Pozyskiwanie i ulepszanie szczepów przemysłowych.

BIOTECHNOLOGIA OGÓLNA
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Wprowadzenie do biotechnologii.
Rys historyczny. Zakres i znaczenie nowoczesnej
biotechnologii. Opracowanie procesu biotechnologicznego.
Pozyskiwanie i ulepszanie szczepów przemysłowych.
Pozyskiwanie drobnoustrojów. Ulepszanie szczepów na
drodze mutagenizacji. Metody selekcji szczepów. Podstawy
hybrydyzacji drobnoustrojów. Technologia rekombinacji DNA.
Przechowywanie szczepów
Warunki prowadzenia bioprocesów.
Sposoby prowadzenia procesów mikrobiologicznych.
Biokatalizatory. Bioreaktory.
Charakterystyka drobnoustrojów przemysłowych.
Wymagania pokarmowe. Degradacja związków
wielkocząsteczkowych. Centralne przemiany metaboliczne.
Wzrost drobnoustrojów przemysłowych.
7.
8.
9.
10.
Biotechnologia w przemyśle spożywczym.
Produkcja probiotyków. Produkcja kwasu mlekowego.
Nadprodukcja wybranych produktów metabolizmu.
Biosynteza i nadprodukcja aminokwasów.
Produkcja kwasów organicznych.
Fermentacja etanolowa
Biotechnologia w przemyśle farmaceutycznym.
Biotechnologia antybiotyków. Produkcja szczepionek.
Insulina. Leki nowej generacji.
11.
12.
Literatura
spis wykładów
Produkcja biomasy.
Białko mikrobiologiczne.
Procesy biotransformacji.
Biotransformacja związków steroidowych.
Biotransformacja antybiotyków.
Bioługowanie metali.
1
Pozyskiwanie i ulepszanie szczepów przemysłowych.
Przy wyborze mikroorganizmu dla danego procesu technologicznego
uwzględniane są następujące kryteria:
1. Charakterystyka odżywiania mikroorganizmu. Często wymagane jest aby w procesie technologicznym
mogły być stosowane tanie media. W niektórych przypadkach substrat jest z góry określony (np. metanol,
serwatka).
2. Optimum temperatury. Wykorzystanie mikroorganizmów, dla których optymalna temperatura jest wyższa
niż 40°C redukuje koszty chłodzenia w aparatach przemysłowych. Im wyższa dopuszczalna temperatura
wewnątrz reaktora, tym większa różnica temperatur między medium i czynnikiem chłodzącym, co umożliwia
zmniejszenie ilości czynnika chłodzącego.* Ponadto prowadzenie hodowli drobnoustrojów w podwyższonych
temperaturach zmniejsza ryzyko zakażenia organizmami szkodliwymi.
3. Zdolność mikroorganizmu do wzrostu w aparaturze przemysłowej, odporność na typ procesu i
stosowane materiały.
4. Stabilność cech drobnoustrojów i odporność na manipulacje genetyczne.
5. Produkcyjność, tzn. zdolność przetwarzania substratu w produkt z wysoką wydajnością, liczona w
jednostce czasu.
6. Łatwość wydzielenia produktu z medium pofermentacyjnego.
7. Brak toksycznych produktów metabolizmu.
Ponadto, należy uwzględniać takie cechy mikroorganizmów, które ułatwiają prowadzenie procesów
technologicznych. Należą do nich:
1. odporność na infekcje,
2. własności niepieniące mediów hodowlanych,
3. odporność na niektóre składniki substratu pochodzenia naturalnego,
4. odporność na niskie stężenie rozpuszczonego tlenu (dla mikroorganizmów aerobowych).
2
spis wykładów
Pozyskiwanie i ulepszanie szczepów przemysłowych.
Pozyskanie drobnoustrojów ze środowiska
Wyróżniamy cztery zasadnicze etapy:
1.Wybór miejsca i pobranie próbek
2.Wstępna obróbka próbek
3.Namnażanie drobnoustrojów i selekcja czystych kultur
4.Testowanie przydatności wyizolowanych szczepów do wytwarzania określonych
produktów
W celu zwiększenia koncentracji interesujących nas mikroorganizmów stosuje
się:
1.Oddziaływanie na środowisko przed pobraniem próby
2.Wprowadzenie do środowiska wabików
3.Wstępną obróbkę fizyczną lub mechaniczną próby
4.Hodowlę wzbogacającą
3
spis wykładów
Pozyskiwanie i ulepszanie szczepów przemysłowych.
Izolacja szczepów przemysłowych
W Polsce istnieje wiele kolekcji czystych kultur, o różnym zakresie i wielkości. Do najważniejszych
z punktu widzenia technologii biochemicznej, należą: kolekcja Instytutu Biotechnologii
Przemysłu Rolno- Spożywczego w Warszawie, kolekcja Wydziału Chemii i Technologii
Żywności Politechniki Łódzkiej oraz kolekcja Akademii Techniczno-Ekonomicznej we
Wrocławiu. Te trzy kolekcje są zarejestrowane w Światowej Federacji Kolekcji Kultur
(WFCC).
4
spis wykładów
Pozyskiwanie i ulepszanie szczepów przemysłowych.
5
spis wykładów
Pozyskiwanie i ulepszanie szczepów przemysłowych.
Podstawową metodą izolacji czystych kultur jest metoda rozcieńczenia ich populacji:
w roztworze NaCl
w roztworze Ringera
w odpowiednim podłożu
Inne metody izolacji:
środki chemiczne – detergenty
środki fizyczne – flotacja, filtracja, sedymentacja, wirowanie
6
spis wykładów
Pozyskiwanie i ulepszanie szczepów przemysłowych.
metoda posiewu powierzchniowego
7
spis wykładów
Pozyskiwanie i ulepszanie szczepów przemysłowych.
posiew redukcyjny
8
spis wykładów
Pozyskiwanie i ulepszanie szczepów przemysłowych.
Drobnoustroje pozyskane ze środowiska
naturalnego prowadzą procesy biosyntezy lub
biotransformacji
z wydajnością nie wystarczającą zazwyczaj do
opracowania ekonomicznego procesu
technologicznego
Zwiększenie aktywności metabolicznej i
podwyższenie wydajności danego szczepu jest
możliwe tylko w granicach określonych
genotypem.
Metody ulepszania drobnoustrojów
KLASYCZNE:
NOWOCZESNE:
1.
2.
3.
4.
5.
1. Technologia rekombinacji
DNA
Mutacja
Selekcja
Adaptacja
Hybrydyzacja naturalna
Fuzja protoplastów
9
spis wykładów
Pozyskiwanie i ulepszanie szczepów przemysłowych.
Mutacja – nagłe, skokowe zmiany materiału genetycznego, możliwe dziedziczenie
• mutant – osobnik o zmienionym genotypie
• mutageneza – proces prowadzący do jego powstania
Mutacje za względu na charakter powstania
mutacje
spontaniczne
(10-4 – 10-11)
indukowane
(czynniki
mutagenne)
10
spis wykładów
Pozyskiwanie i ulepszanie szczepów przemysłowych.
Mutacje za względu na wielkość zmian zachodzących z DNA
11
spis wykładów
Pozyskiwanie i ulepszanie szczepów przemysłowych.
Mutacje za względu na powstałą zmianę
mutacje
substytucja
tranzycja
insercja
delecja
transwersja
12
spis wykładów
Pozyskiwanie i ulepszanie szczepów przemysłowych.
Delecja
G
A GGTAA C AGT C A TAGT A TAC
A GGTAA C A T C A TAGT A TAC
13
spis wykładów
Pozyskiwanie i ulepszanie szczepów przemysłowych.
Insercja
G
A GGTAA C AGT C A TAGT A TAC
A GGTAA C AG G T C A TAGT A TAC
14
spis wykładów
Pozyskiwanie i ulepszanie szczepów przemysłowych.
Substytucja - tranzycja
A
T
G
C
A C GTAA C AGT C A TAAT A TAC
T G CAT T G T CAG T AT TA T ATG
A C GTAG C AGC C A CAGT A TAC
T G CAT T G T CAG T AT TA T ATG
15
spis wykładów
Pozyskiwanie i ulepszanie szczepów przemysłowych.
Substytucja - transwersja
A
T
T
G
A C GTAA C AGT C A TAAT A TAC
T G CAT T G T CAG T AT TA T ATG
A C GTAT C AGC C AGAGT A TAC
T G CAT T G T CAG T AT TA T ATG
16
spis wykładów
Pozyskiwanie i ulepszanie szczepów przemysłowych.
Czynniki mutagenne
czynniki
chemiczne
czynniki
biologiczne
czynniki fizyczne
17
spis wykładów
Pozyskiwanie i ulepszanie szczepów przemysłowych.
18
spis wykładów
Pozyskiwanie i ulepszanie szczepów przemysłowych.
Zalety promieniowania UV
19
spis wykładów
Pozyskiwanie i ulepszanie szczepów przemysłowych.
Fotoreaktywacja
28
spis wykładów
Pozyskiwanie i ulepszanie szczepów przemysłowych.
Naprawa DNA
29
spis wykładów
Pozyskiwanie i ulepszanie szczepów przemysłowych.
Etapy procesu mutagenizacji
1. Penetracja mutagenu do komórki
2. Jego oddziaływanie na DNA, w wyniku czego zachodzą niestabilne zmiany
pierwotne
3. Naprawa uszkodzeń pierwotnych z możliwością zajścia trwałych zmian
wtórnych w strukturze DNA
4. Stabilizacja mutacji, powodująca utrzymywanie się uszkodzeń DNA w
kolejnych pokoleniach komórek
5. Zmiany biochemiczne w komórce i fenotypowe ujawnienie się mutacji
30
spis wykładów
Pozyskiwanie i ulepszanie szczepów przemysłowych.
Kierunki i zmiany genotypu w wyniku mutagenezy
31
spis wykładów
Pozyskiwanie i ulepszanie szczepów przemysłowych.
32
spis wykładów
Pozyskiwanie i ulepszanie szczepów przemysłowych.
Metoda penicylinowa
36
spis wykładów
Pozyskiwanie i ulepszanie szczepów przemysłowych.
Hybrydyzacja
Hybrydyzacja naturalna
Hybrydyzacja somatyczna
1. Fuzja protoplastów – komórki
całkowicie pozbawione ściany
komórkowej
2. Fuzja sferoplastów – komórki
częściowo pozbawione ściany
komórkowej
37
spis wykładów
Pozyskiwanie i ulepszanie szczepów przemysłowych.
Hybrydyzacja naturalna – przekazanie informacji genetycznej z komórek dawcy do komórek
biorcy w wyniku fizycznego kontaktu obu komórek
• polega na wymianie homologicznych fragmentów DNA między chromosomami dawcy i biorcy
• w wyniku rozdzielenia materiału genetycznego w komórkach potomnych otrzymuje się
hybrydy o zmienionym genotypie
• warunkiem koniecznym jest bliskie pokrewieństwo filogenetyczne organizmów
• naturalna hybrydyzacja zachodzi bardzo rzadko !!!
Podstawowa przeszkoda:
• ściana komórkowa
• ujemny potencjał po zewnętrznej stronie błony cytoplazmatycznej
38
spis wykładów
Pozyskiwanie i ulepszanie szczepów przemysłowych.
Fuzja protoplastów – (1972 r.) polega na połączeniu dwóch komórek różnych szczepów
mikroorganizmów, całkowicie lub częściowo pozbawionych ściany komórkowej
• duża częstotliwość rekombinacji (10-20% komórek)
• rekombinacja pomiędzy szczepami o tym samym typie płciowym
• rekombinacja międzygatunkowa
• możliwość wymiany dużych fragmentów DNA
• każda z hybrydyzujących komórek może pełnić rolę dawcy i biorcy
• możliwość fuzji protoplastów z liposomami zawierającymi obcy materiał genetyczny
39
spis wykładów
Pozyskiwanie i ulepszanie szczepów przemysłowych.
Przygotowanie protoplastów
•
•
enzymatyczna hydroliza ściany komórkowej
•
bakterie G+ i promieniowce - lizozym
•
grzyby – sok żołądkowy ślimaka Helix pomatia
wymaga środowiska hipertonicznego
•
•
•
0,8-1,2M sorbitol
0,6M KCl
stosowanie czynników zwiększających efektywność procesu
• 30% glikol polietylenowy
• jony wapnia
40
spis wykładów
Pozyskiwanie i ulepszanie szczepów przemysłowych.
41
spis wykładów
Pozyskiwanie i ulepszanie szczepów przemysłowych.
Fuzja protoplastów
Najczęściej stosowana metoda do dalszego ulepszania szczepów pochodzących z
różnych linii mutacyjnych
•
•
•
•
•
•
•
zwiększenie wydajności produkcji
zmiana wymagań pokarmowych
ograniczenie wytwarzania produktów ubocznych
zwiększenie szybkości wzrostu
zmiana przyswajalności różnych substratów
zwiększenie oporności na substancje toksyczne
zwiększenie oporności na bakteriofagi
42
spis wykładów
Pozyskiwanie i ulepszanie szczepów przemysłowych.
Koniugacja – proces transferu genów polegający na bezpośrednim przekazywaniu
DNA z komórek dawcy do komórek biorcy wskutek ich bezpośredniego kontaktu za
pośrednictwem pilusów (mostków cytoplazmatycznych)
Transformacja – przekazywanie cech genetycznych komórkom biorcy, z
pominięciem łączenia w pary, poprzez DNA uwolniony do środowiska z komórek
dawcy.
Transdukcja – proces wprowadzenia nowego genu do komórki poprzez tzw. fagi
łagodne
43
spis wykładów
Pozyskiwanie i ulepszanie szczepów przemysłowych.
Schemat trzech głównych mechanizmów wymiany informacji genetycznej między bakteriami.
Dany gen jest przenoszony z komórki dawcy do biorcy przez: a) transformację wyizolowanego
DNA; b) transdukcję za pośrednictwem wektora bakteriofaga; c) koniugację, czyli rekombinację
płciową polegającą na połączeniu dwóch komórek bakteryjnych
44
spis wykładów
Pozyskiwanie i ulepszanie szczepów przemysłowych.
Koniugacja
45
spis wykładów
Pozyskiwanie i ulepszanie szczepów przemysłowych.
Transformacja
46
spis wykładów
Pozyskiwanie i ulepszanie szczepów przemysłowych.
Transformacja
47
spis wykładów
Pozyskiwanie i ulepszanie szczepów przemysłowych.
Transdukcja
48
spis wykładów
Pozyskiwanie i ulepszanie szczepów przemysłowych.
Zarys technologii rekombinacji DNA
49
spis wykładów
Pozyskiwanie i ulepszanie szczepów przemysłowych.
Zamrażanie drobnoustrojów
Czynniki ochronne:
• zawierające białka: mleko, bulion, żelatyna, serwatka
• zawierające sacharydy: glukoza, sacharoza, laktoza
• zawierające aminokwasy: kwas asparaginowy, kwas
glutaminowy
• substancje polimerowe: hydroksyetyloskrobia (HES)
• alkohole polihydroksylowe: glicerol, mannitol,
sorbitol, glikol polietylenowy
• inne: dimetylosulfotlenek (DMSO)
57
spis wykładów
Pozyskiwanie i ulepszanie szczepów przemysłowych.
Suszenie sublimacyjne
Rys. 1. Wykres fazowy wody z punktem potrójnym:
P – woda destylowana (T = 0,01 °C; P = 610 Pa ), P' – rzeczywisty roztwór wodny
58
spis wykładów
Pozyskiwanie i ulepszanie szczepów przemysłowych.
Suszenie sublimacyjne
59
spis wykładów
Pozyskiwanie i ulepszanie szczepów przemysłowych.
Szybkość liofilizacji zależy od:
• grubości warstwy materiału (suchego i zamrożonego)
• przewodnictwa cieplnego materiału (suchego - małe - często ogranicza szybkość sublimacji,
zamrożonego - duże)
• temperatury warstwy wysuszonej (uwarunkowana termostabilnością materiału (zwykle 4075°C)
• temperatury frontu sublimacji (najlepiej jak największa, zwykle od -15 do -45°C)
• temperatury kondensatora (najlepiej jak najmniejsza, ale ekonomiczna)
• sposobu zamrożenia surowca
• ciśnienia podczas liofilizacji (0,1 - 2 mm Hg)
60
spis wykładów
Pozyskiwanie i ulepszanie szczepów przemysłowych.
Zalety procesu:
• wilgoć usuwana w niskich temperaturach wyklucza inaktywację termiczną produktu
• zachowana jest struktura materiału suszonego
• praktycznie wyeliminowane jest usuwanie lotnych składników suszonego materiału, lub naruszenie
jego składu chemicznego
• ułatwiona możliwość otrzymywania sterylnego produktu
Wady procesu:
• złożona aparatura i jej oprzyrządowanie
• długi czas trwania procesu
• wysokie zapotrzebowanie na energię
61
spis wykładów