Ćwiczenie 7-8

Ćwiczenie 7-8. Spektrofluorymetria
biomakromolekuł z ligandami
w
badaniach
oddziaływań
Absorbcja światła przez niektóre cząsteczki związana jest z emisją promieniowania o
innej długości fali. Proces ten, nazywany fluorescencją stanowi podstawę
spektrofluorymetrii - techniki pomiarowej, której wysoka czułość jest wykorzystywana dla
śledzenia subtelnych zmian stężenia i właściwości makrocząsteczek biologicznych.
7-8.1. Spektroskopia fluorescencyjna - podstawy teoretyczne
Oddziaływanie fotonów z molekułami powoduje wzbudzenie elektronów
walencyjnych, czyli ich przejście z orbitali stanu podstawowego do orbitali stanu
wzbudzonego. Wzbudzone elektrony nie pozostają w takim stanie zbyt długo, lecz
spontanicznie powracają do bardziej stabilnego stanu podstawowego. Dla większości
cząsteczek taki proces relaksacji wiąże się z przekazaniem energii do molekuł
rozpuszczalnika lub innych cząsteczek znajdujących się w roztworze. Niektóre wzbudzone
molekuły powracają jednak do stanu podstawowego emitując nadmiar energii w postaci
światła. Proces taki, nazywany fluorescencją, pokazany jest schematycznie na Rys. 1.
Rys. 1. Diagram obrazujący proces fluorescencji
Prosta pionowa strzałka obrazuje absorpcję fotonu, w wyniku której cząsteczka zostaje
pobudzona. Pobudzona cząsteczka traci energię wibracyjną w wyniku zderzeń z innymi
cząsteczkami znajdującymi się w roztworze. Proces taki jest bardzo szybki i powoduje
przejście cząsteczki na niższy poziom wibracyjny w stanie S, co pokazuje falista strzałka.
Molekuła może następnie uwolnić energię świetlną, powracając do stanu podstawowego
(strzałka w postaci linii przerywanej). Światło emitowane posiada dwie istotne cechy: (1)
większą długość fali (niższa energia) niż światło pobudzające. Przyczyną tej różnicy jest
utrata części energii na rzecz rozpuszczalnika; (2) emitowane światło składa się z fal o różnej
długości. Jest to spowodowane dużą ilością poziomów energii wibracyjnej stanu
podstawowego, na których może się znaleźć każda z fluoryzujących molekuł. Tak jak w
przypadku widma absorpcyjnego, dla każdej substancji fluoryzującej obserwuje się
charakterystyczne dla niej maksimum fluorescencji, czyli długość fali, dla której
fluorescencja jest największa. Widmo fluorescencyjne składa się ze światła o różnych
długościach fal zgrupowanych wokół maksimum emisji. W każdym przypadku długości fal
światła emitowanego są większe niż długość fali światła wzbudzającego. Jest to tzw.
przesunięcie stokesowskie:
∆E = hνex - hνem = hc(1/λex – 1/λem),
(1)
gdzie νex – częstotliwość fali absorbowanej, νem – częstotliwość fali emitowanej, h – stała
Plancka. W przypadku, gdy pochłaniająca kwant światła cząsteczka jest już w stanie
wzbudzonym, w widmie fluorescencji mogą pojawić się tzw. linie antystokesowskie, czyli
długości fal krótsze niż długość fali światła wzbudzającego.
Wielkość przesunięcia stokesowskiego odzwierciedla polarność środowiska otaczającego
cząsteczkę fluoryzującą. Przejściu cząsteczki fluorogennej do stanu wzbudzonego towarzyszy
zmiana jej momentu dipolowego, co pociąga za sobą polaryzację powłok elektronowych
cząsteczek rozpuszczalnika, indukcyjne przesunięcie ich atomów oraz polaryzację
orientacyjną. Strata energii na te procesy daje w efekcie przesunięcie maksimum fluorescencji
w kierunku fal dłuższych, które będzie tym większe im większa jest różnica momentów
dipolowych cząsteczki fluorogennej w stanie wzbudzonym i stanie podstawowym, im
większa jest polaryzowalność cząsteczek rozpuszczalnika oraz ich moment dipolowy oraz im
większa jest możliwość zmiany orientacji cząsteczek rozpuszczalnika w czasie trwania stanu
wzbudzonego cząsteczki fluorogennej (około 10-15 s). Przesunięcie stokesowskie będzie
zatem największe dla cząsteczek fluorogennych o długim czasie życia stanu wzbudzonego,
znajdujących się w rozpuszczalniku o dużej przenikalności elektrycznej i małej lepkości.
Ponieważ cząsteczka znajdująca się w stanie wzbudzonym może powrócić do stanu
podstawowego tracąc energię w wyniku kolizji z innymi cząsteczkami lub w wyniku emisji
światła, to wydajność fluorescencji danego układu zależy od względnej intensywności tych
konkurencyjnych procesów. Intensywność fluorescencji określa się zwykle poprzez tzw.
wydajność kwantową Q. Z definicji, Q jest stosunkiem liczby wyemitowanych fotonów do
liczby fotonów zaabsorbowanych. Oszacowanie wydajności kwantowej pozwala często na
określenie ważnych cech danego układu fluoryzującego. Intensywność fluorescencji zależy
od czynników wewnętrznych i zewnętrznych.
Czynniki wewnętrzne, takie jak liczba dostępnych poziomów wibracyjnych,
sztywność cząsteczki, mają znaczenie głównie dla rozważań teoretycznych. Dla biochemika
korzystającego ze spektroskopii fluorescencyjnej, duże znaczenie praktyczne mają natomiast
czynniki zewnętrzne wpływające na Q. Pomiar zmian Q będących rezultatem kontrolowanych
w warunkach eksperymentalnych modyfikacji czynników zewnętrznych pozwalają często na
uzyskanie istotnych informacji o strukturze makrocząsteczek lub naturze oddziaływań
molekularnych pomiędzy małymi cząsteczkami - ligandami - a białkami lub kwasami
nukleinowymi. Obniżenie lub zwiększenie wydajności kwantowej można osiągnąć m.in. w
wyniku zmian stałej dielektrycznej rozpuszczalnika. Fluorescencja wielu związków
fluoryzujących ulega wygaszeniu w roztworach wodnych, a silnemu zwiększeniu w
środowiskach niepolarnych. Takim środowiskiem jest np. wnętrze białka globularnego. Efekt
wygaszania fluorescencji może także zostać osiągnięty w wyniku obecności w środowisku
ciężkich anionów i kationów (I-, Br-, Cs+, Cu2+ i in.) oraz substancji paramagnetycznych (np.
tlen, rodniki nitroksylowe, jony Mn2+). Jednocześnie ze zmniejszeniem wydajności
kwantowej, gaszenie fluorescencji prowadzi do zmniejszenia czasu życia cząsteczki w stanie
wzbudzonym. Czas ten w przypadku braku zewnętrznego „wygaszacza” wynosi τ = 1/kfl,
gdzie kfl jest stałą szybkości przejścia promienistego S1 → S0. Jeżeli zachodzą procesy
wewnątrzcząsteczkowe, to τ0 = 1/(kfl + kc), natomiast w obecności wygaszacza, τ = 1/(kfl + kc
+ kmq), gdzie kc to sumaryczna stała szybkości procesów wewnątrzcząsteczkowych, km – stała
szybkości procesu gaszenia, a q jest stężeniem wygaszacza. Opisem matematycznym
zjawiska wygaszania jest równanie Sterna i Volmera:
τ0/τ = 1 + kmτq = Q0/Q
(2)
gdzie Q0 i Q to odpowiednio wydajności kwantowe fluorescencji w nieobecności i w
obecności wygaszacza. Zjawisko wygaszania fluorescencji jest powszechnie wykorzystywane
w badaniach biologicznych i biochemicznych
7-8.2. Aparatura do pomiarów fluorescencyjnych
Podstawowym urządzeniem pomiarowym jest spektrofluorymetr. Zawiera on źródło
światła, dwa monochromatory, komorę próbki i detektor (Rys. 2). Układ aparatu jest podobny
jak w spektrofotometrze, z dwoma istotnymi wyjątkami. Pierwszą różnicą jest obecność
dwóch monochromatorów - jednego koniecznego dla wyboru fali wzbudzenia i drugiego, dla
analizy długości fali światła emitowanego. Po drugie, detektor jest umiejscowiony pod kątem
(zwykle 90°) do promienia wzbudzającego. Dzięki takiemu układowi eliminuje się wpływ
światła przechodzącego przez próbkę. Po wzbudzeniu molekuł próbki, fluorescencja
emitowana jest we wszystkich kierunkach, a pomiar jej intensywności jest możliwy dzięki
fotodiodzie. Źródłem światła jest najczęściej ksenonowa lampa łukowa, emitująca
promieniowanie w zakresie 200 - 1400 nm. Światło jest kierowane przez układ optyczny do
monochromatora wzbudzenia, który umożliwia wybór określonej długości fali lub
przemiatanie w szerszym zakresie długości fal światła wzbudzającego.
Rys. 2. Schemat ideowy spektrofluorymetru
Światło wzbudzające przechodzi następnie do komory próbki zawierającej kiuwetę
fluorescencyjną z roztworem próbki. Z uwagi na geometrię układu optycznego, kiuwety
fluorymetryczne posiadają cztery ścianki boczne przepuszczające światło. Gdy promień
światła wzbudzającego pada na próbkę, molekuły substancji tam zawartej ulegają wzbudzeniu
i niektóre z nich emitują światło. Światło emitowane w kierunku prostopadłym do promienia
padającego jest analizowane za pomocą monochromatora emisyjnego W większości
przypadków analiza ta polega na pomiarze intensywności fluorescencji przy danej długości
fali. Monochromator kieruje do detektora jedynie światło o zadanej długości fali.
Fotopowielacz służy jako detektor do pomiaru intensywności światła. Prąd proporcjonalny do
intensywności światła padającego generowany w fotopowielaczu jest mierzony przez
odpowiedni układ elektryczny. Nowsze aparaty przekazują jako sygnał wyjściowy prąd
proporcjonalny do stosunku światła emitowanego do światła padającego na próbkę.
Fluorymetry są aparatami do pomiarów fluorescencji przy z góry określonych
wartościach długości fali światła wzbudzającego i światła emitowanego. Aparaty te, w
miejsce monochromatorów posiadają filtry optyczne przepuszczające światło
monochromatyczne. W najprostszej wersji fluorymetr wyposażony jest tylko w jedną parę
filtrów, w wersji bardziej zaawansowanej występuje od kilku do kilkunastu par filtrów
wymiennych. To ostatnie rozwiązanie jest stosowane we fluorymetrycznych czytnikach
mikropłytek
7-8.3. Zastosowanie pomiarów fluorymetrycznych w badaniach biologicznych
Dwa typy pomiarów są najczęściej wykonywane we fluorymetrii: pomiar względnej
intensywności fluorescencji i pomiar wydajności kwantowej. W pierwszym przypadku, w
wyniku pomiaru fluorescencji próbki wyjściowej ustawia się wartość „zero” lub 100%
intensywności fluorescencji, a następnie wprowadza zaburzenie do układu próbki (zmiana
pH, dodanie jakiegoś czynnika chemicznego, zmiana siły jonowej lub polarności
rozpuszczalnika) i mierzy zmianę intensywności fluorescencji w stosunku do stanu
wyjściowego. W tym typie doświadczenia wartości długości fali światła wzbudzającego i
emitowanego są wstępnie ustalane. Pomiar wydajności kwantowej jest procesem bardziej
złożonym. Instrument musi zostać wykalibrowany przed pomiarem. Do tego celu używa się
najczęściej standardów fluorescencyjnych - roztworu siarczany chininy w 1 M H2SO4 (Q =
0.70) lub roztworu fluoresceiny w 0.1 M NaOH (Q = 0.93). Mierzy się intensywność
fluorescencji standardu i próbki a wydajność kwantową dla badanej próbki oblicza się z
proporcji:
gdzie:
Qx/Qstd = Fx/Fstd,
(3)
Qx - wydajność kwantowa próbki
Qstd - wydajność kwantowa standardu
Fx - intensywność fluorescencji próbki
Fstd - intensywność fluorescencji standardu.
Niektóre biocząsteczki fluoryzują, czyli są fluorogenne. Zdolność do fluorescencji
wykazują aminokwasy z pierścieniami aromatycznymi w łańcuchach bocznych (tyrozyna,
fenyloalanina i tryptofan), toteż białka zawierające te aminokwasy są fluorogenne.
Fluorogenne są zasady purynowe i pirymidynowe w kwasach nukleinowych oraz niektóre
koenzymy, np. NAD+ i FAD. Zjawisko wewnątrzpochodnej fluorescencji jest często
wykorzystywane do badania zmian konformacyjnych w białkach i lokalizacji centrów
aktywnych enzymów. Cennych informacji może także dostarczyć zastosowanie fluorogenów
zewnętrznych. Są to substancje fluoryzujące, dodawane do badanego układu. Do grona tego
należy kilka głównych grup związków, takich jak:
pochodne ksantenu: fluoresceina, rodamina, eozyna
pochodne cyjaniny: indokarbocyjanina, tiakarbocyjanina,
pochodne naftalenu: (pochodne dansylu i prodanu)
pochodne kumaryny
pochodne oksadiazolu: pirydyloksazol, nitrobenzoksadiazol, benzoksadiazol
pochodne pirenu: Błekit kaskadowy.
pochodne oksazyny: Czerwień Nilu, Błękit Nilu, Fiolet krezolowy
pochodne akrydyny: proflawina, oranż akrydyny, żółcień akrydyny.
pochodne arylometyny: fiolet krystaliczny, zieleń malachitowa
pochodne tetrapirolu: porfiryna, ftalocyjanina, bilirubina.
Wiele barwników fluoryzujących wykazuje zwiększoną fluorescencję po przeniesieniu
do roztworów niepolarnych lub do środowiska hydrofobowego. Niektóre z tych barwników
wiążą się za specyficznymi fragmentami białek lub kwasów nukleinowych, a intensywność
wypadkowej fluorescencji zależy od budowy miejsca wiązania, jak np. w przypadku
fluorogenów wiążących się z kwasami nukleinowymi.
Barwnik
λabs
λem
selektywność wiązania
Oranż akrydynowy
Chromomycyna A3
503
445
530/640
575
Bromek etydyny
SYTOX Green
DAPI
493
504
345
620
523
455
Hoechst 33258
350
461
DNA/RNA
DNA, selektywnie wiąże się do
obszarów bogatych w pary GC
DNA
DNA
DNA, selektywnie wiąże się do
obszarów bogatych w pary AT
DNA, selektywnie do mniejszego
rowka podwójnej helisy
Zewnętrzne fluorogeny, których przykłady przedstawiono na Rys. 3 wykorzystuje się np. do
badania oddziaływania kwasów tłuszczowych z albuminą surowicy, charakterystyki miejsc
wiązania kofaktorów i substratów z enzymami lub badań nad interkalacją małych cząsteczek
do podwójnej helisy DNA. Pochodne amino-metylokumaryny (AMC) stosuje się jako
sztuczne substraty w pomiarach aktywności peptydaz. Biomakromolekuły nie zawierające
ugrupowań fluorogennych można przekształcić w pochodne fluoryzujące w wyniku reakcji z
cząsteczkami fluorogennymi zawierającymi odpowiednie, reaktywne grupy funkcyjne.
Modyfikacje takie przeprowadzane są najczęściej w stosunku do białek nie zawierających
reszt tryptofanylowych, a przyłączenie następuje do grup aminowych, karboksylowych lub
tiolowych, jednym z wymienionych poniżej sposobów:
•
•
•
grupy aminowe
grupy karboksylowe
grupy tiolowe
estry aktywne, izotiocyjaniany, hydrazydy
karbodiimidy
maleimidy, α-halogenoketony.
Jednym z najczęściej używanych odczynników tego rodzaju jest izotiocyjanian fluoresceiny
(FITC)
HO
O
O
-
Cl
N
N
N
O
COOH
Fluoresceina
Br
N
COOH
O
Czerwień Nilu
+
O
Rodamina
Br
HO
O
O
SO3
Br
-
HN
Br
COOH
1,8-ANS
Kalceina
Eozyna
H2N
N(CH3)2
O
O
CH3
Aminometylokumaryna (AMC)
SO2Cl
Jodek propidyny
Chlorek dansylu
H2N
NH2
_
+
N Br
C2H5
(CH3)2N
N(CH3)2
N
Oranż akrydynowy
Bromek etydyny
Chromomycyna A3
NH
+
HN
H3C HN +
NH
N
N
OH
NH
+
-
N
3 Cl
S
CH
+
DAPI
-
X
Hoechst 33258
N
N
HO
H
N
SO3H
N
N
N
SO3H
O
OH
N
N
H
N
N
CH3
SYBR Green I
OH
H
N
H2N
O
-
SO3
NH
Li
O
N
H
NH2
HO
Calcofluor White
N
N
SO3
Li
+
Lucifer Yellow
Rys. 3. Struktury niektórych fluorogenów stosowanych w badaniach biologicznych
+
.
Perylen
Piren
DPH
O
.
+
OH
N(CH3)3
O
TMA-DPH
O
H
S
C
+
N
I
-
H
C
H
C
H
C
S
C
H
N
DiSC3(5)
12-AS
Rys. 4. Struktury znaczników fluorescencyjnych wykorzystywanych w badaniach właściwości błon
biologicznych
Związki fluorogene zawierające grupy hydroksylowe lub karboksylowe mogą być
przekształcane w estry. Takie pochodne estrowe łatwo dyfundują przez błony biologiczne, a
we wnętrzu komórki są hydrolizowane przez esterazy, w wyniku czego generowany jest
fluorogen nie mogący już opuścić komórki. Jednym z popularniejszych związków tego typu
jest dioctan fluoresceiny. Acetoksymetylowy ester kalceiny (Calceine AM) jest
wykorzystywany jako narzędzie do badania działania transporterów wielolekowych typu
ABC, jako że jest znakomitym substratem dla tych białek, takich jak np. P-glikoproteina
Zewnętrzne fluorogeny, zwane także w tym przypadku znacznikami
fluorescencyjnymi, wykorzystywane są powszechnie w badaniach błon biologicznych.
Znaczniki te wiążą się z błonami kowalencyjnie lub niekowalencyjnie i z pomiarów
parametrów ich fluorescencji otrzymać można informacje o strukturze i funkcji błony.
Struktury niektórych znaczników przedstawiono na Rys. 4. Różne znaczniki lokują się w
różnych segmentach błony. Niektóre z nich, wbudowujące się głęboko, reagują na zmiany
zachodzące we wzajemnym ułożeniu łańcuchów węglowodorowych fosfolipidów, inne
reagują na zmiany zachodzące na powierzchni błony. Przykładowo cząsteczka 1,8-ANS (rys.
3) nie może zanurzyć się głęboko w dwuwarstwę lipidową i pozostaje na powierzchni,
natomiast piren i perylen dyfundują do obszaru łańcuchów węglowodorowych. Jodek
3,3’dipropylotiodikarbocyjaninowy DiSC3(5) stosowany jest do pomiarów potencjału
błonowego, gdyż natężenie jego fluorescencji zależy od tego potencjału.
W tabeli przedstawiono zestawienie metod fluorescencyjnych stosowanych do badania
błon i właściwości błon biologicznych, które mogą być badane daną metodą.
Właściwości
Przejścia fazowe i separacja faz
Ruchliwość lateralna lipidów i białek
Metoda
Pomiar natężenia fluorescencji
FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching),
ekscymeryzacja*
Oddziaływanie białek błonowych z błoną
Transfer energii
Potencjał błonowy
Wykorzystanie znaczników fluorescencyjnych wrażliwych
na zmiany potencjału
Potencjał powierzchniowy
Wiązanie naładowanych znaczników fluorescencyjnych z
błoną
Agregacja białek
Transfer energii
Asymetria błonowa
Wykorzystanie
znaczników
fluorescencyjnych
nie
przenikających przez błonę
*tworzenie dimerów (ekscymerów) z niewzbudzonymi cząsteczkami znacznika fluorescencyjnego
przez cząsteczki tego znacznika wprowadzone do obszaru lipidowego błony, które pochłonęły kwant światła i
przeszły w stan wzbudzony
Pomiary fluorymetryczne charakteryzują się dużo większą czułością niż pomiary
absorpcyjne. Z tego względu, niezwykle ważna jest dokładność i szczególna ostrożność w
przygotowaniu próbek, gdyż niewielkie nawet zanieczyszczenia mogą spowodować duży błąd
pomiaru. Należy bezwzględnie sprawdzić wszystkie używane rozpuszczalniki i odczynniki
pod kątem obecności w nich substancji fluoryzujących. Fluorescencja tła musi być potem
uwzględniana we wszystkich pomiarach. Roztwory powinny być przechowywane w
ciemnych naczyniach, szczelnie zamkniętych korkami szklanymi, dla uniknięcia
fotochemicznego rozkładu odczynników oraz zanieczyszczenia substancjami pochodzącymi z
korków gumowych lub z tworzyw sztucznych. Należy pamiętać, że białka w rozcieńczonych
roztworach wykazują tendencję do adsorpcji na ściankach naczyń szklanych, co może
prowadzić do utraty substancji fluoryzujących lub zanieczyszczenia ścianek kiuwet
pomiarowych. Szkło stosowane do badań fluorymetrycznych musi być szczególnie
skrupulatnie myte. Roztworów nie należy długo przechowywać - w miarę możliwości należy
je przygotowywać tuż przed użyciem. Wszelkie zmętnienia muszą być usunięte przed
pomiarem. Ponieważ zjawisko fluorescencji silnie zależy od temperatury, wszystkie pomiary
fluorymetryczne powinny być dokonywane w określonej temperaturze. W aparatach wyższej
klasy, wymóg ten jest spełniony poprzez termostatowanie komory pomiarowej.
7-8.4. Eksperymenty
Eksperyment 1. Badanie szybkości transportu doksorubicyny przez błony komórkowe
erytrocytów
Doksorubicyna (DOX) jest przeciwnowotworowym antybiotykiem antracyklinowym
stosowanym w terapii ostrej białaczki szpikowej i limfoblastycznej oraz niektórych
nowotworów narządowych. Transport cząsteczek antybiotyku do wnętrza komórek odbywa
się na drodze dyfuzji prostej. Doksorubicyna jest związkiem fluorogennym, o długości fali
wzbudzenia 490 nm a fali emisji – 590 nm. Dzięki tej właściwości możliwe jest
monitorowanie szybkości transportu DOX przez błony komórkowe metodą fluorymetryczną.
Materiały
1. Zawiesina erytrocytów
2. Buforowany roztwór soli fizjologicznej (PBS)
3. Roztwór doksorubicyny (1 mM)
Wykonanie eksperymentu
1. Ustalić liczbę komórek erytrocytów w zawiesinie przy użyciu komory Thoma
2. Rozcieńczyć zawiesinę komórek do gęstości 109 komórek/ml
3. Odmierzyć po 1,35 ml zawiesiny komórek do 12 probówek Eppendorfa i umieścić
probówki w łaźni wodnej w temp. 37 °C
4. Dodać po 0,15 ml odpowiednio rozcieńczonego roztworu doksorubicyny.
5. Odwirować zawartość kolejnych probówek po 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 15, 20 i 25 min.
Pobrać próbki supernatantu nie naruszając osadu i przenieść je do osobnych
probówek.
6. Zmierzyć natężenie fluorescencji przy długości fali wzbudzenia 490 nm i fali emisji
590 nm.
7. Sporządzić krzywą wzorcową do fluorymetrycznego oznaczania zawartości DOX w
próbie.
8. Przeliczyć zmierzone wartości natężenia fluorescencji na stężenia DOX i sporządzić
wykres zależności stężenia antybiotyku od czasu inkubacji.
9. Wyznaczyć szybkość dyfuzji leku do komórki. Obliczyć zawartość DOX w
komórkach po 25 min inkubacji.
Eksperyment 2. Badanie efektywności wyrzutu Rodaminy 6G przez wielolekooporne
komórki drożdży
Rodamina 6G jest związkiem fluorogennym będącym bardzo dobrym substratem dla białek
oporności wielolekowej typu ABC, takich jak P-glikoproteina ssacza oraz pompy
wielolekowe z drobnoustrojów grzybowych: Pdr5p z S. cerevisiae oraz Cdr1p i Cdr2p z
Candida abicans. Energia niezbędna dla działania pomp typu ABC pochodzi z hydrolizy
ATP. Komórki stosowane w eksperymencie są najpierw poddawane „głodzeniu” poprzez
inkubację w obecności 2-deoksy-D-glukozy. W tych warunkach zostaje zużyta
wewnątrzkomórkowa pula ATP. W etapie kolejnym komórki pozbawione ATP zostają
„naładowane” związkiem fluorescencyjnym. Działanie białka typu ABC zostaje pobudzone
poprzez dodanie glukozy i uruchomienie wytwarzania ATP.
Materiały
1. Hodowle komórek Sacharomyces cerevisiae AD12345678 oraz ADCDR1 w podłożu
YNBG
2. PBS – roztwór soli fizjologicznej (0.9% NaCl) buforowany 50 mM buforem
fosforanowym, pH 6.0
3. 100 mM Roztwór 2-deoksy-D-glukozy w PBS
4. 1 mM roztwór Rodaminy 6G w PBS
5. Roztwory związków współzawodniczących lub inhibitorów aktywności białka Cdr1p
– wedle uznania prowadzącego ćwiczenie
Wykonanie eksperymentu
Eksperyment wykonywany jest równolegle dla dwóch rodzajów komórek. Komórki
AD12345678 nie posiadają białek oporności wielolekowej, natomiast komórki ADCDR1
posiadają białko CDR1p będące pompą wielolekową typu ABC pochodzącą z drożdżaków
Candida albicans.
1. Komórki drożdży pochodzące z hodowli w podłożu YNBG odwirować i dwukrotnie
przemyć wodą (3000 g, 5 min, 20°C).
2. Odwirowane komórki zawiesić w PBS, pH 6.0 zawierającym 5 mM 2-deoksy-Dglukozę (2-DG), do gęstości optycznej OD660 = 0.4. Zawiesinę inkubować przez 30
min w temp. 30 °C.
3. Podczas inkubacji komórek z 2-DG otrzymać widmo absorpcyjne UV-vis i widmo
emisyjne dla Rodaminy 6G.
4. Dodać roztwór Rodaminy 6G do końcowego stężenia 10 µM (na tym etapie możliwe
jest także dodanie związku mającego konkurować z Rodaminą 6G) i kontynuować
inkubację przez 30 min.
5. Zawiesinę odwirować, przemyć 2 × PBS i zawiesić w świeżym PBS do OD660 = 0.2
(objętość 10 ml).
6. Inkubować zawiesinę przez 5 min w temp. 30 °C, następnie dodać roztwór D-glukozy
do końcowego stężenia 40 µM i kontynuować inkubację (możliwa opcja – dodanie po
9 min od dodania glukozy związku będącego inhibitorem białka Cdr1p). Natychmiast
po dodaniu glukozy oraz w odstępach 3 min pobierać przez 21 min próbki zawiesiny o
objętości 1 ml.
7. Każdą pobraną próbkę odwirować natychmiast po pobraniu, pobrać po 0.2 ml
supernatantu i umieścić w studzience mikropłytki. Po zebraniu wszystkich próbek
dokonać pomiaru fluorescencji wszystkich próbek przy długościach fal wzbudzenia i
emisji określonych wcześniej.
8. Na podstawie otrzymanych wyników sporządzić wykresy zależności zmian poziomu
fluorescencji w badanych próbkach od czasu
Eksperyment 3. Badanie lokalizacji cząsteczek antybiotyku z grupy makrolidów polienowych
w błonie cytoplazmatycznej metodą transferu energii z użyciem znaczników
fluorescencyjnych
W eksperymencie wykorzystuje się dwa znaczniki fluorescencyjne lokalizujące się w różnych
segmentach błony cytoplazmatycznej. Podczas eksperymentu mierzony jest efekt wygaszania
fluorescencji znacznika wynikający z transferu części emitowanej energii do cząsteczek
antybiotyku z grupy makrolidów polienowych.
Materiały
1.
2.
3.
4.
Komórki Saccharomyces cerevisiae w podłożu YNBG
Roztwory DPH i TMA-DPH (2 mM) w dimetyloformamidzie (DMF)
Roztwory antybiotyku w DMSO (rodzaj i stężenie podane przez prowadzącego)
Roztwór buforowy: 10 mM Hepes, pH 7.0. 132 mM NaCl, 3.5 mM KCl, 1 mM CaCl2,
0.5 mM MgCl2.
Wykonanie eksperymentu
1. Sporządzić widma emisji DPH i TMA-DPH dla fali wzbudzenia 365 nm oraz widmo
absorpcyjne dla antybiotyku. Zmierzyć wartości absorbancji (długość fali 365 nm i
427 nm) roztworów antybiotyku o stężeniach odpowiadających stężeniu (stężeniom)
stosowanemu podczas pomiaru efektu transferu energii
2. Hodowlę komórek S. cerevisiae odwirować, przemyć buforem Hepes i komórki
zawiesić w buforze Hepes do gęstości optycznej OD660 = 0.1 (odpowiada około 2 ×
106 komórek/ml).
3. Umieścić 2 ml zawiesiny w kuwecie do pomiarów spektrofluorymetrycznych i dodać
2 µl roztworu DPH lub TMA-DPH. Rozpocząć pomiar fluorescencji przy długości fali
wzbudzenia 365 nm i fali emisji 427 nm, aż do ustalenia odczytu na stałym poziomie
(od 3 do 25 min).
4. Po ustaleniu odczytu dodać roztwór antybiotyku (ilość określona przez
prowadzącego) i kontynuować odczyt przez 30 min.
5. Dla otrzymanych odczytów obliczyć wartości charakteryzujące efektywność transferu
energii. Ze wzoru:
E = 1 – (F/F0),
gdzie F i F0 są intensywnościami fluorescencji emitowanej odpowiednio w obecności i
nieobecności antybiotyku. Wartości F do wzoru powinny być skorygowane, zgodnie z
zależnością:
F = F’ × 10(A1 + A2)/2,
gdzie F’ jest wartością otrzymaną bezpośrednio z pomiaru, a A1 i A2 są wartościami
absorbancji roztworu antybiotyku zmierzonymi dla długości fal odpowiadających
maksimum wzbudzenia i emisji dla znacznika fluorescencyjnego (365 nm i 427 nm).
6. Dokonać interpretacji otrzymanych wyników i na ich podstawie wyciągnąć wnioski
dotyczące przypuszczalnej lokalizacji cząsteczek antybiotyku w błonie
cytoplazmatycznej.
Eksperyment 4. Badanie wiązania kwasów tłuszczowych z albuminą w wykorzystaniem ANS
jako sondy fluorescencyjnej
W eksperymencie wykorzystuje się znacznik fluorescencyjny, 1,8-ANS, który wykazuje
zdolność do fluorescencji po związaniu się z obszarami o charakterze hydrofobowym białek.
Podczas eksperymentu mierzony jest efekt wygaszania fluorescencji 1,8-ANS w kompleksie z
BSA w obecności kwasu laurynowego oraz szczawiowego.
Materiały
1.
2.
3.
4.
5.
50mM bufor sodowo-fosforanowy o pH 7.4
0.3 mg/ml BSA w buforze sodowo-fosforanowym o pH 7.4
0.25 mM roztwór 1,8-ANS w w buforze sodowo-fosforanowym o pH 7.4
0.5mM roztwór kwasu laurynowego w buforze sodowo-fosforanowym o pH 7.4
0.5mM roztwór kwasu bursztynowego w buforze sodowo-fosforanowym o pH 7.4
Wykonanie eksperymentu
1. Przygotować roztwory robocze BSA w kompleksie z ANS poprzez zmieszanie 2ml
wyjściowego roztworu BSA oraz 0.9ml buforu i 0.1ml wyjściowego roztworu ANS.
2. Sporządzić próbki pomiarowe zgodnie z poniższą tabelą:
lp
Roboczy roztwór
BSA-ANS [µl]
1
2
3
4
5
6
100
100
100
100
100
100
Roztwór kwasu
laurynowego/bursztynowego
[µl]
50
100
150
200
300
Bufor
[ml]
2.9
2.85
2.8
2.75
2.7
2.6
3. Dokonać kontrolnego pomiaru emisji roztworu BSA, wykonanego poprzez zmieszanie
2 ml roztworu wyjściowego BSA i 1ml buforu sodowo-fosforanowego BSA, dla fali
wzbudzenia 366 nm w zakresie 400-600 nm.
4. Dokonać kontrolnego pomiaru emisji roztworu ANS, wykonanego poprzez zmieszanie
2.9 ml buforu sodowo-fosforanowego i 0.1ml wyjściowego roztworu ANS, dla fali
wzbudzenia 366 nm w zakresie 400-600 nm.
5. Sporządzić widma emisji 1,8-ANS w kompleksie z BSA, dla fali wzbudzenia 366 nm
w zakresie 400-600 nm dla roztworów sporządzonych wg schematu opisanego w pkt.
2
6. Dla otrzymanych odczytów wyznaczyć F oraz F0, gdzie F i F0 są intensywnościami
fluorescencji emitowanej odpowiednio w obecności i nieobecności badanego kwasu.
7. Sporządzić wykresy zależności F/F0 poziomu fluorescencji w badanych próbkach od
stężenia stosowanego kwasu.
8. Dokonać interpretacji otrzymanych wyników i na ich podstawie wyciągnąć wnioski
dotyczące mechanizmu zdolności kwasu tłuszczowego – laurynowego oraz
bursztynowego do wygaszania fluorescencji kompleksu BSA-ANS.