rgs02 - Amplicon

Reference gene set
Homo sapiens (Sybr® Green)
Zestaw starterów dla genów referencyjnych
dla Homo sapiens
Nr kat.: RGS02
Technika detekcji: barwnik interkalujący Sybr® Green)
Amplicon sp. z o. o. ul. Duńska 9 54-427 Wrocław Polska, NIP: 8943052339, KRS: 0000501830
www.amplicon.pl email: [email protected], tel. +48 71 733 67 06, fax +48 71 733 67 24
OPIS ZESTAWU
Reference gene set Homo sapiens (Sybr® Green) zawiera zestaw dziesięciu roztworów starterów
służących do amplifikacji transkryptów genów referencyjnych dla Homo sapiens. Zestaw
umożliwia określenie stabilności ekspresji wybranych genów referencyjnych w określonych
warunkach eksperymentalnych oraz ustalenie względnego poziomu ekspresji genów
docelowych (ang. target genes). Materiałem wyjściowym do analizy powinny być preparaty RNA
wolne od zanieczyszczeń w postaci genomowego DNA. Geny referencyjne zostały dobrane na
podstawie publikacji oraz danych z mikromacierzy wskazujących na dużą stabilność ich
ekspresji w różnych warunkach eksperymentalnych.
SKŁAD ZESTAWU
Nazwa
Ilość
Kolor wieczka
Bufor TE, pH 8,0
2 × 1,5 mL
Biały
Startery HsACTB
50 µL
Czerwony
Startery HsGAPDH
50 µL
Czerwony
Startery HsB2M
50 µL
Czerwony
Startery HsYWHAZ
Startery HsSURF1
50 µL
Czerwony
50 µL
Czerwony
Startery HsPGK1
50 µL
Czerwony
Startery HsGUSB
50 µL
Czerwony
Startery HsHPRT1
50 µL
Czerwony
Startery HsPPIH
50 µL
Czerwony
Startery HsTUBB
50 µL
Czerwony
Każdy z roztworów starterów zawiera mieszaninę dwóch starterów: lewego i prawego. Roztwory
są 40-krotnie stężone. Do reakcji o objętości 20 µL należy dodać 0,5 µL roztworu starterów. W
celu uniknięcia manipulowania małymi objętościami roztwory starterów można rozcieńczyć 4krotnie dodając po 150 µL buforu TE pH 8,0 załączonego do zestawu. Po rozcieńczeniu należy
stosować 2 µL roztworu startera na 20 µL końcowej objętości reakcji.
W skład buforu TE, pH 8,0 wchodzą: 10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 0,1 mM EDTA pH 8,0.
TRANSPORT i PRZECHOWYWANIE
 Transport odbywa się w warunkach obniżonej temperatury (0-8°C). Po otrzymaniu przesyłki
należy ją natychmiast rozpakować.
 Roztwory starterów przechowywać w -20°C.
 Unikać wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania roztworów starterów.
2
60
2597
567
7534
6834
5230
2990
3251
10465
203068
HsGAPDH
HsB2M
HsYWHAZ
HsSURF1
HsPGK1
HsGUSB
HsHPRT1
HsPPIH
HsTUBB
ID genu
HsACTB
Startery
3
* Numery katalogowe starterów przy zakupie poza zestawem.
tubulin beta class I
NM_001293212
NM_001330510
RGS02-10
RGS02-09
RGS02-08
NM_000194
hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1
peptidylprolyl isomerase H
RGS02-07
RGS02-06
NM_000181
NM_000291
RGS02-05
RGS02-04
RGS02-03
RGS02-02
RGS02-01
Nr kat.*
glucuronidase beta
phosphoglycerate kinase
NM_001280787
NM_001135699
tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan
5-monooxygenase activation protein zeta
cytochrome c oxidase assembly factor
NM_004048
NM_001256799
NM_001101
Nr sekwencji
beta-2-microglobulin
glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
actin beta
Nazwa genu
OPIS STARTERÓW
REAKCJA REAL TIME PCR
1. Przygotować mieszaniny reakcyjne
Na jedną reakcję Real Time PCR w objętości 20 µL dodawać 0,5 µL danego roztworu
starterów. W przypadku 4-krotnego rozcieńczenia roztworu buforem TE pH 8,0 na jedną reakcję
o objętości 20 µL należy dodawać 2 µL roztworu starterów.
2. Reakcje Real Time PCR wykonać według następującego protokołu:
Denaturacja wstępna
95°C 5 min
95°C 10 s
Amplifikacja (35 cykli)
58°C 10 s
72°C 20 s*
Schłodzenie aparatu
30-40°C 30s (zależnie od typu aparatu)
*Na końcu tego etapu ustawić odczyt fluorescencji w kanale odpowiednim dla SYBR® Green.
UWAGI DODATKOWE
Na jakość reakcji Real Time PCR ma wpływ wiele czynników. Najważniejsze z nich to:
 specyficzność starterów;
Startery powinny wykazywać dużą specyficzność względem matrycy i nie powinny zawierać
regionów wzajemnie do siebie komplementarnych. Dzięki temu w reakcji nie będą powstawać
niespecyficzne produkty PCR i produkty typu „primer-dimer”. Startery wchodzące w skład zestawu
zaprojektowano tak, aby spełniały powyższe wymogi.
 jakość miksu do Real Time PCR;
Odczynniki do Real Time PCR (na ogół 2-krotnie stężone miksy zawierające wszystkie niezbędne
składniki reakcji) różnych producentów mogą różnić się od siebie rodzajem użytej polimerazy DNA,
stężeniem jonów Mg2+, fluoroforu SYBR® Green, obecnością środków zwiększających
specyficzność reakcji itp. Te różnice mogą istotnie wpływać na przebieg reakcji Real Time PCR i
jej jakość.
 czas i temperatura przygotowania reakcji.
Czynności związane z przygotowaniem reakcji Real Time PCR powinny być przeprowadzone w
możliwie jak najkrótszym czasie. Stosowane odczynniki oraz probówki reakcyjne powinny
pozostawać schłodzone do 0-8°C.
Proponowane postępowanie przy uzyskaniu niesatysfakcjonujących wyników:
 Obecność produktów typu „primer-dimer” i innych niespecyficznych produktów reakcji:
Zmień producenta miksu do Real Time PCR. Użyj miksu zawierającego polimerazę typu Hot-Start.
Zadbaj o niską temperaturę podczas przygotowywania reakcji.
 Niska wydajność reakcji:
Zwiększ stężenie jonów Mg2+ w mieszaninie reakcyjnej (np. o 2 mM). Obniż temperaturę
przyłączania starterów (np. do 53-55°C).
4