WPŁYW RÓśNYCH METOD KONSERWACJI NASIENIA KNURA W

Medicina Veterinaria 1(2) 2002, 13-22
WPŁYW RÓśNYCH METOD KONSERWACJI
NASIENIA KNURA W NISKICH TEMPERATURACH
NA WYBRANE WŁAŚCIWOŚCI PLEMNIKÓW
Wiesław Bielas
Streszczenie. Celem badań był wybór metody mroŜenia nasienia oraz ocena wpływu
dimeru lizozymu na plemniki knura. Badania przeprowadzono na 115 ejakulatach. Nasienie konfekcjonowano w duŜych słomkach, słomkach płaskich i kulkach. Najlepszą jakość
po rozmroŜeniu posiadały plemniki konfekcjonowane i konserwowane w niskich temperaturach w słomkach płaskich i kulkach według zmodyfikowanej metody Pursela i Parka.
Dodatek 4 i 6 µg dimeru lizozymu powodował wzrost wartości wskaźnika ruchliwości i
niezmienionych akrosomów.
Słowa kluczowe: mroŜenie, nasienie, knur, słomki, kulki, lizozym
WSTĘP
Konserwacja nasienia knura w niskich temperaturach umoŜliwia tworzenie rezerw
genetycznych najlepszych osobników (banki nasienia poszczególnych ras oraz linii),
otwiera moŜliwości eksportu nasienia na duŜe odległości (Daleki Wschód, Australia),
umoŜliwia dostarczanie nasienia mroŜonego w rejony nieregularnie zaopatrywane w
nasienie świeŜe.
Z tego powodu na całym świecie prowadzone są intensywne badania nad mroŜeniem plemników knura. Pierwsze próby kriokonserwacji nasienia knura prowadzone
były w oparciu o technologię zamraŜania nasienia buhaja [Polge 1956]. Po sztucznej
inseminacji nasieniem mroŜonym nie uzyskiwano jednak ciąŜy, pomimo zachowania
zdolności ruchowej przez niski odsetek rozmroŜonych komórek płciowych. Dopiero w
1970 r. opisano pierwsze skuteczne unasiennienia loszek uzyskane po zastosowaniu
mroŜonego nasienia knura na drodze inseminacji chirurgicznej bezpośrednio do jajowodów [Polge i in. 1970]. Pomimo opracowania kilku procedur konserwacji nasienia knura w niskich temperaturach praktycznie tylko dwie technologie sprawdziły się w komercyjnych warunkach terenowych; amerykańska metoda kulkowa [Pursel i Johnson 1975]
oraz niemiecka metoda duŜych słomek lub makrotub [Westendorf i in. 1975]. Przy
stosowaniu mroŜonego nasienia knura w terenowej praktyce inseminacyjnej obserwuje
się niŜsze wskaźniki rozrodu trzody w stosunku do nasienia konserwowanego w stanie
płynnym; o 20% wskaźnik oproszeń, o 1–2 prosięta liczebność miotów. Niskie wskaźniki rozrodu uzyskiwane po inseminacji loch nasieniem mroŜonym wynikają z faktu,
14
W. Bielas
iŜ błona komórkowa plemników knura charakteryzuje się duŜą podatnością na uszkodzenia kriogeniczne [Watsona 1995]. Ponadto zamroŜone i rozmroŜone plemniki knura
cechują się znacznie ograniczoną przeŜywalnością i zdolnością do zapłodnienia komórki jajowej w drogach rodnych samicy [Einarsson i Viring 1973]. Wykazano równieŜ
duŜą zmienność osobniczą w zamraŜalności nasienia pomiędzy poszczególnymi samcami tego gatunku, jak równieŜ między ejakulatami od tego samego osobnika. Aktualnie prowadzone badania mają na celu uzyskanie stałego wskaźnika płodności rzędu 65–
75%, przy uŜyciu nasienia większości knurów, przy liczbie plemników w dawce inseminacyjnej nie większej jak 3 mld komórek.
Celem 1 etapu badań było porównanie wpływu mroŜenia nasienia knura w niskich
temperaturach w makrotubach kontrolnych i doświadczalnych na jakość plemników.
Celem 2 etapu badań był wybór optymalnej technologii konserwacji i sposobu konfekcjonowania nasienia knura w niskich temperaturach.
Celem 3 etapu badań była ocena wpływu róŜnych stęŜeń dimera lizozymu na właściwości plemników knura konfekcjonowanych i mroŜonych w słomkach płaskich.
MATERIAŁ I METODY
Badania przeprowadzono na 115 ejakulatach pobranych od 8 rasowych knurów w
wieku od 1 do 5 lat, o sprawdzonej, dobrej płodności. Knury eksploatowano w pomieszczeniach Katedry Rozrodu Zwierząt AR we Wrocławiu. Przez cały okres badań
zwierzęta Ŝywiono zgodnie z przyjętymi normami dla tego gatunku zwierząt i regularnie eksploatowano 1 raz w tygodniu. Nasienie pobierano metodą manualną na fantomie.
Do badań pozyskiwano wyłącznie frakcję nasienia bogatą w plemniki, którą filtrowano
w celu oddzielenia frakcji Ŝelowej. Do badań w pierwszym etapie zakwalifikowano 40
ejakulatów od 4 knurów, w 2 etapie uŜyto 50 prób nasienia od 5 samców, a w 3 etapie
25 ejakulatów od 5 zwierząt.
W 1 etapie badań, nasienie knura zamraŜano w statycznych parach ciekłego azotu i
rozmraŜano według metody makrotub badaczy niemieckich [Westendorf i in. 1975].
Plemniki konfekcjonowano w makrotubach kontrolnych i doświadczalnych. Makrotuby
kontrolne firmy Minitüb wykonane są z PVC, posiadają długość 280 mm, średnicę
wewnętrzną 5,4 mm, grubość ścianki 0,375 mm. Makrotuby doświadczalne sporządzono z polietylenu, posiadają długość 255 mm, średnicę wewnętrzną 6,4 mm oraz grubość
ścianki 0,75 mm. Po rozmroŜeniu obydwu typów makrotub, przeznaczone do dalszej
oceny nasienie inkubowano w łaźni wodnej o temperaturze 37 0C przez 3 godziny. Na
początku i końcu testu temperaturowego oceniano właściwości ruchowe plemników,
integralność akrosomów komórek płciowych badano 30 minut po rozmroŜeniu.
W 2 etapie badań, pobrany od knura ejakulat dzielono na 2 równe części. KaŜdą połowę próby zamraŜano inną metodą. Pierwszą połowę nasienia konserwowano w ciekłym azocie metodą opisaną wyŜej w 1 etapie badań, którą umownie nazwano metodą
A. Modyfikacja oryginalnej metody makrotub polegała na konfekcjonowaniu nasienia
dodatkowo w słomkach płaskich oraz w kulkach na suchym lodzie. Pozostałą drugą
część ejakulatu mroŜono według metody B. Technologia B została opracowana w oparciu o metodę Pursela i Parka [1987]. Modyfikacja tej procedury polegała na zwiększeniu współczynnika g w czasie wirowania z 300 do 800 jednostek oraz konfekcjonowaniu nasienia równieŜ w słomkach płaskich i kulkach na suchym lodzie. Słomki okrągłe
oraz płaskie w obydwu technologiach znajdowały się na tym samym poziomie nad
Acta Sci. Pol.
Wpływ róŜnych metod ...
15
lustrem ciekłego azotu, tak aby w kaŜdej próbie panowała jednakowa szybkość zamraŜania. Zarówno w metodzie A, jak i w B, końcowe stęŜenie glicerolu, Orvus Es Paste
oraz koncentracja plemników wynosiły, odpowiednio: 3% i 0,5%, 1·109 plemników w 1
mililitrze. Słomki okrągłe i płaskie rozmraŜano w łaźni wodnej o temperaturze i czasie,
odpowiednio: 50 i 39 oC , 40 i 15 sekund. RozmroŜone próbki rozrzedzano 1:10 rozrzedzalnikiem BTS (Beltsville thawing solution) i inkubowano w łaźni o temperaturze 37
o
C przez 3 godziny. Na początku i na końcu testu temperaturowego ustalano odsetek
plemników o ruchu postępowym i z niezmienionym akrosomem.
W 3 etapie badań, zakwalifikowany ejakulat knura dzielono na 6 równych części, na
próbkę kontrolną oraz na próbki doświadczalne: nr 1, 2, 3, 4, i 5. Do próbki doświadczalnej nr 1 dodawano czystą postać dimeru lizozymu (Nika Health) w ilości 2 µg na
1 ml nasienia. Do pozostałych próbek doświadczalnych nr 2, 3, 4 i 5 dodawano odpowiednio 4, 6, 8 i 10 µg dimeru na 1 ml nasienia. Kontrolą była próbka nasienia bez
dodatku immunomodulatora. Wszystkie próbki mroŜono i konfekcjonowano w słomkach płaskich według metody B. Trzydzieści minut po rozmroŜeniu i inkubacji słomek
płaskich w łaźni wodnej o temperaturze pokojowej, określano jakość plemników na
podstawie badania mikroskopowego. Otrzymane wyniki poddano analizie statystycznej
z uwzględnieniem testu t-Studenta przy uŜyciu pakietu statystycznego Statistica PL.
Istotność róŜnic pomiędzy średnimi poszczególnych cech badano na poziomie istotności
alfa = 0,01. Hipotezę o równości średnich odrzucano na poziomie istotności alfa = 0,05.
WYNIKI
Wyniki 1 etapu badań prezentuje tabela 1. Pół godziny po rozmroŜeniu makrotub
kontrolnych i doświadczalnych, ruch postępowy przejawiało odpowiednio 35,1 i
27,62% oraz nieuszkodzony akrosom posiadało 62,65 i 56,62% plemników. Trzy godziny po rozmroŜeniu makrotub kontrolnych i doświadczalnych i inkubacji nasienia w
temperaturze 37 o C ruchem postępowym poruszało się odpowiednio: 21,23 i 13,98%
plemników (p < 0,01). Badania udowodniły, Ŝe plemniki knura konfekcjonowane w
makrotubach kontrolnych, posiadały wyŜsze średnie wartości wskaźników jakości w
porównaniu z komórkami mroŜonymi w opakowaniach doświadczalnych.
Tabela 1. Jakość nasienia knurów po rozmroŜeniu duŜych słomek (x±s; n=40)
Table 1. Quality of boars semen after thawing of large straws (x±s; n=40)
% plemników o ruchu prawidłowym
Motility of spermatozoa
30 minut po rozmroŜeniu 3 godziny po rozmroŜeniu
30 minutes after thawing 3 hours after thawing
Słomki
kontrolne
35,1±7,15 a
Control straws
Słomki doświad27,62±14,97 b
czalne
Experimental straws
a,b,c,d,e,f
a,b,c,d,e,f
% plemników z normalnym
akrosomem
Spermatozoa with normal
acrosom
30 minut po rozmroŜeniu
30 minutes after thawing
21,23±7,68 c
62,65±7,68 e
13,98±16,6 d
56,62±12,46 f
– średnie wartości w kolumnach z róŜnymi indeksami róŜnią się istotnie statystycznie (P< 0,01)
– values within columns with different superscripts differ (P<0.01)
Medicina Veterinaria 1(2) 2002
W. Bielas
16
Wyniki 2 etapu badań prezentuje tabela 2. NajwyŜszy odsetek plemników o ruchu
prawidłowym po rozmroŜeniu wykazano w nasieniu konfekcjonowanym w kulkach i
mroŜonych według metody B; 37,8% (kol. C), a najniŜszy w makrotubach metody A;
17,2% (kol. A), róŜnica (o 20,6%) statystycznie istotna. Po 3 godzinach testu temperaturowego obserwowano obniŜenie średniej wartości odsetka plemników o ruchu prawidłowym we wszystkich ocenianych próbach. NajwyŜszy procent gamet wykazujących
ruch postępowy ponownie stwierdzono w nasieniu konfekcjonowanym w kulkach,
mroŜonych według metody B; 28,8% (kol. G), natomiast najniŜszy w makrotubach
metody A; 10,1% (kol. E). NajwyŜszą średnią wartość odsetka plemników z niezmienionym akrosomem pół godziny po rozmroŜeniu prób, stwierdzono w nasieniu konfekcjonowanym w kulkach i słomkach płaskich, mroŜonych według metody B, odpowiednio: 63,5%; 63,1% (kol. D), a najniŜszą – w makrotubach metody A; 54,9% (kol. B). Po
3 godzinach stwierdzono istotne statystycznie obniŜenie średniej wartości badanego
wskaźnika. NajwyŜszy odsetek plemników z niezmienionym akrosomem wykazano w
tym czasie w próbach konfekcjonowanych w słomkach płaskich według metody B
(kol. H) oraz w słomkach płaskich metody A (kol. F), odpowiednio: 56,4% i 55,3%,
natomiast najniŜszy – 48,2% w makrotubach metody A (kol. F).
Tabela 2. Jakość mroŜonego nasienia knurów według metody A i B (x±s; n=50)
Table 2. Quality of boars semen frozen according to method A and B (x±s; n=50)
30 minut po rozmroŜeniu
30 minutes after thawing
Metoda A
Metoda B
Method A
Method B
Ruch
Akrosomy
Ruch
Akrosomy
Motility
Acrosoms
Motility
Acrosoms
A
B
C
D
Makrotuby
Macrotubs
Słomki
płaskie
Flat straws
Kulki
Pellets
3 godziny po rozmroŜeniu
3 hours after thawing
Metoda A
Metoda B
Method A
Method B
Ruch
Akrosomy
Ruch
Akrosomy
Motility
Acrosoms
Motility
Acrosoms
E
F
G
H
17,2±5,54aA 54,9±6,66aA 26,2±9,4aB 60,6±3,98aB 10,1±4,1aC 48,2±5,62aC 18,3±5,85aD 53,5±6,61aA
24,8±7,69bA 61,7±5,3bA 32,4 ±9,22bB 63,1±5,13bB 16,0±5,34bC 55,3±5,26bC 25,1±6,02bA 56,4±4,99b
31,8±8,67cA 59,2±3,91cA 37,8±7,9cB 63,5±6,43bB 17,0±7,82bC 49,9±7,05cC 28,8±7,25cD 53,9±7,25cD
a,b,c
– średnie wartości w kolumnach z róŜnymi indeksami róŜnią się istotnie statystycznie (P< 0,01)
– values within columns with different superscripts differ (P<0.01)
A,B,C,D
- średnie wartości w wierszu z róŜnymi indeksami róŜnią się istotnie statystycznie (P< 0,01)
A,B,C,D
- values within line with different superscripts differ (P<0.01)
a,b,c
Wyniki 3 etapu badań prezentuje tabela 3. Po rozmroŜeniu próbek doświadczalnych
nr 1, 2, 3, 4, 5 ruch postępowy wykazywało, odpowiednio: 24,3; 38,6; 34,5; 23 i 22,3%
plemników. NajwyŜszy odsetek plemników o ruchu postępowym po rozmroŜeniu nasienia knurów stwierdzono w próbkach doświadczalnych nr 2 (38,6%) i nr 3 (34,5%), w
których dodawano odpowiednio: 4 i 6 µg dimeru lizozymu do 1 ml nasienia świeŜego.
W próbce kontrolnej bez dodatku dimeru, średnio 24,6% gamet wykazywało ruch postępowy (róŜnice istotne statystycznie, P<0,01) (tab. 3).
Odsetek normalnych akrosomów wynosił w próbce kontrolnej i w próbkach doświadczalnych plemników nr 1, 2, 3, 4, 5, odpowiednio: 63,07 oraz 62,47; 62,14; 63,34;
63,35; 62, 71%. Dodatek dimeru nie miał wpływu na morfologię plemników. Zarówno
Acta Sci. Pol.
Wpływ róŜnych metod ...
17
średnie wartości odsetka komórek o ruchu postępowym w próbkach nr 1, 4 i 5, jak i
wartość wskaźnika plemników z niezmienionym akrosomem we wszystkich próbkach
doświadczalnych, nie róŜniły się istotnie z analogicznymi wskaźnikami próbki kontrolnej.
Generalnie, w próbce doświadczalnej nr 2 i nr 3 z dodatkiem, odpowiednio: 4 i 6 µg
dimeru, stwierdzono istotnie wyŜsze, średnie wartości wskaźnika ruchliwości w stosunku do próbki kontrolnej po rozmroŜeniu słomek.
Tabela 3. Wpływ dimeru lizozymu na jakość mroŜonego nasienia knura (x±s; n=25)
Table 3. Effect of lysozyme dimer on the quality of deep frozen boar semen (x±s; n=25)
Próbka
Sample
StęŜenie lizozymu (µg/ml)
Concentracion of lysozyme
[µg/ml]
Ruchliwość plemników
Motility of spermatozoa
[%]
% plemników z normalnym akrosomem
Spermatozoa with normal acrosom
[%]
0
24,6±7,4
63,07±3,5
2
4
6
8
10
24,3±4,9
38,6±9,1*
34±5,4 *
23,0±4,5
22,3±6,5
62,42±2,9
62,14±2,4
63,34±2,4
63,35+-2,5
62,71±2,8
Kontrola
Control
1
2
3
4
5
* – średnie wartości w kolumnach oznaczone gwiazdką róŜnią się istotnie statystycznie (P< 0,05)
* – values within columns with small star differ (P<0.05)
DYSKUSJA
W badaniach nad mroŜeniem nasienia knura wykazano szczególną przydatność regularnej oceny ruchliwości rozmroŜonego nasienia knura w przewidywaniu i prognozowaniu potencjalnej zdolności zapładniającej plemników, w warunkach temperaturowych zbliŜonych do panujących w drogach rodnych samicy [Hammit i Martin 1987,
Larson i in. 1976]. Jedynym wskaźnikiem jakości zamroŜonego/rozmroŜonego nasienia
knura, który korelował istotnie (r = 0,32; p<0,05) z odsetkiem skutecznie unasiennionych loch, był odsetek plemników z nieuszkodzonym akrosomem [Almilida i in. 1989].
Czynniki, takie jak: grubość ścianki, średnica wewnętrzna oraz rodzaj tworzywa
sztucznego słomki mogły wywrzeć powaŜny wpływ na uzyskanie istotnie niŜszych
średnich wartości odsetka plemników o ruchu postępowym jak i z nieuszkodzonym
akrosomem mroŜonych w słomkach doświadczalnych w pierwszym etapie badań. Makrotuby doświadczalne posiadały o 100% grubszą ściankę oraz o 1 mm większą średnicę wewnętrzną. Powodem niŜszej jakości gamet mogło być z tego względu wolniejsze
tempo przewodzenia ciepła przez te ścianki oraz większa średnica słomek doświadczalnych. Dlatego czynniki te prowadziły zapewne do zwolnienia procesu zamraŜania i
rozmraŜania centralnie połoŜonych w tych opakowaniach warstw plemników. Powstające dzięki temu zmiany ciśnienia osmotycznego manifestowały się uzyskaniem w
ostatecznym efekcie niŜszych średnich wartości analizowanych właściwości nasienia.
W oparciu o dane światowego piśmiennictwa, uzyskane rezultaty średnich wartości
analizowanych wskaźników jakości nasienia ze słomek doświadczalnych zbliŜone są do
wyników badań innych autorów [Bwanga i in. 1990 a, Almlid i in. 1989, Fazano 1986].
Pomimo otrzymania niŜszych wskaźników słomek kontrolnych, nasienie uzyskane z
Medicina Veterinaria 1(2) 2002
18
W. Bielas
tych słomek spełnia minimalne normy jakości plemników. Dlatego wydaje się, Ŝe opakowania te mogą być wykorzystywane z powodzeniem w badaniach nad inseminacją
loch nasieniem mroŜonym.
Ocena jakości nasienia knura w drugim etapie badań własnych ujawniła, iŜ plemniki
konfekcjonowane w formie kulek według metodyki B cechowały się najwyŜszą średnią
wartością odsetka komórek o ruchu prawidłowym i z akrosomem niezmienionym. Przeciwnie, próbki pochodzące z makrotub metody A, cechowały się wartościami najniŜszymi w aspekcie analizowanych wskaźników jakości nasienia. Po trzech godzinach
testu oceniane próbki nasienia z metody B ponownie cechowały się wyŜszą jakością w
porównaniu z próbkami z metody A. Świadczy o tym uzyskana wyŜsza średnia wartość
wskaźnika ruchliwości i integralności akrosomów. Plemniki konfekcjonowane w makrotubach metody A ponownie cechowały się niŜszą jakością ocenianych wskaźników.
Plemniki konfekcjonowane w makrotubach są niedostatecznie chronione przed
ujemnym wpływem zmian temperatur zachodzących w procesie mroŜenia/rozmraŜania.
Mówią o tym zdecydowanie niŜsze, w porównaniu ze słomkami płaskimi i kulkami,
ostateczne wyniki średnich wartości wskaźników jakości nasienia konfekcjonowanego
w makrotubach zarówno według metody B, jak i metody A. Powodem tego moŜe być
odmienna szybkość zamraŜania i rozmraŜania centralnie i peryferyjnie połoŜonych
plemników znajdujących się w makrotubach – duŜych słomkach okrągłych [Baron
1986, Weitze i in. 1988]. Precedens ten manifestuje się na mniejszą skalę, jeŜeli proces
obniŜania temperatury sterowany jest komputerowo we wnętrzu specjalnego frezera
[Bwanga 1990 b, Simmet i in. 1993]. Jak wynika równieŜ z danych niniejszych badań,
uszkodzenia plemników knura, które powstają w czasie technologii zamraŜania/rozmraŜania nasienia, moŜna minimalizować przez konfekcjonowanie nasienia w
słomkach płaskich. W słomkach płaskich stosunek powierzchni do objętości jest 2 razy
większy, niŜ w makrotubach, odpowiednio: 19,6 i 8,14, dzięki czemu plemniki zamraŜane w opakowaniach płaskich mają lepszą jakość po rozmroŜeniu, niŜ konfekcjonowane w opakowaniach okrągłych o duŜej objętości [Leps 1988, Stampa 1989]. Budowa
słomek płaskich umoŜliwia bowiem skuteczne rozpraszanie i przyjmowanie ciepła w
czasie procesu zamraŜania oraz rozmraŜania próby nasienia. Wyniki badań własnych
potwierdzają dane przedstawione przez autorów, którzy notowali najlepszą ochronę
mroŜonych plemników knura konfekcjonowanych w słomkach płaskich [Leps 1988,
Stampa 1989, Simmet i in. 1993]. Wyniki badań własnych potwierdziły ponadto teorię
głoszącą, Ŝe najlepszą przeŜywalność komórek po rozmroŜeniu nasienia knura uzyskuje
się dzięki zastosowaniu duŜej szybkości schładzania w czasie zamraŜania plemników w
formie kulek na suchym lodzie w połączeniu z niskim stęŜeniem glicerolu [Polga i in.
1970]. Plemniki konfekcjonowane i zamraŜane w minisłomkach, minitubach oraz kulkach na suchym lodzie, bardzo szybko obniŜają swoją temperaturę wewnętrzną. DuŜa
powierzchnia tych opakowań, w stosunku do ich małej objętości, doprowadza do błyskawicznego uwalniania i rozpraszania ciepła krystalizacji powstającego w czasie wytrącania się kryształów lodu. Ciepło krystalizacji oddziałuje negatywnie na plemniki w
sposób wprost proporcjonalny do czasu trwania tego stanu. Odwrotne zjawisko obserwuje się w przypadku makrotub o duŜej objętości. ZamraŜana próbka nasienia ma w
tym przypadku duŜą objętość, a małą powierzchnię. ZamraŜanie takiego opakowania
inicjuje zaistnienie tzw. ciepła krystalizacji, prowadząc dzięki temu do gwałtownego
wzrostu temperatury mroŜonej próby. Jest to tzw. rebound effect – odbicie temperatury
zamraŜanego nasienia z powrotem do góry w kierunku 0 oC, a na krzywej zamraŜania
Acta Sci. Pol.
Wpływ róŜnych metod ...
19
moŜna dodatkowo zarejestrować w tym momencie – plateau krystalizacji trwające kilka
minut [Mazur 1985]. W wyniku wyŜej opisanego „efektu odbicia” oraz „plateau krystalizacji” po rozmroŜeniu nasienia z reguły notuje się niŜszą jakość plemników konfekcjonowanych i zamraŜanych w makrotubach w statycznych parach ciekłego azotu
[Baron 1986, Weitze i in. 1988].
Z uzyskanych wyników 3 etapu badań moŜna wnioskować, Ŝe dodatek dimeru lizozymu wywierał pozytywny wpływ na część wstawkową plemników. Świadczą o tym
prezentowane wysokie średnie wartości wskaźnika ruchliwości plemników (tab. 3).
Dimer lizozymu dodawano w niewielkich ilościach do nasienia knura, tuŜ po pobraniu
ejakulatu na fantomie. Następnie następował 2-godzinny etap inkubacji próbek nasienia
z dimerem w temperaturze pokojowej. Inkubacja nasienia knura po pobraniu jest bardzo
waŜna dla dalszego procesu konserwacji zarówno w stanie płynnym, jak i w niskich
temperaturach. W czasie przetrzymywania próbek nasienia w temperaturze pokojowej
zachodzą jeszcze nie do końca zbadane procesy, które polegają prawdopodobnie na
nadaniu plemnikom knura moŜności zachowania funkcji Ŝyciowych poniŜej 15 oC [Tamuli i Watson 1994]. Udowodniono, iŜ świeŜo ejakulowane plemniki knura nie przeŜywają nagłego obniŜenia temperatury otoczenia poniŜej 15 oC [Pursel i in. 1973]. Niektórzy autorzy [Watson i Plummer 1985] są zdania, Ŝe komórki płciowe knura mogą
przetrwać z powodzeniem schładzanie poniŜej 15 oC, pod warunkiem, Ŝe są przetrzymywane kilka godzin w temperaturze pokojowej oraz w bardzo wolnym tempie oziębiane poniŜej temperatury 20 oC. Molekuły dimeru lizozymu mogły w niniejszych badaniach oddziaływać na błony komórkowe plemników knura lub na substancje zawarte
w plazmie nasienia przez około 2–3 godziny inkubacji w temperaturze pokojowej bezpośrednio po pobraniu ejakulatu i sporządzeniu próbek.
Zgodnie z opinią Glogowskiego i StrzeŜeka [1986] zasadowe, „cynkozaleŜne” białka zawarte w plazmie nasienia większości knurów, posiadają zdolność precypitacji
cząsteczek Ŝółtka jaja kurzego, dzięki czemu lipoproteiny Ŝółtka nie opłaszczają plazmolemmy plemników i nie chronią jej dostatecznie przed skutkami szoku chłodowego.
Częściowym rozwiązaniem tego problemu była eliminacja plazmy nasienia przez wirowanie oraz dodawanie do pozostawionego osadu plemników rozrzedzalników zawierających Ŝółtko jaja kurzego wraz z substancjami obniŜającymi ujemne oddziaływania
szoku chłodowego i niskotemperaturowego.
W stosowanych aktualnie technologiach mroŜenia nasienia knura, nieodzowne jest
dodawanie do rozrzedzalników takich substancji, jak glicerol, Orvus Es Paste, czy wersenian sodu w celu zachowania po rozmroŜeniu, jak największej liczby plemników
zdolnych do zapłodnienia komórki jajowej [Pursel i in. 1978, Bwanga 1990 b].
W publikacjach na temat mroŜenia gamet knura, znajdują się opisy doświadczeń polegających na dodawaniu róŜnych substancji do nasienia lub do rozrzedzalników w celu
osiągnięcia poprawy jakości plemników po rozmroŜeniu, np. katalazy, kofeiny, witaminy E, selenu, glicerofosfocholiny, peptonu, polivinylpirolidonu, baclanoside, chloroquine, hydroksytoluenu butylowego, DMSO (di – metylo – sulfo – tlenku) oraz kwasu
sjalowego [Bwanga 1990 b, Watsona 1995].
W badaniach nad zastosowaniem wymienionych związków w technologiach konserwacji gamet knura w niskich temperaturach, usiłowano wykazać wpływ tych substancji na mroŜone plemniki. Ze względu na dalsze zapotrzebowanie na tego typu badania, wydawało się nieodzowne przeprowadzenie podobnych prac w celu określenia
wpływu dimeru lizozymu na mroŜone plemniki knura. Ponadto, waŜnym czynnikiem
Medicina Veterinaria 1(2) 2002
20
W. Bielas
przemawiającym za podjęciem przeprowadzenia niniejszych badań, były prace Dubiela
i in. [2000] oraz NiŜańskiego i in. [2000] poświęcone zagadnieniu oceny wpływu dimeru lizozymu na jakość mroŜonego nasienia ogiera i psa. NiŜański i in. [2000] wykazali,
iŜ dodatek dimeru w ilości od 10 do 15 µg/ml ekwilibrowanego i rozrzedzonego nasienia, wywierał korzystny wpływ na jakość rozmroŜonych plemników psa w aspekcie
ruchliwości i integralności akrosomów w ujęciu statystycznym. Dubiel i in. [2000]
stwierdzili, iŜ dodanie od 4 do 10 µg dimeru na ml świeŜego nasienia ogiera powodowało istotny statystycznie wzrost odsetka plemników o ruchu prawidłowym, niŜsze
straty akrosomów oraz niŜsze wycieki AspAT z komórek po rozmroŜeniu. W bieŜących
badaniach wykazano natomiast pozytywne oddziaływanie suplementacji dimeru lizozymu na stabilność błony komórkowej plemnika w regionie wstawki, co przejawiało się
uzyskaniem istotnie wyŜszego odsetka komórek ruchliwych po rozmroŜeniu próbek.
Jedną z przesłanek prowadzących do zastosowania dimeru lizozymu w niniejszych
badaniach, były równieŜ prace opisujące pomyślne zastosowania tego związku w formie
skutecznego specyfiku w lecznictwie weterynaryjnym [Garbuliński 1994]. Poznane juŜ
właściwości dimeru lizozymu to działanie immunomomodulacyjne polegające na
wzmocnieniu naturalnych mechanizmów obronnych Ŝywego organizmu. Dimer lizozymu stymuluje aktywność komórek Ŝernych aktywując fagocytozę, a ponadto wzmaga
produkcję interferonu alfa oraz moduluje syntezę czynnika nekrotyzującego nowotwory
TNF. Odznacza się równocześnie bardzo małą toksycznością. Związek ten jest zdimeryzowaną formą lizozymu otrzymywanego z białka jaja kurzego [Kiczka 1994].
Wyniki w 3 etapie badań własnych informują, iŜ niewielki dodatek dimeru lizozymu
spowodował poprawę ruchliwości plemników po rozmroŜeniu próbek. Opisanemu
istotnemu wzrostowi wskaźnika jakości nasienia nie towarzyszył jednak wzrost wartości wskaźnika niezmienionych akrosomów.
WNIOSKI
1. Słomki doświadczalne mogą być wykorzystywane w badaniach nad inseminacją
loch nasieniem mroŜonym, poniewaŜ porozmroŜeniowa jakość konfekcjonowanych w
nich plemników knura spełnia minimalne wymagania.
2. Nasienie knura konfekcjonowane i mroŜone w formie kulek i słomek płaskich
według zmodyfikowanej metody Pursela i Parka, charakteryzuje się jakością upowaŜniającą do rekomendowania wymienionej metody i formy konfekcjonowania do badań
nad inseminacją loch nasieniem mroŜonym.
3. Dimer lizozymu dodany do świeŜego nasienia knura w ilości 4 lub 6 µg na 1 ml
wpływa korzystnie na wstawkowy aparat ruchu plemników konfekcjonowanych w
słomkach płaskich i zamraŜanych w statycznych parach ciekłego azotu.
PIŚMIENNICTWO
Almlid T., Stavne S.E., Johnson L.A., 1987. Fertility evaluation of the straw freezing technique
for boar semen under practical artificial insemination conditions. Zuchthyg. 22, 193–202.
Almlid T., Clark R.N., Pursel V.G., Johnson L.A., 1989. Effectiveness of in vitro methods for
predicting in vivo fertilizing capacity of boar spermatozoa cryopreserved with 2% or 4% glicerol. Zuchthyg. 24, 8–15.
Acta Sci. Pol.
Wpływ róŜnych metod ...
21
Baron G. 1986. Tiefgefrierung von Ebersamen in Kunststoffrohren in Vitro Untersuchungen zum
Einfluss zweiter Konfektioierungsformen und verschiedener Einfrier und Auftaugeschwindigkeiten. Praca dokt. Tierärztl. Hochsch. Hannover.
Bwanga C.O., Einarsson S., Rodriguez-Martinez H., 1990 a. Cryopreservation of boar semen in
mini and maxi - straws. J. Vet. Med. A. 37, 651–658.
Bwanga C.O.: 1990 b., Cryopreservation of boar semen. A Literature review. Acta Vet. Scand.
32, 431–453.
Dubiel A., Bielas W., NiŜański W., 2000. The effect of Lysozyme dimer (KLP-602) on stallion
spermatozoa depending on method of preservation at low temperatures. Proc.14th Internat.
Congr. Animal Reprod., Stockholm, 2–6 July, Abstracts t. 2, s. 149.
Einarsson S., Viring S., 1973. Distribution of frozen thawed spermatozoa in the reproductive tract
of gilts at different time intervals after insemination. J. Reprod. Fert. 32, 117–120.
Fazano F.A.T., 1986 Zur Kryokonservierung von Ebersperma: Verschiedene Verfahren zur
Samenbehandlung und unterschiedliche Konfektionierungsmethoden unter besonderer Berücksichtigung der Einfriergeschwindigkeit. Praca dokt. Tierärztl. Hochsch. Hannover
Garbuliński T., 1994. Lydium –KLP w farmakoterapii weterynaryjnej. śycie Wet. 69, 137–138.
Glogowski J., StrzeŜek J., 1986. Badania nad składem rozcieńczalnika do mroŜenia nasienia
knura. ZaleŜność pomiędzy białkami plazmy nasienia knura i lipoproteinami Ŝółtka jaja kurzego. Zesz. Probl. Post. Nauk Rol. 263, 241–253.
Hammit D.G., Martin P.A. 1989. Correlations among assays of porcine seminal quality following
cryopreservation. Theriogenol. 32, 369–384.
Kiczka W., 1994. Od monomeru do dimeru lizozymu. śycie Wet., 69, 131–136.
Larson K., Einarsson S., Nicander L., 1976. Influence of thawing diluents on vitality, acrosome
morphology, ultrastructure and enzyme release of deep frozen boar spermatozoa. Acta Vet.
Scand. 17, 83 –100.
Leps H.J., 1988. Zur Kryokonservierung von Ebersperma; Einfluss verschiedener Konfektionierungsarten, insbesondere von Flachbehältnissen auf Gefrier – und Auftauqualitat. Praca dokt.,
Tierärztliche Hochschull, Hannover.
Mazur P. 1985. Basic concepts in freezing cells. [w:] Proc. 1st. Int. Conf. Deep Freezing of Boar
semen. (Red). Johnson L.A., Larsson K., Svedish Univ. Agric. Sci., Uppsala, . 91–111.
NiŜański W., Dubiel W., Bielas W., 2000. Effect of lysozyme dimer on the quality of deep Frozen
dog semen. Proc. 14th Internat. Congr. Animal Reprod., Stockholm 2–6 July, Abstracts t. 2,
164.
Polge C., 1956. Artificial insemination in pigs. Vet. Rec. 62–76.
Polge C., Salamon S., Wilmut J.. 1970. Fertilizing capacity of frozen boar spermatozoa following
surgical insemination. Vet. Rec. 87, 424–428.
Pursel V.G., Johnson L.A., Schulman L.L., 1973. Effect of dillution, seminal plasma, and incubation period on cold shock susceptibility of boar spermatozoa. J. Anim. Sci. 37, 528–531.
Pursel V.G., Johnson L.A., 1975. Freezing of boar spermatozoa: Fertilizing capacity with concentrated semen and a new thawing procedure. J. Aim. Sci. 40, 99–102.
Pursel V.G., Schulman L.L., Johnson L.A., 1978. Effect of Orvus-Es paste on acrosome morphology, motility and fertilizing capacity of frozen-thawed boar sperm. J. Anim. Sci. 47, 198–202.
Pursel V.G., Park C.S., 1987. Duration of thawing on post acrosome morphology and motility of
boar spermatozoa frozen in 5 ml maxi-straws. Theriogenol. 28, 683–690.
Simmet C., Gall T., Waberski D., Weitze K.F., 1993., Fertility of boar semen frozen in flat straws
and macrotubes. Reprod. Dom. Anim. Suppl. 2, 87.
Stampa E., 1989. Befruchtungsfähikeit von tiefgefroren Ebersperma; Einfluss von Konfektionierung, Besamungshäufigkeit und Seminaplasma. Praca dokt. Tierärztliche Hochschull, Hannover.
Medicina Veterinaria 1(2) 2002
W. Bielas
22
Tamuli M.K., Watson P.F., 1994. Cold resistance of live boar spermatozoa during incubation
after ejaculation. Vet. Rec. 13, 160–162.
Watson P.F., Plummer J.M., 1985. The responses of boar sperm membranes to cold shock and
cooling. [w:] Proc. Ist. Conf. Deep Freezing of Boar Semen. (Red). Johnson L.A., Larsson K.,
Swedish Univ. Agric. Sci., Uppsala, 113–125.
Watson P.F., 1995. Recent developments and concepts in the cryopreservation of spermatozoa
and the assessment of their post – thawing function. Reprod. Fert. Develop. 7, 871–891.
Weitze K.F., Rath D., Leps H., 1988. Influence of volume/surface ratio of plastic packages upon
freeze - thaw rates and fertility of boar semen. [w:] Proc. XIth Congr. Anim. Reprod.and A.I.
Dublin, 3, 12.
Westendorf P., Richter L., Treu H., 1975. Zur Tiefgefrierung von Ebersperma. Labor und Besamungsergebnisse mit dem Hulsenberger Pailletten – verfahren. Dt. Tierärztl. Wschr. 82, 261–
300.
EFFECT OF DIFFERENT FREEZING METHODS
ON THE QUALITY OF BOAR SPERMATOZOA
Abstract: Investigation was aimed to choose the optimal freezing technique and to estimate the effect of addition of dimer of lysozyme on the quality of deep frozen boar spermatozoa. The investigations were carried out on 115 ejaculates. Semen was frozen in
large, flat straws and pellets. The highest quality of boar semen after thawing was observed in semen processed and frozen according to Pursel and Park method in the form of
pellets and flat straws. Significantly higher motility and intact acrosomes was observed
in the samples where 4 and 6 µg dimer of lysozyme was added.
Key words: freezing, semen, boar, straws, pellets, lysozyme
Wiesław Bielas, Katedra Rozrodu Zwierząt i Klinika PołoŜnicza, Akademia Rolnicza we Wrocławiu , Pl. Grunwaldzki 49, 50–366 Wrocław
Acta Sci. Pol.