Oznaczanie parabenów w szamponie techniką HPLC z

OZNACZANIE PARABENÓW W SZAMPONIE METODĄ WYSOKOSPRAWNEJ
CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ
Z WYKORZYSTANIEM METODY DODATKU WZORCA
Parabeny sa estrami kwasu p-hydroksybenzoesowego różniącymi się rodzajem grupy alkilowej (metylo, etylo,
propylo, butylo, heptylo i benzyloparaben). Są to ciała stałe, o budowie drobnokrystalicznej, bezbarwne i
bezwonne. W powietrzu są trwałe i odporne na rozpad pod wpływem wody i roztworów kwasów. W środowisku
kwaśnym wykazują aktywność przeciwko drożdżom i pleśniom, działają grzybostatycznie. Są natomiast mało
efektywne w stosunku do bakterii. Wraz ze wzrostem długości łańcucha grupy alkilowej wzrasta aktywność
antyseptyczna parabenów, a maleje ich rozpuszczalność w wodzie.
Ze względu na swoje właściwości, parabeny stały się popularnymi środkami antyseptycznymi, wykorzystywanymi
w przemyśle farmaceutycznym, spożywczym i kosmetycznym. Spośród związków z tej grupy najczęściej
stosowane są metylo i propyloparaben. W produktach spożywczych możemy je spotkać w ciastach, przyprawach,
sokach owocowych, mrożonkach, dżemach czy konfiturach. Propyloparaben (symbol E216, E217 w formie soli
sodowej), jednak w 2006 roku został usunięty z europejskiego wykazu dodatków do żywności.[1] Zastosowanie
parabenów do przedłużenia trwałości kosmetyków jest powszechne i wynika z właściwości tych związków, które
nie modyfikują cech produktów – koloru, konsystencji, zapachu.
Parabeny występują prawie we wszystkich kategoriach kosmetyków, przy czym stosuje się je w ponad 13 tysiącach
produktów [2]. Według oszacowań Amerykańskiej Agencji Żywności i Leków (Food and Drug Administration –
www.fda.gov) średnia dzienna ekspozycja na parabeny osoby ważącej 60 kg stanowi 76 mg, z czego 1 mg
pochodzi z żywności, 50 mg z kosmetyków i środków higieny osobistej, a 25 mg z leków. Mimo, że parabeny nie
są toksyczne w takich dawkach, w ostatnich latach zwrócono uwagę na ich działanie estrogenne, co może być
przyczyną rozwoju guzów piersi. Badania prowadzone w 1998 roku [3] wykazały, że butyloparaben, wykazujący
najsilniejsze działanie estrogenne wśród parabenów jest około 10000-100000 mniej aktywny niż naturalny estradiol
(jeden z estrogenów), dane te potwierdzały bezpieczeństwo stosowania tych związków, jednak dalsze badania
przyniosły nowe wątpliwości. W 2004 roku zbadano bowiem próbki raka piersi pobrane od 20 pacjentek [4].
Parabeny wykryto we wszystkich próbkach, w średnim stężeniu 20,6 nanograma na gram tkanki. Związki te
wykryto w niezmienionej formie (tj. w formie estrów), co oznacza, że przedostały się do nich przez skórę z
pominięciem układu pokarmowego [4]. Innym efektem działania substancji imitujących estrogeny jest ich wpływ
na obniżenie płodności mężczyzn.
Niezależnie od wyników dalszych badań nad estrogennym działaniem parabenów, producenci powinni rozważyć
ograniczenie użycia tych związków w kosmetykach, zwłaszcza tych, które są stosowane w okolicach klatki
piersiowej, jak dezodoranty i antyperspiranty.
Literatura:
[1] Dyrektywa 2006/52/WE Parlamentu Europejskiego i Rady z dnia 5 lipca 2006 r. zmieniająca dyrektywę 95/2/WE w sprawie dodatków do żywności innych
niż barwniki i substancje słodzące oraz dyrektywę 94/35/WE w sprawie substancji słodzących używanych w środkach spożywczych.(Dz. Urz. UE L 204 z
05.07.2006)
[2] Soni M.G., Carabin I.G., Burdock G.A., Food and Chemical Toxicology, 2005, 43,
9851015.
[3] Routledge E.J., Parker J., Odum J., Ashby J., Sumpter J.P., Toxicology and Applied Pharmacology, 1998, 153, 1219.
[4] Darbre P.D., Aliiarrah A., Miller W.R., Coldham N.G., Sauer M.J., Pope G.S., Journal of Applied Toxicology, 2004, 24, 513.
Celem rozdzielania mieszaniny substancji na poszczególne składniki, bądź oddzielenia tylko wybranych substancji
od innych, jest najczęściej ich ilościowe oznaczenie, tj. ustalenie zwartości lub masy analitu w bardzo dużej próbce.
Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) jest wykorzystywana do oznaczenia zawartości składników
głównych, t.j. występujących w próbce na poziomie stężeń w zakresie od 1 do 100 %, składników pośrednich - od
0.001 do 1% oraz substancji obecnych w analizowanej próbce poniżej 0.001%, tj. składników śladowych.
Oznaczenie ilościowe w HPLC polega na ustaleniu zależności pomiędzy sygnałem detektora, czyli powierzchnią
pod pikiem lub ewentualnie wysokością piku, a stężeniem lub masą składnika, którego zawartość zamierzamy
oznaczyć. W praktyce mamy do dyspozycji cztery metody oznaczania: metodę wzorca zewnętrznego (metodę
krzywej kalibracyjnej), metodę wzorca wewnętrznego, metodę dodatku wzorca (metodę fortyfikacji) oraz metodę
prostej normalizacji lub normalizacji ze współczynnikami korekcyjnymi.
1
METODA DODATKU WZORCA
Metoda ta polega na dodaniu do próbki znanych ilości substancji oznaczanych (analitów) np. 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 i 0.5
mg/mL, zwykle jest to od 50 do 150% oczekiwanej zawartości oznaczanej substancji. Po zanalizowaniu tych
roztworów, na podstawie uzyskanych chromatogramów, wykreśla się krzywą kalibracyjną, tj. zależność
powierzchni piku analitu w funkcji ilości analitu dodanej do próbki (Rys.1).
Rys. 1. Wykres krzywej kalibracyjnej otrzymanej przy zastosowaniu metody dodatku wzorca
Następnie przeprowadza się graficzną ekstrapolację krzywej kalibracyjnej do punkt przecięcia z osią odciętych i
odczytuje się wartość Cx. Innym sposobem określenia zawartości substancji oznaczanej w próbce bez dodatku
wzorca jest graficzne wyznaczenie przebiegu nowej linii kalibracyjnej typu f(x) = a1x, o tym samym współczynniku
nachylenia prostej, co krzywa kalibracyjna. Przeprowadza się wówczas graficzną interpolację, bądź oblicza się
stężenie analitu w próbce bez dodatku substancji oznaczanej z równania (1), na przykład: Cx=22.5/120=0.19.
cx=a2/a1
(1)
gdzie: a1 - współczynnik kierunkowy prostej, a2 - wartość w punkcie przecięcia się prostej z osią rzędnych.
Zaletą metody dodatku wzorca jest wykonanie kalibracji w takich warunkach, że anality znajdują się w
rzeczywistej matrycy. Szczególnie, kiedy jest bardzo trudne bądź niemożliwe otrzymanie matrycy (placebo), w
której nie znajdowałaby się substancja oznaczana, np. w przypadku próbek klinicznych i środowiskowych.
Szczególną cecha tej metody jest jej wysoka "odporność" na sytuację niepełnego rozdzielenia analitu oraz gdy pik
substancji oznaczanej nie jest rozdzielony do linii podstawowej od innych substancji, których piki są jednak
znacznie mniejsze w stosunku do substancji oznaczanej. Na rysunku 2 przedstawiono przykład takiego
chromatogramu, na którym pik substancji oznaczanej zaznaczono symbolem "1". W wyżej wymienionych
sytuacjach tylko metoda dodatku wzorca pozawala na oznaczenie zawartości substancji w próbce. Wykonanie
oznaczenia zawartości substancji metodą dodatku wzorca jest jednak pracochłonne
Rys. 2. Chromatogram mieszaniny substancji, w której analit (1) nie jest rozdzielony do linii
bazowej od innych substancji.
2
Sprzęt:
Chromatograf cieczowy firmy Hewlett Packard składający się z następujących modułów:
1. Kontroler układu chromatograficznego (HP 1050 Controller) – umożliwia ustawienie żądanego
składu fazy ruchomej i prędkości przepływu, a także zaprogramowanie tabel odpowiedzialnych za
przebieg analizy (np. gradientu). Ponadto w sposób automatyczny kontroluje odgazowanie
poszczególnych składników fazy ruchomej helem.
2. Pompa chromatograficzna (HP 1050 Series Pump) – odpowiada za automatyczne mieszanie
składników fazy ruchomej w określonych proporcjach i bezpulsacyjne tłoczenie mieszaniny
elucyjnej do dalszych modułów układu HPLC. Odpowiedzialna jest za monitorowanie ciśnienia w
układzie. Maksymalne ciśnienie pracy pompy wynosi 4300 psi/300 bar.
3. Detektor jednowiązkowy UV-Vis (HP 1050 series λ Absorbance Detector) – pozwala na pracę przy
wybranej długości fali w zakresie 190–600 nm. Wyposażony jest w lampę deuterową i celkę
pomiarową o objętości 14 μl i długości drogi optycznej równej 8 mm.
4. Reodyna (HP 1050 Series) – służy do nastrzykiwania próbek na kolumnę chromatograficzną.
Wyposażona jest pętlę nastrzykową o objętości wynoszącej 20 μl.
5. Komputer z zainstalowaną kartą komunikacyjną i oprogramowaniem Clarity Software – służy do
zbierania i przetwarzania zebranych danych.
6. Warunki chromatograficzne:
Kolumna
HP ODS C18 (250 mm x 4,6 mm; 5 μm)
Zawartość acetonitrylu AcN
50 % (v/v)
Zawartość wody H2O
50 % (v/v)
Prędkość przepływu fazy ruchomej
1,0 mL/min
Objętość nastrzyku
20 μL
Długość fali λ
256 nm
Przygotowanie roztworów:
1. Roztwór mieszaniny metyloparabenu i propyloparabenu o stężeniach 210-4 mol/dm3.
Z kolbek z roztworami parabenów o stężeniu 10-3 mol/dm3 pobrać do kolbki o objętości 50 mL
odpowiednią objętość wzorców i uzupełnić acetonitrylem do kreski.
2. Roztwór badany. Do strzykawki o pojemności 5mL nabrać około 1.5mL próbki szamponu,
zmontować układ do filtrowania i przefiltrować badany roztwór przez sączek powoli naciskając
tłok strzykawki.
3. Przygotowanie roztworów do nastrzyku. Do fiolek oznaczonych kolejnymi numerami dodać po 50
µL badanego roztworu, ze względu na dużą lepkość cieczy należy wykonać zadanie korzystając z
wagi laboratoryjnej wiedząc że gęstość roztworu wynosi 1.20 g/cm3 . Następnie dodajemy
roztworu wzorcowego i acetonitrylu zgodnie z poniższą tabelką: Fiolki zakrywamy korkami i
dokładnie mieszamy.
Numer
fiolki
Objętość
badanej próbki
L
Objętość wzorców
parabenów
L
Objętość
acetonitrylu
L
1
50
0
150
2
50
50
100
3
50
100
50
4
50
150
0
Powierzchnia
piku
metyloparabenu
Powierzchnia
piku
propyloparabenu
4. Nastrzykiwanie próbek na kolumnę. Po przygotowaniu roztworów nastrzyknąć próbki na kolumnę.
Po wykonaniu chromatogramu spisać pola powierzchni pod badanymi pikami i umieścić je w
tabeli.
3
5. Opracowanie wyników.
Wykonać wykres zależności pola powierzchni piku od stężenia wzorców. Wyznaczyć skład
ilościowy badanej próbki korzystając z jednej z podanych we wstępie metod graficznych.
Miejsce na obliczenia:
4