Znaczenie netropsyny i distamycyny w poszukiwaniu nowych

&ARM0RZEGL.AUK †
:NACZENIENETROPSYNYIDISTAMYCYNY
WPOSZUKIWANIUNOWYCHZWI’ZKÌWPRZECIWNOWOTWOROWYCH
)MPORTANCEOFNETROPSINANDDISTAMYCININRESEARCH
ONNEWANTICANCERAGENT
$ANUTA$ROZDOWSKA*AKUB3ZERSZENOWICZ-ARTA3ZERSZENOWICZ
:AKŒAD#HEMII/RGANICZNEJ5NIWERSYTET-EDYCZNYW"IAŒYMSTOKU
!PTEKAgW"RUNONAW/RZYSZU
!PTEKAgW"RUNONAW'I˜YCKU
Streszczenie
Abstract
Distamycyna i netropsyna to naturalne antybiotyki o aktywności przeciwnowotworowej, wiążące się odwracalnie
z DNA za pomocą wiązań wodorowych, oddziaływań van
der Waalsa i elektrowalencyjnych, z wyraźną preferencją
do regionów zawierających pary zasad A-T. Cząsteczki
obu związków to oligopeptydy zbudowane z reszt kwasu 4-amino-1-metylopirolowego i silnie zasadowych łańcuchów bocznych, o kształcie izohelikalnym do węższej
bruzdy DNA. Antybiotyki te, mimo, że charakteryzują
się wielokierunkową aktywnością, są zbyt toksyczne, by
znaleźć zastosowane w leczeniu nowotworów. Sposób
wiązania distamycyny i netropsyny z DNA zainspirował
poszukiwanie związków o podobnym mechanizmie działania, niektóre z nich weszły do fazy badań klinicznych.
Grupa syntetycznych oligopeptydów projektowanych na
wzór omawianych antybiotyków, selektywnych wobec
określonych par zasad DNA, otrzymała nazwę leksitropsyn. Analogi zawierające benzen w miejscu pierścienia
N-metylopirolowego wykazują antyproliferacyjną aktywność wobec linii komórkowych raka sutka. Karbocykliczne leksitropsyny zbudowane z przynajmniej trzech
podjednostek benzenowych hamują działanie topoizomeraz DNA oraz amidolityczną aktywność enzymów proteolitycznych, takich jak plazmina i urokinaza.. Opisane,
niektóre tylko rezultaty z zakresu modyfikacji struktury
analogów netropsyny i distamycyny dają nadzieję, że zostanie otrzymany związek o pożądanej aktywności, który
będzie mógł być stosowany jako środek leczniczy w terapii przeciwnowotworowej.
Distamycin and netropsin are natural antibiotics with anticancer activity, binding reversibly within DNA by hydrogen bonds, van der Waals contacts and electrostatic
interactions, with high specificity for regions containing
A-T base pairs. The molecules both of compounds are
oligopeptides constructed with 4-amino-1-methylpyrrole
acid moieties and strong basic side chains, with isohelical
to minor groove DNA shapes. These antibiotics, although
are characterized multidirectional activity, are too toxic
to find the application in cancer therapy. The manner in
which distamycin and netropsin bind to DNA inspired the
searching of compounds with similar mode of action, some
of them were came in clinical trial phases. The group of
synthetic oligopeptides projected on pattern of described
antibiotics, selective to specific base pairs of DNA, obtained the name “lexitropins”. The analogues containing
the benzene in place of N-methylpyrrole rings show the
antiproliferative activity against breast cancer cell lines.
The carbocyclic lexitropsins built with at least three benzene units inhibit the topoisomerases DNA activity and
amidolytic activity of proteolytic enzymes such plasmin
or urokinase. The described results in the field of distamycin and netropsin structures modification raise possibility
to obtain the compound with required activity; which will
be suitable for application in anticancer therapy.
Key words: Distamycin, netropsin, anticancer agents, minor groove binders
Słowa kluczowe: Distamycyna, netropsyna, związki
przeciwnowotworowe, związki wiążące się z DNA
Wstęp
Przez wiele lat zabieg operacyjny i radioterapia były
wyłącznymi sposobami leczenia nowotworów. Nowa, rozwijająca się zwłaszcza w ostatnim czterdziestoleciu, metoda
leczenia chorób nowotworowych za pomocą naturalnych
i syntetycznych leków cytostatycznych, zwana chemiotera-
pią, uzupełnia chirurgiczną terapię przeciwnowotworową.
Zakres zastosowań leków przeciwnowotworowych znacznie wzrósł, poznano mechanizmy ich działania, jednak
wciąż stanowią one grupę leków o wąskim indeksie terapeutycznym i dużej toksyczności [1]. Poznanie molekularnych mechanizmów procesów nowotworowych umożliwia
poszukiwanie nowych substancji działających skutecznie na
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
czym tworzą się wielokrotne wiązania wodorowe pomiędzy cząsteczką antybiotyku
i sąsiadującymi zasadami DNA, zaś jego
kationowe fragmenty wiążą się elektrowalencyjnie z resztami fosforanowymi [2].
Syntetyczne związki tego rodzaju nie
są jeszcze stosowane klinicznie, mimo, że
prace nad poszukiwaniem analogów związków wiążących się w węższej bruździe, są
bardzo intensywne w ostatnich latach.
Struktura i aktywność biologiczna
distamycyny i netropsyny
Ryc.1. Struktury netropsyny (I) i distamcyny (II).
wybrane cele molekularne. Do badań tych można zaliczyć
nowoczesną grupę związków o właściwościach przeciwnowotworowych, działających poprzez selektywne wiązanie
się z węższą bruzdą B-DNA, w tym netropsyny (I) i distamycyny (II) (Ryc.1) oraz ich analogów.
Do grupy związków wiążących się w węższej bruździe
podwójnej helisy DNA należą także Hoechst (III), berenil
(IV), DAPI (V) oraz grupa bisamidyn (VI-pentamidyna)
(Ryc. 2). Związki te nie wywołują głębokich zmian w konformacji DNA. Wręcz przeciwnie, to kształt cząsteczki tych
związków upodabnia się do kształtu tej części B-DNA, przy
Distamycyna i netropsyna, są naturalnymi antybiotykami o silnym działaniu
przeciwnowotworowym, wyizolowanymi
z Streptomyces netropsis i Streptomyces
distallicus [3]. Związki te z powodu zbyt
dużej toksyczności nie znalazły zastosowania w praktyce
klinicznej, służą jednak jako modele, wzorce i nośniki grup
czynnych w poszukiwaniu nowych środków przeciwnowotworowych. Pod względem chemicznym związki te są
oligopeptydami zbudowanymi z pierścieni metylopirolowych połączonych wiązaniami peptydowymi. Fragmentem
C-terminalnym każdego z antybiotyków jest grupa 2-amidynoetyloaminowa, a N-terminalnym formylowa w przypadku distamycyny i guanidynoacetylowa w przypadku
netropsyny. W warunkach fizjologicznych distamycyna jest
kationem jedno-, a netropsyna dwudodatnim.
Ryc. 2. Struktury związków wiążących się z węższą bruzdą B-DNA.
&ARM0RZEGL.AUK
Ryc. 3. Struktury leksitropsyn poddanych badaniom klinicznym.
Stwierdzono, że cząsteczki tych antybiotyków, zbudowane z reszt kwasu 4-amino-1-metylopirolo-2-karboksylowego,
tworzą łuk, w którym grupy N-metylenowe są po stronie zewnętrznej krzywizny, natomiast grupy NH wiązań amidowych, są po stronie wklęsłej łuku. Dzięki takiej strukturze
mogą tworzyć wiązania wodorowe w pozycji C-2 tyminy
i N-3 adeniny. Kierunek wiązań amidowych CONH w obu
antybiotykach jest zgodny z kierunkiem C5’→C3’ łańcucha
polinukleotydowego [4]. Wykazano, że oba związki charakteryzują się wysoką selektywnością wiązania regionu DNA
bogatych w pary A-T, przy czym distamycyna oddziałuje
z pięcioma a netropsyna z czterema parami zasad [5].
Distamycyna i netropsyna wiążąc się silnie z B-DNA,
wnikają głęboko do wnętrza mniejszej bruzdy, dzięki czemu
hamują działanie polimeraz, wpływając na proces replikacji
i transkrypcji [6]. Związki te powodują zatrzymanie fazy G2
i poliploidyzację w ludzkich diploidalnych fibroblastach [7],
hamują również aktywność topoizomerazy I [8] oraz różnego rodzaju enzymów restrykcyjnych [9]. Netropsyna hamuje
wzrost bakterii G(+) i G(-), prątków kwasoodpornych pierwotniaków oraz namnażanie się wirusów zwierzęcych [10]. Distamycyna hamuje syntezę wirusowego DNA Herpes simplex,
a także wiąże się z fragmentami retrowirusa HIV-1 [11]. Obydwa antybiotyki wykazują właściwości cytotoksyczne in vitro
i in vivo w stosunku do nowotworów Ehrlicha i Walkera [12].
Mimo tak wielokierunkowej aktywności, omawiane
związki nie znalazły zastosowania w terapii nowotworów
z powodów wysokiej cytotoksyczności skierowanej przeciwko komórkom zdrowym. Distamycyna ma słabsze działanie toksyczne niż netropsyna, dzięki czemu bywa stosowana w okulistyce przy zakażeniach wirusem opryszczki
[13] i niektórych infekcjach wirusowych skóry [14].
Leksitropsyny – cząsteczki selektywnie rozpoznające sekwencje DNA
Mechanizm działania distamycyny i netropsyny
z B-DNA stał się inspiracją do poszukiwania związków,
które mając kształt izohelikalny względem węższej bruzdy
B-DNA, wiążą się nieinterkalacyjnie z DNA, specyficznie
wobec określonych par zasad i charakteryzują się mniejszą
cytotoksycznością. Grupa syntetycznych heteroaromatycznych oligopeptydów, projektowanych na wzór omawianych
antybiotyków otrzymała nazwę leksitropsyn. Wszystkie te
związki mogą wykazywać działanie zarówno przeciwwirusowe, jak i przeciwnowotworowe, wpływają także hamująco na aktywność topoizomeraz [2].
Pomimo ogromnego postępu w projektowaniu leksitropsyn o wysoce selektywnym sposobie działania nie uzyskano dotychczas związków, których właściwości pozwoliłyby
na ich zastosowanie lecznicze
[15]. Wraz z analogami innych związków wiążących się
z mniejszą bruzdą DNA, leksitropsyny znalazły zastosowanie jako nośniki związków
o ugruntowanym działaniu
przeciwnowotworowym, wiążąc je w ściśle określonych
rejonach DNA [2]. Jednym
z przykładów jest tallimustyna, analog distamycyny
z dołączonym fragmentem
iperytowym (Ryc. 3), która
wykazała cytotoksyczność wobec komórek białaczki L1210
większą o rząd wielkości
Ryc. 4. Schemat tworzenia bibliotek kombinatorycznych analogów distamycyny.
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
wydajności
syntezy.
W wyniku badań i syntez otrzymano ligandy
wykazujące tysiąckrotnie większą cytotoksyczność (IC50 29nM)
niż distamycyna A [20].
Leksitropsyny
karbocykliczne
Ryc. 5. Struktury karbocyklicznych leksitropsyn.
w porównaniu do melfalanu [16]. Ponieważ związek ten
powodował silną niedokrwistość, badania kliniczne tallimustyny przerwano w II fazie [17].
Innym związkiem o interesującym mechanizmie działania jest brostallicyna (Ryc. 3), analog distamycyny z fragmentem α-bromoakrylamidowym. Związek ten wiąże się
z DNA tylko w obecności glutationu (GSH) i transferazy
S-glutationowj (GSH), które są produkowane w większym
stopniu w komórkach nowotworowych niż normalnych
[18]. Brostallicyna jest obecnie w II fazie badań klinicznych
[19].
Poszukiwanie leksitropsyn o optymalnej aktywności
biologicznej jest kontynuowane w wielu ośrodkach naukowych, także z zastosowaniem syntezy kombinatorycznej.
Przykładem jest otrzymanie 2640 analogów distamycyny
metodą typową dla syntez oligopeptydów, gdzie w przypadku pierścienia nr 1 było użytych 10 rodzajów podstawników, w przypadku pierścienia nr 2 było to 11 podstawników,
a w miejscu pierścienia nr 3 wstawiano kolejno 12 związków (Ryc. 4) [20].
Pochodne były tworzone w dwóch seriach po 132 mieszaniny zawierające 10 związków. Wykonanie biblioteki
składało się z ośmiu operacji, co pozwoliło uzyskać 40%
Badania prowadzone w Zakładzie Chemii
Organicznej Uniwersytetu
Medycznego
w Białymstoku skoncentrowano na analogach karbocyklicznych
distamycyny i netropsyny, czyli związkach,
w których pierścienie
N-metylopirolowe zastąpiono benzenowymi. Pochodne te charakteryzują się większą
stabilnością w różnych
warunkach
reakcji
oraz łatwością syntezy,
a substratami są ogólnie dostępne nitrowe
pochodne
benzenu.
Związki te po redukcji,
w reakcji z odpowiednimi chlorkami kwasowymi, prowadzą do
uzyskania pochodnych
amidowych. Modelowanie molekularne potwierdza, iż mają one odpowiednią
budowę, by wiązać się w małym rowku B-DNA [21, 22].
Większy stopień specyficzności wiązania karbocyklicznych
analogów z DNA, wobec regionów bogatych w sekwencje
A-T w porównaniu do G-C potwierdzono także metodą wypierania bromku etydyny (ang. ethidium displacement assay) [23, 24]. Analogi 5A i 7A (Ryc. 5) wykazały aktywność
wobec linii komórkowej raka sutka MCF-7, z wartościami
IC50 odpowiednio 24.43 i 40.73 μM. Analogi z grupami metoksylowymi w pozycji orto do grupy amidowej były mniej
aktywne wobec komórek MCF-7 [25], ale wszystkie analogi
zawierające trzy grupy benzenokarboksyamidowe wykazały aktywność wobec topoizomerazy I [23]. Karbocykliczne leksitropsyny z alifatycznym łącznikiem (4 lub 6 grup
CH2) pomiędzy środkowymi pierścieniami benzenowymi
oraz z niepodstawioną terminalną grupą NH2 (Ryc. 5 – 9A),
hamowały in vitro zarówno aktywność topoizomerazy typu
pierwszego, jak i drugiego [26].
Opisane leksitropsyny z N-terminalnie przyłączoną jednostką chlorambucylu przejawiały aktywność wobec linii
komórkowej raka sutka MCF-7 [24], a z grupą 5-[N,Nbis(2-chloroetylo)amino]-2,4-dinitrobenzoilową – wobec
raka wątroby HEP G2 w warunkach hipoksyjnych [27].
&ARM0RZEGL.AUK
Przyłączenie kwasu benzotriazolo-5-karboksylowego pozwoliło otrzymać pochodne mające właściwości przecinające nici DNA [28].
Osiem analogów distamycyny zawierających obok benzenowych, także pierścienie tiazolowe i pirydynowe, otrzymane drogą syntezy tradycyjnej, hamowało proliferację komórek raka sutka MCF-7 (IC50 w zakresie 3.47 -12.53 μM)
i MDA-MB-231 (4.35-12.66 μM). Związki te wiązały się
z DNA, choć nieco słabiej niż distamycyna, a także hamowały działanie topoizomeraz I i II DNA [29].
Stwierdzono, że związki 4-6 (Ryc. 5) poza aktywnością
wobec linii komórkowych raka sutka i hamowaniem działania
topoizomeraz DNA, charakteryzują się także aktywnością wobec enzymów proteolitycznych, plazminy i urokinazy [30].
Podsumowanie
Zbadanie budowy i oddziaływania netropsyny i distamycyny z DNA przyczyniło się w znacznym stopniu do zrozumienia zasady rozpoznawania sekwencji DNA przez leki,
a co za tym idzie do zsyntezowania kilku klas nowych
związków potencjalnie użytecznych w chemioterapii przeciwnowotworowej [2]. Chemiczna struktura analogów netropsyny i distamycyny może być modyfikowana w szerokim zakresie, co pozwala osiągnąć pożądaną aktywność
i selektywność wobec DNA. Z tego powodu wydaje się, że
opisane antybiotyki będą nadal inspirować projektowanie
i syntezę nowych związków o aktywności przeciwnowotworowej, mimo że niewiele, jak dotąd, analogów tych związków zostało poddanych badaniom klinicznym.
Piśmiennictwo
1. Chabner AB i wsp. Leki przeciwnowotworowe. W:
Farmakologia Goodmana & Gilmana. (Red. Brunton
LL, Lazo JS, Parker KL, Wyd. I, (Red. Polska: Krzemiński TF, Buczko W, Czuczwar SJ) Czelej 2007; T.
II: 1411-1413.
2. (a) Bailly C, Chaires JB, Sequence-specific DNA minor groove binders. Design and synthesis of netropsin
and distamycin analouges, Bioconjugate Chem 1998;
9: 513-538. (b) Dervan PB, Molecular Recognition of
DNA by Small Molecules, Bioorg Med Chem 2001; 9:
2215-2235.
3. (a) Finlay AC i wsp., Netropsin, a new antibiotic produced by Streptomyces, J Am Chem Soc 1951; 73: 341343. (b) Arcamone FS i wsp., Structure and sintesis of
distamycin A, Nature 1964; 203: 1064-1065.
5 Goodsell D, Dickerson RE, Isohelical analysis of DNA
groove binding drugs, J Med Chem 1986; 29: 727-733
4. Berman HM i wsp., Synthesis, DNA binding and antiviral activity of distamycins analogues containing different heterocyclic moieties, Bioochim Biophys Acta
1979; 561: 124-131.
5. Wartell RM, Larson JE, Wells RD, Netropsin. A specific
probe for A-T regions of duplex deoksyribonucleic acid,
J Biol Chem 1974; 249: 6719-6731.
6. Chandra P, Zimmer Ch, Thrum H, Effect of distamycin
A on the structure and tamplate activity of DNA in RNA
polymerase system, FEBS Lett. 1970; 7: 90-94.
7. Poot M i wsp., The minor-groove binding DNA-ligands
netropsin, distamycin A and berenil cause polyploidisaton via impairment of the G2 phase of the cell cycle,
Cell Struct Funct 1990; 15: 151-157.
8. Chen AY i wsp., DNA minor groove-binding ligands:
A different class of mammalian DNA topoisomerase I inhibitors, Proc Natl Acad Sci USA 1993; 90:
8131-8135.
9. (a) Sidorova NY, Gazoni P, Rau DC, Competition between netropsin and restriction nuklease EcoR1 for
DNA binding, J. Biomol. Struct. Dyn. 1995; 13: 367385. (b) Turner PR, Denny WA, The mutagenic properties of DNA minor-groove binding ligands, Mutation
Res 1996; 355: 141-169.
10. Di Marco A i wsp., Experimental studies on distamycin
A- a new antibiotic with cytotoxic activity, Cancer Res
Rep 1962; 18: 15- 19.
11. Feriotto G, Misachiati C, Gambari R, Sequence – specific recognition of the HIV-1long terminal repeat by
distamycin: a DNA-ase I footprinting study, Biochem J
1964; 299:451-458.
12. Raczyńska-Bojanowska K, Antybiotyki w badaniu procesów biochemicznych, PWN, Warszawa 1974, 200 i 215.
13. Pawełczyk E., Chemia leków. Podręcznik dla studentów
farmacji, Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa
1986, 570.
14. Remers WA, Lyengar BS, Antitumor antibiotics. W: Foye
W. O. Red. Cancer Chemotherapeutic Agents, American
Chemical Society, Washington 1995, 577-679.
15. Caia X, Gray PJ Jr., Von Hoff DD, DNA minor groove
binders: Back in the groove, Cancer Treat Rev, 2009;
35: 437-450.
16. Broggini M i wsp., Selective DNA Interaction of the
Novel Distamycin Derivative FCE 24517, Cancer Res
1991; 51: 199-204.
17. Pindur U, Jansen M, Lemster T, Advances in DNA-ligands with groove binding, intercalating and/or alkylating activity: chemistry, DNA-binding and biology.
Current Med Chem 2005; 12(2): 805.
18. Geroni C i wsp., Brostallicin, a Novel Anticancer Agent
Whose Activity Is Enhanced upon Binding to Glutathione, Cancer Res 2002; 62: 2332-2336.
19. h t t p : / / w w w. c e l l t h e r a p e u t i c s . c o m / b r o s t a l l i c i n
(2.03.2010).
20. Hall DG., Manku S, Wang F, Solution- and solid-phase
strategies for the design, synthesis, and screening of libraries based on natural product templates: a comprehesive survey, J Comb Chem 2001; 32: 125-130.
21. Bielawski K i wsp., Molecular modeling of the interaction of carbocyclic analogues of netropsin and sitamycin with d(CGCGAATTCGCG)2, Acta Biochim Polon
2000; 47: 110-112.
22. Bielawski K i wsp., Molecular modeling of the interaction of carbocyclic analogues of netropsin and sitamycin with d(CGCGAATTCGCG)2, Acta Biochim Polon
2000; 47: 855-866.
23. Bartulewicz D, Bielawski K, Bielawska A. Carbocyclic
analogues of netropsin and distamycin: DNA-binding
properties and inhibition of DNA topoisomerases, Arch
Pharm Pharm Med Chem 2001; 9: 422-426.
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
24. Bartulewicz D i wsp. Synthesis, molecular modelling,
and antiproliferative and cytotoxic effects of carbocyclic derivatives of distamycin with chlorambucil moiety,
Eur J Med Chem 2001; 36: 461-467.
25. Bartulewicz D i wsp. Molecular modelling, synthesis
and antitumour activity of carbocyclic analogues of netropsin and distamycin – new carriers of alkylating elements, Acta Biochim Polon 2000; 47: 23-35.
26. Pućkowska A i wsp. New carbocyclic analogues of netropsin: Synthesis and inhibition of topoisomerases,
Acta Biochim Polon 2002; 49: 177-183.
27. Markowska A i wsp. New carbocyclic lexitropsin with
dinitromustard as N-terminal fragment. Inhibition of topoisomerases. Acta Polon Pharm 2003; 60: 119-21.
28. Pućkowska A, Drozdowska D, Midura-Nowaczek K, Carbocyclic analogues of lexitropsin - DNA affinity and endonuclease inhibition. Acta Polon Pharm 2007; 64: 115-119.
29. Drozdowska D i wsp. Synthesis and biological evaluation of distamycin analogues – new potential anticancer agents 342 (2009) 87-93.
30. Drozdowska D i wsp. Carbocyclic potential DNA minor
groove binders and their biological evaluation, J Enz Inhib Med Chem, 2010 (w druku).
data otrzymania pracy: 19.03.2010 r.
data akceptacji do druku: 20.04.2010 r
Adres do korespondencji:
Danuta Drozdowska
Zakład Chemii Organicznej, Uniwersytet Medyczny w Białymstoku,
ul. Mickiewicza 2A, 15-222 Białystok,
tel. +48 85 748 56 84, fax +48 85 748 54 16
e -mail: [email protected].