatapiany w bloczkach parafinowych, z których wykonano preparaty barwione
hematoksyliną i eozyną. Uzyskane wyniki wskazują, że
ekstrakt DNA czerwiu pszczelego wykazuje działanie
osłonowe w stosunku do miąższu wątroby narażonej na
hepatotoksyny.
Słowa kluczowe: hepatotoksyczność, czerw pszczeli,
DNA.
'˜ ւ
Wątroba jest głównym narządem, zdolnym do przeprowadzania biotransformacji ksenobiotyków, czyli ich przemiany w rozpuszczalne w wodzie produkty, które mogą być
usuwane z organizmu. Narażenie na toksyczne działanie
wielu ksenobiotyków powoduje jej uszkodzenia strukturalne i funkcjonalne. Hepatotoksyny mogą reagować z podstawowymi składnikami komórkowymi – białkami, lipidami,
RNA i DNA oraz indukować szereg niekorzystnych zmian,
manifestujących się najczęściej stłuszczeniem. Czynniki odpowiedzialne za uszkodzenia wywołują szereg reakcji, które
mogą być analizowane na poziomie tkankowym, komórkowym i molekularnym [1,2,3,4].
COPYRIGHT‚'RUPA$R!2+WIECIÊSKIEGO
)33.†
Abstract
The subject of researches was a qualification of protective functions DNA bee larvae. The aim of the study
was used standard, recommended by the WHO, the
toxic substances – acetylaslicylid acid, busereline and
carbon tetrachloride.
The researches were conducted on Wistar females rats
in age 3 months which the busereline and carbon tetrachloride was injected through peritoneum way and per
os, with using stomachic probe of the acetylsalicylid
acid. After 21 days the animals were limited and the
segments of their livers were examined during histopathological investigations. The segments were fixed in
the Bouin’s liquid, then put into the paraffin sank, and
the obtained preparations were coloured experienced
with the hematoxyline and eozine. The obtained results
allowed, that DNA bee larvae extract have protective
role in relation to liver parenchyma exposed on activities of hepatotoxines.
Key words: hepatotoxicity, bee larvae, DNA.
Powszechność występowania toksyn środowiskowych
powoduje ciągły wzrost zachorowań na schorzenia wynikające z ich niekorzystnego wpływu na organizm. W związku
z powyższym zasadne jest poszukiwanie substancji leczniczych, które pozbawione efektów ubocznych wykażą działanie osłonowe w stosunku do płodu i organizmu matki.
Początek XXI wieku jest okresem znacznego rozwoju
biotechnologii i biologii molekularnej, w którym dużym
zainteresowaniem objęto leki pochodzenia biogennego. Zaliczamy do nich apiterapeutyki, czyli biopreparaty otrzymywane z produktów wydzielonych lub przetworzonych przez
pszczoły. Produkty takie powstałe na drodze biosyntezy zawierają szereg substancji aktywnych farmakologicznie. Po
odpowiednim wyizolowaniu i standaryzacji stają się lekiem.
&ARMACEUTYCZNY
0RZEGL’D.AUKOWY
–Ÿ`ŸžŸ¤°°U
Produkty pszczele dzięki zawartości związków pochodzenia
roślinnego i zwierzęcego wykazują dużą aktywność biologiczną w stosunku do organizmu człowieka. Mają udokumentowane działanie przeciwdrobnoustrojowe, regeneracyjne, znieczulające oraz detoksykacyjne. Wykazują także
zdolność stymulowania metabolizmu komórkowego i układowego oraz układu immunologicznego. Oprócz wartości
odżywczych wykazują działanie biotyczne w stosunku do
organizmu człowieka. Podane właściwości wynikają chemicznego ich składu chemicznego [5].
Analiza właściwości ekstraktów z czerwiu pszczelego
jest nowym kierunkiem badań w apiterapii zasługującym
na szczególną uwagę, z racji możliwości zastosowania
w nowoczesnej terapii z wykorzystaniem DNA opartej na
związkach blokujących białka, które uczestniczą w rozwoju
różnorodnych zmian patologicznych. Hepatotoksyny i embriotoksyny działają na różnym poziomie, w tym molekularnym, stąd zasadnym jest próba osłonowego zastosowania
DNA larw pszczół, jako czynnika niwelującego lub znoszącego nieporządane działanie toksyn, w tym niektórych leków [6].
Celem pracy była ocena osłonowego działania DNA
w stosunku do miąższu wątroby narażonego na działanie
substancji hepatotoksycznych.
- R–l-tŸlŸuR |J¬Ÿ
Eksperyment przeprowadzono w Centrum Medycyny
Doświadczalnej Śląskiego Uniwersytetu Medycznego po
uprzednim uzyskaniu zgody Uczelnianej Komisji Etyki ds.
Doświadczeń na Zwierzętach. Badania prowadzone były
w Katedrze i Zakładzie Patologii Wydziału Farmaceutycznego z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej Śląskiego
Uniwersytetu Medycznego.
Materiał doświadczalny stanowiło 100 ciężarnych samic
szczurów szczepu Wistar. Dobór zwierząt determinowany
był ich dojrzałością płciową i fizyczną oraz przydatnością
do rozrodu hodowlanego. Szczury o wadze 170g ± 20g osiągały wiek około 80-100 dni.
Ciężarne samice podzielono na trzy podstawowe grupy
– kontrolną K oraz dwie grupy badane: A i B.
1. Grupa kontrolna K – składała się z 40 samic i wydzielono w niej cztery podgrupy po 10 samic:
K1 – ciężarne samice, którym przebieg ciąży nie był zakłócany;
K2 – ciężarne samice, którym podano dootrzewnowo
50μg DNA z czerwiu pszczelego jednorazowo w 3 dniu
trwania ciąży, aby ocenić jego wpływ na przebieg ciąży;
K3 – ciężarne samice otrzymujące sól fizjologiczną sondą żołądkową w 4, 10 i 14 dniu trwania ciąży, aby wykazać
wpływ takiej ingerencji na przebieg ciąży;
K4 – ciężarne samice otrzymujące sól fizjologiczną w iniekcji dootrzewnowej w 4, 10 i 14 dniu trwania ciąży, aby
ocenić wpływ tej ingerencji na przebieg ciąży.
2. Grupa badana A – składała się z 30 samic i została podzielona na trzy podgrupy po 10 samic. Zwierzętom podawane były środki hepatotoksyczne i embriotoksyczne w 4,
10 i 14 dniu trwania ciąży:
&ARMACEUTYCZNY
0RZEGL’D.AUKOWY
A1 – ciężarne samice otrzymujące kwas acetylosalicylowy sondą żołądkową w dawce 180mg/kg masy ciała;
A2 – ciężarne samice otrzymujące buserelinę w iniekcji
dootrzewnowej w dawce 23ng na osobnika;
A3 – ciężarne samice otrzymujące czterochlorek węgla
w iniekcji dootrzewnowej w dawce 5mg/kg masy ciała.
3. Grupa badana B – składała się z 30 samic i została
podzielona na trzy podgrupy po 10 samic, którym oprócz
związków hepatotoksycznych i embriotoksycznych podawanych w 4, 10 i 14 dniu trwania ciąży, w 3 dniu jednorazowo wstrzyknięto dootrzewnowo DNA z czerwiu pszczelego:
B1 – ciężarne samice otrzymujące kwas acetylosalicylowy sondą żołądkową w dawce 180mg/kg masy ciała oraz
DNA z czerwiu pszczelego w ilości 50μg;
B2 – ciężarne samice otrzymujące buserelinę w iniekcji dootrzewnowej w dawce 23ng na osobnika oraz DNA
z czerwiu pszczelego w ilości 50μg;
B3 – ciężarne samice otrzymujące czterochlorek węgla
w iniekcji dootrzewnowej w dawce 5mg/kg masy ciała oraz
DNA z czerwiu pszczelego w ilości 50μg.
W 21 dniu ciąży, przed planowanym rozwiązaniem zwierzęta uśpiono i poddano sekcji. Do oceny histopatologicznej pobierano wątroby matek. Materiał do badań utrwalano
w formalinie, następnie zatapiano w parafinie, a z otrzymanych bloczków parafinowych wykonano preparaty histopatologiczne, które były barwione rutynowo hematoksyliną
i eozyną.
'¬ylplŸlŸlAiŸ|u}ªlRylR
W grupie kontrolnej we wszystkich podgrupach miąższ
wątroby matek nie wykazuje zmian patologicznych. Zraziki
wątroby wykazują zwarty układ beleczek hepatocytów. Zarówno ściana, jak i okolice żyły centralnej wykazują prawidłowy obraz mikroskopowy. W pojedynczych przypadkach
obserwuje się przekrwienie miąższu wątroby niewielkiego
stopnia.
W podgrupie A1, w której zastosowano kwas acetylosalicylowy grupy w miąższu wątrób stwierdzono nacieki
zapalne w postaci ognisk oraz licznych rozsianych komórek limfoidalnych, szczególnie w okolicach żył centralnych
i przestrzeni bramnożółciowych. Ponadto widoczne było
rozluźnienie histostruktury tego narządu oraz przekrwienie
średniego stopnia. W jednym przypadku zaobserwowano
nieliczne hepatocyty o cechach zwyrodnienia tłuszczowego,
a także pojedyncze komórki miąższu ulegające martwicy.
W podgrupie A2, gdzie zastosowano buserelinę, obserwowano przekrwienie miąższu wątroby niewielkiego stopnia
oraz nieliczne figury podziałów komórkowych. Pojedyncze
hepatocyty wykazywały cechy zwyrodnienia wodniczkowego. Widoczne były ponadto nacieki zapalne szczególnie
w okolicach triad wątrobowych.
U zwierząt podgrupy A3, w której zastosowano czterochlorek węgla widoczne są cechy znacznego uszkodzenia
miąższu wątrobowego. Obecne są liczne hepatocyty z cechami stłuszczenia. Ponadto obecne są skupiska komórek
limfoidalnych wokół rozrośniętych przewodów triad wątroCOPYRIGHT‚'RUPA$R!2+WIECIÊSKIEGO
)33.†
–Ÿ`ŸžŸ¤°°U
bowych, których komórki nabłonka są nadbarwliwe. Komórki w okolicach przestrzeni bramnożółciowych ulegają
martwicy.
W grupie doświadczalnej B, gdzie oprócz związków
o działaniu embriotoksycznym i hepatotoksycznym podawano osłonowo DNA czerwiu pszczelego, u zwierząt
podgrupy B1 (kwas acetylosalicylowy oraz DNA czerwiu
pszczelego), stwierdzono prawidłową histostrukturę wątroby oraz ulegające podziałowi hepatocyty. Pomiędzy beleczkami hepatocytów widoczne były nieliczne rozsiane
komórki limfoidalne. U dwóch samic widoczne były zmiany zwyrodnieniowe nielicznych hepatocytów o charakterze
stłuszczenia.
W podgrupie B2 (buserelina i DNA czerwiu pszczelego),
obraz mikroskopowy wątrób badanych zwierząt nie wykazuje zmian patologicznych. Charakterystyczną cechą świadczącą o procesach naprawczych tego gruczołu, są widoczne
hepatocyty ulegające podziałowi mitotycznemu.
W obrazie mikroskopowym wątrób zwierząt podgrupy
B3, którym podawano czterochlorek węgla i DNA czerwiu
pszczelego widoczne jest wyraźne rozluźnienie histostruktury miąższu. Hepatocyty nie wykazują zmian o charakterze
zwyrodnienia, stłuszczenie dotyczyło nielicznych komórek
w okolicach żył centralnych zrazików wątrobowych. Zauważalne także były komórki w fazie podziału mitotycznego. Mało zaznaczone są również zmiany zapalne.
Biorąc pod uwagę zmiany zaobserwowane we wszystkich grupach, wyraźny jest osłonowy wpływ zastosowanego
ekstraktu DNA z czerwiu pszczelego. W grupie kontrolnej
K nie stwierdzono patologicznych miąższu wątroby żadnych zmian patologicznych. Najbardziej nasilone zmiany
dotyczyły grupy badanej A. Najsilniejsze działanie hepatotoksyczne wykazał czterochlorek węgla, który wywołał
znaczne uszkodzenia miąższu wątroby – stłuszczenie i martwica hepatocytów, nacieki zapalne wokół naczyń zraziła.
Zmiany o mniejszym nasileniu wystąpiły po zastosowaniu
kwasu acetylosalicylowego oraz busereliny.
Zastosowany ekstrakt DNA z czerwiu pszczelego wykazał wyraźne działanie osłonowe w stosunku do wątroby,
COPYRIGHT‚'RUPA$R!2+WIECIÊSKIEGO
)33.†
najsilniejsze w przypadku narażenia na buserelinę i kwas
acetylosalicylowy. W przypadku narażenia na silne hepatotoksyny (czterochlorek węgla), nie niweluje zupełnie zmian
morfologicznych w obrębie wątroby, jednak powoduje wyraźne osłabienie uszkadzającego działania toksyny.
'yl|˜pl
1. Zastosowany ekstrakt DNA z czerwiu pszczelego nie
powoduje negatywnego wpływu na obraz morfologiczny wątroby szczura.
2. Wykazuje działanie osłonowe przy narażeniu na działanie trucizn o różnym potencjale hepatotoksycznym.
l²ulRyylA ª|
1. Weber L.W., Boll M., Stampfl A. Hepatotoxicity and
mechanism of action of haloalkanes: carbon tetrachloride as a toxicological model. Crit Rev Toxicol.2003;
33:105-36.
2. Becker E., Messner B., Bernt J. Two mechanisms of
CCL4-induced fatty liver: lipid peroxidation or covalent
binding studied in cultured hepatocytes. Free Radic Res
Commun 1987; 3:299-308.
3. Espiridiao S, Oliviera-Filho RM, Simoes MJ, Mamede
JA, Kulay L. Liver and kidney ultrastructural changes
caused by acetylsalicylic acid treatment during pregnancy in rats. Clin Exp Obstet Gynecol 2002; 29(1):37-9.
4. Sanzgiri U.Y., Srivatsan V., Muralidhara S., Dallas C.E.,
Bruckner J.V. Uptake, distributon and elimination of
carbon tetrachloride in rat tissues following inhalation
and ingestion exposures. Toxicol Appl Pharmacol 1997;
143:120-9.
5. Stojko A. Leczenie produktami pszczelimi (apiterapia).
[W]: Janicki K, Rewerski W. Medycyna naturalna. Wydawnictwo Lekarskie PZWL 2001, 105-113.
6. Wu J., Danielsson A., Zern M.A. Toxicity and hepatotoxins: New insights into mechanism and therapy. Expert
Opin Investig Drugs 1999; 8:585-607.
&ARMACEUTYCZNY
0RZEGL’D.AUKOWY