PCR i elucja DNA z żelu

Inżynieria genetyczna
Ćwiczenie 3
Metoda PCR została opracowana w
1987 r. przez grupę Naukowców z
Cetus Corporation w USA. Firma
Roche odkupiła od Cetus Corp. prawa
do PCR za 300 mln $
Autor K. Mullis otrzymał w 1993r.
nagrodę Nobla w dziedzinie chemii.
1
Początkowo stosowano fragment Klenowa polimerazy DNA I z E. coli, który
wykazuje aktywność 5’→3’ polimerazy oraz 3’ →5’ egzonukleazy, brakuje
natomiast aktywności 5’ →3’ egzonukleazy, dzięki czemu nie występuje
niebezpieczeństwo degradacji primerów podczas reakcji. Polimeraza ta
była niestabilna w wyższych temperaturach, dlatego konieczne było
dodawanie jej kolejnej porcji w każdym kolejnym cyklu.
Niekorzystne cechy tej polimerazy
zostały wyeliminowane przez użycie
polimerazy Taq z termofilnych bakterii
Thermus aquaticus – temperatura
denaturacji matrycy nie pozbawia
enzymu aktywności.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Matryca DNA (RNA)
Startery
dNTP
MgCl2
Polimeraza
Bufor
2

najlepiej dodać najpierw wodę, a następnie kolejno pozostałe
składniki

mieszaninę reakcyjną przetrzymujemy w lodzie podczas pracy

gdy matrycą jest powszechnie używane DNA w laboratorium
lub gdy są jej śladowe ilości, to praca powinna odbywać się w
laminarnym przepływie sterylnego powietrza, a tipsy i pipety
powinny być zabezpieczone korkami

podczas pracy z małymi objętościami komponentów (1-2 μl)
trzeba uważać, aby do wszystkich prób dodana została
jednakowa ilość (szczególnie ważne przy ilościowym PCR)

Niekorzystna zbyt duża/zbyt niska liczba matryc
- Ilość DNA 1ng-1μg
- Wyjściowa liczba matryc:
DNA człowieka 3*10-5
DNA drożdży 1μg
DNA E. Coli
1ng

Odpowiedni stopień czystości (UV, elektroforeza ) Zanieczyszczenia matrycy: SDS, EDTA, DMSO,
heparyna, fenol, sole

Metoda izolacji - usunięcie inhibitorów reakcji
3
Efekt zbyt dużej
liczby matryc
Degradacja
DNA
Polimeraza Taq:
•Wyizolowana z bakterii Thermus aquaticus
•Aktywność polimerazy 5’-3’
•Aktywność egzonukleazy 5’-3’
•Brak aktywności egzonukleazy 3’-5’
•Aktywność polimerazy Taq – około 2000 nt/min (60 nt/s) w
optym. temperaturze 72-78°C
•Po reakcji na końcach 3' kilka nukleotydów adeninowych,
właściwość wykorzystywana jest przy klonowaniu produktów
PCR.
•Do swej aktywności wymaga jonów Mg2+
•Procesywność, wierność, szybkość
4

Cechy:
- odpowiednia długość (18- 28 nt)
- zawartość GC
50- 60 %


Tm
Ta
55-72˚C
40- 55 ˚C
[2n1(A+T)+4n2(G+C)]- 5
-wyznaczana doświadczalnie
-wpływ na specyficzność

Dobór stężenia roboczego
10 pmol/ μl
-zbyt duże stężenie- niespecyficzność
produktów

Dimery starterów
- komplementarność końców 3’

metoda oparta o %GC:
Tm[oC] = 81,5 + 16,6 x log[Na] + 0,41 x (%GC) 675/długość - 0,65 x (%formamidu) - (%niekomplementarnych)

metoda uproszczona:
Tm = [2o x (A + T) + 4o x (G + C)]

metoda w oparciu o zasady sąsiadujące
5
startery - najczęściej to ich sekwencja i stężenie decyduje o
powodzeniu reakcji:

nie powinny tworzyć wewnętrznych struktur 2-rzędowych

Powinny mieć wyrównaną zawartość zasad G/C i A/T

nie mogą komplementować między sobą na 3’ końcu

nie mogą zbyt silnie wiązać na 3’ końcu

do 5’ można dodawać: miejsca cięcia dla enzymów restrykcyjnych, tzw.
lepkie końce

stężenie 0,1-0,5 M (za dużo - pomyłki, za mało - mniej produktu)

startery zdegenerowane,

modyfikacje: biotynowanie, zabezpieczanie przed 3’ degradacją - wiązania
fosfotiolowe, fosforylacja
Źle zaprojektowane startery
http://www.bioinformatics.org/sms2/pcr_primer_stats.html
6
Wpływ temperatury wiązania starterów
- termocykler z gradientem temp.
- wyznaczanie optymalnej Tm

dNTP-trifosforany deoksyrybonukleotydów

niezrównoważony skład obniża dokładność polimerazy,


stężenie wyjściowe: 5-10 mM
stężenie reakcji: 20-200 µM

jednakowe stężenie wszystkich dNTP

pH 7,
7

MgCl2 - 0,5-5,0 mM - wpływa na
aktywność enzymu, zwiększa Tm dsDNA,
tworzy kompleksy z dNTP dając substrat
dla polimerazy,

Stężenie jonów Mg > stężenie dNTP
dNTP
MgCl2
Stężenie optymalne 20- 200µM
Wiązanie przez: matrycę, startery,
polimerazę Taq, dNTP
dATP:dGTP: dCTP: dTTP
Stosowanie jednakowych stężeń
Wrażliwość na degradację
Rozkład- przyczyna braku produktu
Dokładność reakcji
Proporcjonalna do stężenia wolnych
MgCl2
Wzrost dokładności polimerazy
Stężenie MgCl2 nieco wyższe od steżenia
dNTP
8

Należy zwrócić uwagę na:
- Stężenie
0,5- 5U na 100µl
zbyt duże- niespecyficzne produkty
zbyt małe- brak produktów
- Przechowywanie
- Okres półtrwania
92,5 ˚C
95,0 ˚C
97,5 ˚C
-20˚C
2h
40 min
5 min (!)
9
 DMSO
 Żelatyna
 BSA
 Tween 20
 PEG
 Fenol
 SDS
 Proteinaza K
 Porfiryna
 EDTA
 Etanol
10

Zapewnia odpowiednie warunki dla działania
polimerazy

pH 8,3-8,8

Tris-HCl w zakresie 10-50 mM

Czynniki ujemnie wpływające na PCR:
1. Jakość i zanieczyszczenia matrycy
2. Startery
- powstawanie dimerów starterów
- niska specyficzność starterów
3. Niewłaściwy dobór stężeń dNTP i MgCl2
4. Błędy polimerazy
5. Zanieczyszczenia odczynników
6. Ilość cykli
11
ETAP
początkowa denaturacja
denaturacja
przyłączanie starterów
wydłużanie starterów
ostatnie wydłużanie
schładzanie
CZAS
2-5 min
1-60 s
30-60 s
30-90 s
5-10 min
b/o
°C
94
94
54
72
72
4
x 20-35

Aktywność polimerazy Taq – około 2000 nt/min (60 nt/s) w
optym. temperaturze 72-78°C

Denaturacja – nie powinna być dłuższa niż 60 s, ponieważ
wpływałoby to na aktywność enzymu

Początkowo czas wydłużania ustalamy 1kb -1 min, 2kb – 2
min itd…., przy kolejnych reakcjach można skracać

Przyłączanie starterów – temp. zależy od temp. topnienia obu
oligonukleotydów

Liczba cykli – 30 , więcej cykli nie wpływa znacząco na ilość
produktu

OPTYMALIZACJA – usunięcie niespecyficznych produktów
12

Specyficzność – eliminowanie niespecyficznych produktów





podwyższyć temperaturę annealingu (przyłączania starterów),
obniżyć stężenie jonów Mg2+
zmienić skład nukleotydowy primera
obniżyć ilość cykli
zmienić polimerazę

Długość produktu – amplifikacja długich fragmentów






wydłużyć czas syntezy
dobrać odpowiednie stężenie jonów Mg2+
zmienić polimerazę
skrócić czas denaturacji
podwyższyć stężenie matrycy
zmienić pH buforu do PCR

Wierność – redukcja błędów syntezy




obniżyć liczbę cykli
podwyższyć stężenie matrycy
obniżyć stężenie dNTP
zmienić polimerazę






Ilość produktu – zwiększenie ilości amplifikowanych
fragmentów
zwiększyć liczbę cykli
podwyższyć stężenie matrycy
zmienić polimerazę
obniżyć temperaturę annilingu
wydłużyć czas syntezy
13

Hot start - unikanie niespecyficznej amplifikacji podczas
pierwszego cyklu (RT  94oC):
 wkładać probówki do gorącego bloku
 dodawać polimerazę lub startery do gorącej mieszaniny
 odseparować startery od reszty reakcji parafiną
 korzystać z polimerazy zabezpieczonej przeciwciałem
 inne zabezpieczenia dysocjujące w wyższej temperaturze

Touch-down PCR – pierwsze kilka cykli wykonane przy dużo
wyższej temp. przył. startera – zwiększa specyficzność

Kłopoty z subklonowaniem produktu PCR
 po Taq polimerazie zostaje ok. 70% końców tępych, a reszta ma 1
zasadę wystającą na końcu 3’ (zwykle A) - można ligować na lepko (!)
 większość starterów zdefosforylowanych na końcu 5’ (PNK).
14
Cechy
PCR
PCR w zastosowaniu analitycznym
(diagnostycznym)
Wykrywanie
sekwencji o
niewielu kopiach
Analizy
genetyczne
Czułość
+++
+
Specyficzność
+++
Wierność
Ilość
produktu
Sądownictwo
PCR jako metoda syntezy
(zastosowanie laboratoryjne)
Synteza
sond
Synteza matryc
do sekwencjonowania
Synteza insertów
przeznaczonych
do klonowania
+++
-
-
-
+++
+++
++
++
+++
-
-
-
-
-
+++
-
(+)
-
+++
+++
_
+++, niezwykle istotna;
++, bardzo istotna;
+, istotna;
(+), może być istotna;
-, nieistotna.
Jedna zasada, wiele modyfikacji
15

nested - „zagnieżdżony” PCR,


multiplex PCR - jednoczesna
amplifikacja kilku fragmentów
(dłuższe startery),
asymetryczny PCR (zmiana
proporcji starterów po 15-25
cyklach),

LCR - ligase chain reaction,

RT-PCR,

in situ PCR (genomowy i RT) –
w tkance,

Real time PCR

long (expanded, extended)
PCR - dla fragmentów > 5kb mieszanki polimeraz, octany,
dwie temp. (np.99/68),

inverted PCR,

mutageneza kierowana wprowadzanie zmian,
AMV-RT - avian myeloblastosis virus reverse transcriptase,
zachowuje aktywność do 55°C, eliminuje problemy
związane strukturą II-rzędową
MMLV-RT - moloney murine leukaemia virus reverse transcriptase,
ma mniejszą aktywność RNAzy H niż AMV-RT i jest lepsza
do syntezy pełnej długości cząsteczek cDNA
synteza cDNA:
 hybrydyzacja ze specyficznym starterem
 hybrydyzacja z oligo (dT)
 hybrydyzacja z heksamerami
AAAA
AAAA
TTTT
AAAA
16
 dwie lub więcej docelowych
sekwencji jest namnażanych w jednej
probówce
 jedna z tych sekwencji to najczęściej
wewnętrzna kontrola poprawności
warunków reakcji a druga jest
sekwencją docelową
zastosowanie diagnostyczne – polimorfizmy
analizy mikrobiologiczne
SSCP- polimorfizm konformacji jednoniciowych fragmentów
DNA (ang. single strand conformation polymorphism)
 wykorzystywany w celu
wykrywania punktowych
mutacji w genomowym DNA
 w war.natywnych DNA
przyjmuje określoną
konformację zależną od
sekwencji nukleotydowych
 szybkość zależna od
wielkości i konformacji
>95% wykrywalność dla DNA
o wielkości 100-300 pz
Do detekcji reakcja
srebrzenia, radioizotopy,
rzadziej bromek etydyny
17
PCR-HD
Wykrywanie mutacji metodą heterodupleksów
1. Do produktów PCR powyżej 400 pz
2. Układ heterozygotyczny( 2 allele zmutowany i prawidłowy)
3. Amplifikacjainkubacja w celu utworzenia heterodupleksów
4. Heterodupleks- hybrydyzacja nie w pełni komplementarna
5. Substytucja-obustronne wybrzuszenie
6. Insercja lub delecja- jednostronne wybrzuszenie lub ugięcie nici
Polimorfizmy RFLP to dziedziczne warianty sekwencji DNA, które objawiają się utworzeniem
bądź zanikiem miejsca rozpoznawalnego przez endonukleazy restrykcyjne lub zmianą liczby
nukleotydów między takimi miejscami .
Amplifikacja fragmentu DNA, w obrębie którego występuje marker RFLP a potem jego hydroliza
enzymem restrykcyjnym.
18
 pozwala na amplifikację długich fragmentów DNA,
 można w ten sposób uzyskiwać fragmenty nawet
do 27 kb, rutynowo służy do otrzymywania fragmentów 10 – 20 kb
 długie fragmenty uzyskuje się stosując mieszaninę
termostabilnych polimeraz DNA, zwykle:
 polimerazę Taq – zapewnia wysoką procesywność
(aktywność 5’-3’ polimerazy)
 polimerazę Pwo – zapewnia poprawność (aktywność 3’-5’
egzonukleazy)
Nested PCR
 dwa zestawy primerów:
zewnetrzne i wewnętrzne,
ale dwie rundy amplifikacji.
 cel: zwiększenie czułości
(pg) i specyficzności PCR
19
transgen
enz
enz
trawienie restrykcyjne
a następnie ligacja
(to nie jest plazmid !)
 enz., który nie trawi transgenu
przecinamy w obszarze transgenu
projektujemy primery
amplifikacja,
klonowanie i
sekwencjonowanie
Koliste fragmenty DNA stają się matrycą
produkty są w mieszaninach, w których formy
koliste zawierają oba miejsca przyłączania starterów
 pozwala zamplifikować
obszary wokół transgenu
20
 niskie tło – znakowanie
po specyficznej hybrydyzacji,
startery nie są znakowane
 szybkość – hybrydyzacja
i elongacja w 30 min., cała
procedura 2h
 wydłużanie nie jest limitowane
długością startera
21
• Ocena ilościowa produktu
• Wysoka czułość i powtarzalność
• Szeroki zakres oznaczanych stężeń
Budowa:
- źródło światła wzbudzającego
cząsteczkę reporterową
- układ detekcji fluorescencji
- termocyler
22
23

SYBR Green I – interkaluje do dsDNA podczas reakcji, związane z DNA
ma silną fluorescencję (1000x silniej niż nie związane – stąd (+) niskie tło)

technika FRET - (fluorescence resonanse energy transfer) – do detekcji
specyficznych sekwencji. Przygotowuje się 2 sondy hybrydyzujące blisko
na matrycy. Górna sonda jest wyznakowana fluoresceiną na końcu 3’,
która działa jako FRET. Koniec 5’ dolnej sondy jest wyznakowany
akceptorem. Jeżeli dojdzie do hybrydyzacji obu - jest fluorescencja

technika Molecular Beacons – podwójnie znakowany starter, gdy jest nie
związany jest wygaszanie1 (struktura spinki do włosów), gdy się przyłączy
jest fluorescencja

TaqMan – wykorzystanie aktywności egzonukleolitycznej 5’-3’. Starter jest
podwójnie wyznakowany: fluoresceiną i wygaszaczem. Następuje
wycięcie barwnika, co odblokowuje fluorescencję.

SYBR Green I (metoda niespecyficznej detekcji fluorescencji)
24

TaqMan (metoda specyficznej detekcji fluorescencji)
25
26
Geny:
miR482d
miR6023
U6
Matryce:
3dpi K
3dpi Inf
27
Geny:
β tubulina
Lsd1
Matryce:
Col0
Lsd1(Col0)
28
Expression Std. Error
1
APX1
1,584
0,909
CAT2
0,687
0,586
EIN2
1,795
1,065
ERF1
195,904
131,464
GA3
0,474
0,4
LOX2
3,35
2,099
ORA47
1,01
0,477
OXI1
1,209
0,702
PDF1.2
400,04
198,096
PR1
8,044
2,83
RRTF
6,84
5,689
SAG2
2,486
1,398
UBQ
1,261
0,54
WRKY33
4,335
2,269
95% C.I.
0,663 2,870
0,560 0,885
0,903 4,560
103,877 338,734
0,357 0,629
0,993 9,826
0,423 2,022
0,601 2,150
48,870 2 351,125
2,589 42,579
5,203 10,045
0,453 8,868
0,212 6,047
1,760 10,719
P(H1)
Result
ROOT
1000
0,065
0,008
DOWN
0,045
UP
0
UP
0,007
DOWN
0,014
UP
0,963
0,363
0,001
UP
0,002
UP
0,001
UP
100
Gene expression level
Gene
ACT2
10
1
0,058
0,1
0,661
0
UP
29
Elektorforeza i metody elucji
30
rodzaj agarozy
 przezroczystość
 rozdział krótkich prążków
 cena
czas (dla prążków krótszych niż 600pz)
 lepiej krócej tzn. 3-4 h dla żelu 15-20 cm,
 przy dłuższym czasie 14-16h (niskie napięcie)
prążki nie są ostre, rozdział gorszy
Agaroza
Wielkość
rozdzielanych
fragmentów DNA
0,3%
5-60 kpz
0,5%
1-30 kpz
0,7%
0,8-12 kpz
1,0%
0,5-10 kpz
1,2%
0,4-7 kpz
1,5%
0,2-3 kpz
2,0%
0,05-2 kpz
rozdział wielu prążków (polimorficzne loci):
 lepsze żele poliakrylamidowe, jeżeli prążki różnią się kilkoma pz (np.
markery mikrosatelitalne) 6-10%
 niedenaturujące – dobry dla pojedynczych loci
 denaturujące 6%/7M mocznik - żele do sekwencjonowania
 multiplex PCR – 2 - 3% żel agarozowy
 Elektroelucja
konieczne przeprowadzenie kolejne elektroforezy, w specjalnie przygotowanym aparacie, pracochłonna
 Szkło kwarcowe – sole chaotropowe
odpowiednia do oczyszczania dużych i małych fragmentów DNA, pracochłonna, zanieczyszczenia NaI,
trudności przy agarozie opartej na TBE
 Modyfikowana celuloza DEAE
nadaje się do oczyszczania długich odcinków DNA, skomplikowana i pracochłonna, konieczność
wykonania kolejnej elektroforezy, możliwość nieodwracalnego związania się DNA z celulozą po
wyschnięciu
 Zamrażanie, wyciskanie, wirowanie
tania, styczność z BrEt podczas wyciskania
 Trawienie -agarazą
odpowiednia do oczyszczania dużych i małych fragmentów DNA, tylko do agarozy o niskiej
temperaturze topnienia, trudności przy wykorzystaniu bufora TBE, konieczne utrzymywanie
odpowiedniej temp. (42-45C) oraz pH 5-8
 Metody z wykorzystaniem kolumienek
wygodna, w kontrolowanych warunkach, powtarzalna, kosztowne, większe cząsteczki DNA mogą
zahaczać się w kolumienkach
31
Dziękuję za uwagę !
32