OZNACZANIE 2-FENOKSYETANOLU W KREMIE DO RĄK METODĄ

OZNACZANIE 2-FENOKSYETANOLU W KREMIE DO RĄK METODĄ
WYSOKOSPRAWNEJ CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ
Z WYKORZYSTANIEM METODY WZORCA WEWNĘTRZNEGO
Alkohole
Właściwości niszczenia drobnoustrojów wykazują głównie alkohole jednowodorotlenowe. Mechanizm
biologicznego działania alkoholi jest związany z procesem dehydratacji protein, co prowadzi do zmiany IIrzędowej struktury białek i upośledzenia ich funkcji. Należy podkreślić, że alkohole mają zdolność niszczenia
wegetatywnych form drobnoustrojów oraz znacznej części wirusów, nie działają jednak na ich formy
przetrwalnikowe. W przypadkach skaleczeń obserwuje się natomiast w obrębie rany strącanie się protein, które
tworzą warstewkę ochronną przeciw mikroorganizmom, co dodatkowo zwiększa efektywność przeciwbakteryjnego
działania alkoholi. Z powyższych względów w kosmetykach bardzo często wykorzystuje się różnego rodzaju
alkohole jednowodorotlenowe. Do najpowszechniej spotykanych w produktach kosmetycznych związków należą
etanol i 2-fenoksyetanol.
2-fenoksyetanol znany jest głównie jako środek konserwujący powszechnie stosowany w produktach
kosmetycznych najczęściej używany jest w kombinacji z innymi związkami o działaniu przeciwdrobnoustrojowym (produkty do makijażu oczu, zapachy, róże, podkłady i bazy pod makijaż, szminki, mydła,
produkty dla dzieci, produkty do opalania, pudry do twarzy, ciała i stóp). Wykazuje działanie antyseptyczne i
przeciwbakteryjne dzięki czemu przedłuża okres trwałości kosmetyków. Dodatkowo pełni funkcję składnika
aktywnego w dezodorantach i repellentu w środkach odstraszających na owady. Ze względu na możliwość
wystąpienia reakcji alergicznej ilość stosowanego 2-fenoksyetanolu w kosmetykach jest ściśle kontrolowana, a
dopuszczalne stężenie omawianego związku w tego typu produktach wynosi 1% [1,2]. Celem tego ćwiczenia jest
oznaczenie 2-fenoksyetanolu w wybranym kremie do pielęgnacji rąk.
Literatura:
1. Malinka W. Zarys chemii kosmetycznej, VOLUMED, Wrocław 1999.
2. Dyrektywa Rady 76/768/EEC z dnia 27 lipca 1976.
METODA WZORCA WEWNĘTRZNEGO
Jest to metoda polegająca na dodaniu do próbki znanej ilości składnika, tzw. wzorca wewnętrznego (IST), który
jest jednak inny od substancji oznaczanych i nie może być obecny w analizowanych próbkach przed jego
dodaniem. W celu uzyskania krzywej kalibracyjnej do kilku roztworów wzorcowych o różnych stężeniach
substancji oznaczanej dodaje się najczęściej stałą i znaną ilość wzorca wewnętrznego. Na podstawie uzyskanych
chromatogramów roztworów wzorcowych wykreśla się zależność stężenia analitu w funkcji stosunku powierzchni
piku analitu i wzorca wewnętrznego.
Na rysunku 1 przedstawiono krzywą kalibracyjną dla substancji oznaczanej metodą wzorca wewnętrznego.
W celu oznaczenia zawartości substancji metodą wzorca wewnętrznego w próbce badanej (o znanej masie lub
objętości), dodaje się do niej znaną ilość wzorca wewnętrznego. Następnie z zarejestrowanego chromatogramu
oblicza się stosunek powierzchni piku analitu i wzorca wewnętrznego.
Rys. 1. Wykres krzywej kalibracyjnej otrzymanej przy zastosowaniu techniki wzorca wewnętrznego.
1
Zawartość substancji wyznacza się metodą graficznej interpolacji, oblicza z równania krzywej kalibracyjnej lub z
wykorzystaniem zależności (1) i (2) w sytuacji, kiedy krzywa kalibracyjna jest zależnością liniową typu f(x) = ax:
Cx 
Ax / AIST
Rf
(1)
Rf 
Ai / AIST
Ci
(2)
gdzie: Cx - oznaczona zawartość, Ax - powierzchnia piku analitu, AIST - powierzchnia piku wzorca wewnętrznego, Rf
- współczynnik odpowiedzi, Ai, AIST(i)- powierzchnia piku analitu i wzorca wewnętrznego w roztworze
kalibracyjnym, ci - stężenie analitu w roztworze kalibracyjnym. Na rysunku 2 przedstawiono chromatogram
mieszaniny wzorcowej substancji oznaczanych oraz wzorca wewnętrznego.
Rys. 2. Chromatogram mieszaniny substancji oznaczanych A, B, C, D oraz wzorca wewnętrznego (IST).
Wzorzec wewnętrzny powinien spełniać następujące wymagania:
 musi być rozdzielony od innych składników występujących w próbce
 czas retencji powinien być zbliżony do czasu retencji analitu(ów)
 nie występuje w próbkach pierwotnych
 właściwości fizyko-chemiczne są podobne do analitu. Jest to szczególnie istotne na etapie przygotowania
próbek (oczyszczania, wzbogacania czy derywatyzacji)
 powinien być możliwie wysokiej czystości
 stabilny chemicznie
 odpowiedź detektora dla wzorca wewnętrznego powinna być zbliżona do odpowiedzi substancji
oznaczanych
Metoda ta ma zastosowanie szczególnie w przypadku metod analitycznych wymagających złożonej, wieloetapowej
procedury przygotowania próbki (izolacja, wzbogacanie, derywatyzacja itp.), co może powodować straty analitów.
Dodanie wzorca wewnętrznego do badanej próbki jeszcze przed przystąpieniem do przygotowania próbki do
analizy chromatograficznej pozwala na skorygowanie tych strat.
Stosowanie metody wzorca wewnętrznego pozwala również na uniezależnienie otrzymywanych wyników od
wahań ilości dozowanej próbki. Ograniczeniem w stosowaniu tej metody może być bardzo bogata matryca, w
której znajdują się anality. Trudne może być dobranie odpowiedniej substancji jako wzorca wewnętrznego. W
praktyce metoda ta jest też bardziej pracochłonna niż metoda krzywej kalibracyjnej (wzorca zewnętrznego).
2
Sprzęt:
Chromatograf cieczowy firmy Hewlett Packard składający się z następujących modułów:
1. Kontroler układu chromatograficznego (HP 1050 Controller) – umożliwia ustawienie żądanego
składu fazy ruchomej i prędkości przepływu, a także zaprogramowanie tabel odpowiedzialnych za
przebieg analizy (np. gradientu). Ponadto w sposób automatyczny kontroluje odgazowanie
poszczególnych składników fazy ruchomej helem.
2. Pompa chromatograficzna (HP 1050 Series Pump) – odpowiada za automatyczne mieszanie
składników fazy ruchomej w określonych proporcjach i bezpulsacyjne tłoczenie mieszaniny
elucyjnej do dalszych modułów układu HPLC. Odpowiedzialna jest za monitorowanie ciśnienia w
układzie. Maksymalne ciśnienie pracy pompy wynosi 4300 psi/300 bar.
3. Detektor jednowiązkowy UV-Vis (HP 1050 series λ Absorbance Detector) – pozwala na pracę przy
wybranej długości fali w zakresie 190–600 nm. Wyposażony jest w lampę deuterową i celkę
pomiarową o objętości 14 μl i długości drogi optycznej równej 8 mm.
4. Reodyna (HP 1050 Series) – służy do nastrzykiwania próbek na kolumnę chromatograficzną.
Wyposażona jest w pętlę nastrzykową o objętości wynoszącej 20 μl.
5. Komputer z zainstalowaną kartą komunikacyjną i oprogramowaniem Clarity Software – służy do
zbierania i przetwarzania zebranych danych.
6. Warunki chromatograficzne:
Kolumna
HP ODS C18
(250 mm x 4,6 mm; 5 μm)
Zawartość acetonitrylu AcN
30 % (v/v)
Zawartość wody H2O
70 % (v/v)
Prędkość przepływu fazy ruchomej
0,8 mL/min
Objętość nastrzyku
20 μL
Długość fali
223 nm
Przygotowanie roztworów:
1. Przygotowanie roztworów do nastrzyku. Do fiolek oznaczonych kolejnymi numerami dodać
wzorcowych roztworów kwasu benzoesowego i 2-fenoksyetanolu o stężeniach 10-3mol/dm3 oraz
acetonitrylu zgodnie z poniższą tabelką: Fiolki zakrywamy korkami i dokładnie mieszamy.
Numer
fiolki
Objętość
kw. benzoesowego
L
Objętość
2-fenoksyetanolu
L
Objętość
acetonitrylu
L
1
300
300
900
2
300
600
600
3
300
900
300
4
300
1200
0
Bad. Pr.
x
x
x
Powierzchnia
piku kw.
benzoesowego
Powierzchnia
piku 2-fenoksyetanolu
Stosunek
powierzchni
pików
2. Do niewielkiego zakrywanego naczynia dozujemy 0.1g badanego kremu do rąk, a następnie
dodajemy 4mL acetonitrylu oraz 1 mL roztworu wzorcowego kwasu benzoesowego o stężeniu
10-3mol/dm3. Naczynie szczelnie zamykamy i wstrząsamy energicznie przez 1 minutę. Tak
przygotowany roztwór umieszczamy następnie w myjce ultradźwiękowej i uruchamiamy
urządzenie na okres 10 minut. Po wyznaczonym czasie pobieramy około 2 mL roztworu i sączymy
przez zestaw filtracyjny.
3. Nastrzykiwanie próbek na kolumnę. Po przygotowaniu roztworów nastrzyknąć próbki na kolumnę.
Po wykonaniu chromatogramu spisać pola powierzchni pod badanymi pikami i umieścić je w
tabeli. Obliczyć stosunek pól powierzchni badanych pików – wyniki umieścić w tabeli
3
4. Opracowanie wyników.
Wykonać wykres zależności stosunku pól powierzchni pików od stężenia oznaczanego wzorca.
Korzystając ze sporządzonego wykresu wyznaczyć skład ilościowy badanej substancji w
sporządzonym roztworze. Wyliczyć zawartość procentową 2-fenoksyetanolu w badanym kremie.
Miejsce na obliczenia:
4