Chemia i technologia materialow barwnych_Spektrofluorymetria2011

POLITECHNIKA GDAŃSKA
WYDZIAŁ CHEMICZNY
KATEDRA TECHNOLOGII CHEMICZNEJ
Ćwiczenia laboratoryjne
CHEMIA I TECHNOLOGIA MATERIAŁÓW BARWNYCH
SPEKTROFLUORYMETRIA
GDAŃSK ROK 2011
1. Cel ćwiczenia
Celem ćwiczenia jest zapoznanie Studentów z podstawami fizycznymi zjawiska
fluorescencji oraz właściwościami fizykochemicznymi substancji wykazujących
fluorescencję.
Zilustrowane zostaną także czynniki wpływające na intensywność
fluorescencji. Studenci zapoznają się z podstawowymi czynnościami i sprzętem
stosowanym w analizie ilościowej przy wykorzystaniu spektrofluorymetrii. Zostaną
zaprezentowane
możliwości
wykorzystania
odpowiedniego
oprogramowania
spektrofluorymetru do obróbki uzyskanych danych i prowadzenia pomiarów w
różnych trybach.
2. Wprowadzenie
2.1. Informacje ogólne
Luminescencją określamy ogólnie promieniowanie, które
termicznego.
W
zależności
fotoluminescencję,
bioluminescencję.
luminescencją
rodzaju
wzbudzenia
katodoluminescencję,
rentgenoluminescencję,
sonoluminescencję,
od
nie jest pochodzenia
Fotoluminescencja,
wywołaną
absorpcją
wyróżnić:
radioluminescencję,
elektroluminescencję,
chemiluminescencję,
można
tryboluminescencję,
elektrochemiluminescencję
będąca
tematem
promieniowania
oraz
ćwiczenia,
świetlnego
w
jest
zakresie
ultrafioletowym i widzialnym. W zależności od czasu pomiędzy pochłonięciem a
wyemitowaniem energii wyróżnia się fluorescencję i fosforescencję. Z fluorescencją
mamy do czynienia, gdy od pochłonięcia światła przez cząsteczkę do emisji nie
upłynęło więcej niż 10-8 s. Jeśli czas pomiędzy pochłonięciem energii a jej emisją jest
dłuższy niż 10-8 s mówimy wówczas o fosforescencji. Zjawisko fluorescencji i
fosforescencji ilustruje diagram Jabłońskiego.
Diagram Jabłońskiego
2
Zdolność luminescencji posiada wiele substancji m.in. cząsteczki aromatyczne i
heterocykliczne,
cząsteczki
licznych
barwników
(np.
fluoresceina,
eozyna),
cząsteczki o znaczeniu biologicznym (aromatyczne aminokwasy, zasady nukleinowe,
chlorofil i karotenoidy oraz niektóre witaminy i hormony). Przykłady związków
wykazujących fluorescencję zamieszczono poniżej.
NH2
O
OC2H5
N
H2N
N
CH3
rywanol
HO
N-metyloakrydon
O
(C2H5)2N
O
antracen
perylen
+
N(C2H5)2
O
Cl
_
COOH
COOH
rodamina B
fluoresceina
CH=CH2
HO
CH
N
CH3O
O
N
kumaryna
chinina
Przykłady związków wykazujących fluorescencję.
Świecenie roztworów charakteryzują:
-
widma absorpcji i emisji
-
wydajność
-
czas trwania (czas zaniku świecenia)
-
anizotropia emisji (polaryzacja).
Zależność pomiędzy widmami absorpcyjnymi i emisyjnymi ustalili Stokes i Lommel.
Pasmo fluorescencji i jego maksimum są przesunięte w stronę długofalową
względem pasma absorpcji i jego maksimum. Dodatkowo stwierdzili, że pasma
fluorescencji i absorpcji częściowo się nakrywają. Dodatkowo Stokes stwierdził, że
częstość
światła
fluorescencji
jest
zawsze
mniejsza
niż
częstość
światła
wzbudzającego. Reguła Stokesa jest spełniona, gdy stosujemy światło wzbudzające
leżące w obszarze widma absorpcji. Gdy fluorescencja jest wzbudzana światłem o
częstości w obszarze nakładania się widm absorpcji i fluorescencji reguła Stokesa
jest naruszona.
3
Cechą
charakterystyczną
fotoluminescencji
jest
widmo
promieniowania
absorbowanego i emitowanego. Pasma absorpcji i fluorescencji wieloatomowych
cząsteczek mają się do siebie jak zwierciadlane odbicia. Reguła ta została odkryta
przez Nicholsa i Merrita, a zbadana szczegółowo przez Lewszyna. Ilustruje ją
poniższy, bardzo schematyczny, rysunek.
Symetria zwierciadlana widm absorpcji i fluorescencji
Ścisła symetria zwierciadlana widm absorpcji i fluorescencji jest obserwowana tylko
w nielicznych przypadkach.
Istnieje wiele czynników, które wpływają na obniżenie wydajności kwantowej
fluorescencji danej substancji. W ciekłych roztworach zjawisko to zależy m.in. od:
- natury rozpuszczalnika,
- temperatury
- stężenia substancji luminezującej
- natury i stężenia obcych domieszek (tzw. wygaszaczy)
- pH.
Możemy mówić o zjawiskach statycznego i dynamicznego wygaszania fluorescencji.
Procesy statyczne związane są m.in. z asocjacją dwóch lub więcej molekuł
substancji
w
stanie
podstawowym.
Dimery
nie
wykazują
właściwości
fluorescencyjnych.
W odróżnieniu od statycznego procesu wygaszania, dynamiczne wygaszanie
fluorescencji zależy od prędkości dyfuzji i stężenia substancji luminezującej.
Molekuła wzbudzona spotyka się z molekułą gaszącą, niezdolną do fluorescencji. Na
skutek tego substancja fluoryzująca traci bezpromieniście swoją energię („traci
fluorescencję”).
Zależność pomiędzy stężeniem „wygaszacza” a zmianą intensywności fluorescencji
opisuje równanie Sterna-Volmera:
4
Io
= 1 + K SV [Q]
I
gdzie: I oraz Io intensywność fluorescencji odpowiednio w obecności i nieobecności
substancji wygaszającej, Ksv – stała Sterna-Volmera, [Q]- stężenie substancji
wygaszającej.
Z dynamicznym wygaszaniem fluorescencji mamy także do czynienia w niskich
temperaturach, gdzie lepkość rozpuszczalnika jest większa, co powoduje mniejszą
ruchliwość molekuł aniżeli w wyższych temperaturach.
W wielu układach statyczne i dynamiczne gaszenie fluorescencji może zachodzić
jednocześnie.
Schemat blokowy spektrofluorymetru z ustawieniem prostopadłym detektora ilustruje
rysunek poniżej.
Aparatura do pomiaru natężenia fluorescencji może różnić się określonymi
rozwiązaniami w zależności od producenta. Nie mniej jednak zasadniczymi
elementami aparatu są:
- Źródło promieniowania wzbudzającego: najczęściej lampy rtęciowe i ksenonowe.
- Monochromator promieniowania wzbudzającego. Monochromator przepuszcza
promieniowanie z zakresu nadfioletu, zatrzymuje natomiast emitowane przez lampę
promieniowanie widzialne.
- Uchwyt próbek
- Monochromator promieniowania emitowanego. Zadaniem tego monochromatora
jest
przepuszczenie
widzialnego
promieniowania
fluorescencyjnego
i
zaabsorbowanie promieniowania nadfioletowego, które może być rozproszone w
kierunku detektora.
5
- Detektor. Jako detektory stosowane są: fotoogniwa, fotokomórki, fotopowielacze
elektronowe. Te ostatnie stosowane są w spektrofluorymetrach.
Spektrofluorymetr – aparat zaopatrzony w siatki dyfrakcyjne.
Fluorymetr – układ uproszczony, gdzie zastosowano filtry interferencyjne jako
monochromatory.
2.2. Charakterystyka metod fluorymetrycznych
Spektrofluorymetria
opiera
się
na
pomiarze
natężenia
promieniowania
fluorescencyjnego emitowanego po odpowiednim wzbudzeniu substancji badanej. W
analityce wykorzystuje się zależność natężenia fluorescencji od stężenia analitu.
Co jest oczywiste, metody te mogą być zastosowane do oznaczania substancji
wykazujących fluorescencję np. oznaczanie wielopierścieniowych węglowodorów
aromatycznych. Znane i stosowane są odczynniki, które zdolne są do selektywnego
oddziaływania z analitem (kationy metali, aniony organiczne i nieorganiczne,
obojętne cząsteczki, związki biologicznie czynne), w wyniku czego zmienia się obraz
fluorescencji: następuje jej wzmocnienie lub wygaszanie. Pomiary fluorescencyjne
mają zastosowanie do oznaczania analitów na niskim poziomie stężeń (nawet 0,01
ppm). Nie mogą być zastosowane do oznaczania substancji stanowiących
podstawowe składniki próbek.
Zalety:
- duża czułość (przewyższająca metody spektrofotometryczne).
- dobra precyzja
- dokładność
- selektywność.
Między innymi z tych powodów w wielu tzw. technikach sprzężonych np. w
wysokosprawnej chromatografii stosuje się detektory spektrofluorymetryczne.
2.3. Literatura
1. W. Szczepaniak „Metody instrumentalne w analizie chemicznej”. PWN, W-wa,
2007.
2. D. Kealey, P.J. Haines „Chemia analityczna”. PWN, W-wa, 2005.
3. T. Pluciński: „ Doświadczenia chemiczne” Wydawnictwo Adamantan, W-wa 1997.
6
3. Metodyka badawcza
W
trakcie
ćwiczenia
do
pomiarów
spektrofluorymetrycznych
zostanie
wykorzystany spektrofluorymetr Aminco Bowman Series 2000. Do rejestracji
widm absorpcyjnych zostanie wykorzystany spektrofotometr UV-Vis UNICAM UV
300 series. Wszystkie pomiary zostaną wykonane w kuwetach kwarcowych o
drodze optycznej 1 cm. Roztwory robocze zostaną przygotowane w kolbach
miarowych o określonej pojemności z użyciem wody demineralizowanej jako
rozpuszczalnika.
4. Wykonanie doświadczeń
Odczynniki
Fluoresceina
Jodek potasu
Bromek potasu
Chinina
Rywanol – tabletki
Kwas siarkowy
Wodorotlenek sodu
Szkło miarowe (kolby, pipety), gruszki do zasysania roztworów
Aparatura
Spektrofluorymetr Aminco Bowman Series 2000.
4.1. Wygaszanie fluorescencji fluoresceiny przez jony halogenkowe.
a. Przygotować roztwór podstawowy fluoresceiny (ok. 7⋅10-4 M) w 0,1 M NaOH.
Przygotować roztwory robocze w kolbach miarowych o pojemności 25 ml przez
odpowiednie rozcieńczenie roztworu podstawowego tj. 2 ml roztworu podstawowego.
Jeden z roztworów uzupełnić do kreski wodą demineralizowaną.
b. Zarejestrować widmo absorpcyjne fluoresceiny. Na tej podstawie określić
parametry pomiaru widma emisyjnego (długość fali wzbudzenia).
c. Zarejestrować widmo emisyjne fluoresceiny.
d. Przygotować 0,5 M roztwór jodku potasu (25 ml) w wodzie.
e. Przygotować serię roztworów (kolby miarowe 25 ml) zawierających
2 ml roztworu podstawowego fluoresceiny oraz kolejno:
0,1; 0,25; 0,5; 1; 2; 3; 4; 5 ml 0,5 M roztworu jodku potasu.
7
f. Przygotować 0,5 M roztwór chlorku/bromku potasu (wskaże prowadzący
ćwiczenie). Przygotować analogiczną serię roztworów jak w przypadku jodku
potasu. Zarejestrować widma emisyjne dla przygotowanych roztworów.
4.2. Wygaszanie stężeniowe.
Sporządzić roztwór rywanolu w wodzie (tabletka 100 mg w 1 l ciepłej wody). 10 ml, 1
ml oraz 0,1 ml przygotowanego roztworu rywanolu rozcieńczyć do 100 ml wodą.
Porównać
intensywność
świecenia
poszczególnych
roztworów
w
świetle
ultrafioletowym.
Zarejestrować widmo absorpcyjne roztworu rywanolu. Określić długość fali
wzbudzenia i zarejestrować widmo emisyjne. Porównać widma emisyjne roztworów o
różnych stężeniach.
4.3. Intensywność fluorescencji a pH
Przyłączenie lub odszczepienie protonu może wpływać na zmianę właściwości
spektroskopowych
w
tym
także
fluorescencji.
Wpływ
pH
na
właściwości
fluorescencyjne zostanie zilustrowany na przykładzie roztworu chininy. We
wskazanych fiolkach umieścić przygotowany roztwór chininy. Do jednego z
roztworów dodać 1 ml roztworu NaOH. Porównać fluorescencję obu roztworów w
świetle lampy UV. Następnie do zalkalizowanego roztworu dodawać kroplami (nie
mieszając) roztwór kwasu siarkowego. Obserwować zmianę fluorescencji w świetle
ultrafioletowym.
5.
Opracowanie wyników
5.1. Wygaszanie fluorescencji fluoresceiny przez jony halogenkowe.
Na
podstawie
przeprowadzonych
pomiarów
ocenić
zdolność
wygaszania
fluorescencji fluoresceiny przez odpowiednie jony halogenkowe wykorzystując
równanie Sterna-Volmera. Wyznaczyć stałą wygaszania. Przeprowadzić dyskusję
wyników. Odpowiedzi uzasadnić.
5.2. Wygaszanie stężeniowe.
Wyjaśnić wpływ stężenia substancji fluoryzującej na intensywność fluorescencji.
Odpowiedź uzasadnić.
5.3. Intensywność fluorescencji a pH
Wyjaśnić wpływ pH na zmianę fluorescencji roztworu chininy. Odpowiedź uzasadnić
ilustrując ją odpowiednimi wzorami.
8