BD Haemophilus Test Medium Agar (HTM)

GOTOWE PODŁOŻA
HODOWLANE NA
PŁYTKACH – INSTRUKCJE
STOSOWANIA
PA-254058.06
wer.: April 2013
BD Haemophilus Test Medium Agar (HTM)
PRZEZNACZENIE
Podłoże BD Haemophilus Test Medium Agar (HTM) służy do dyfuzyjnych krążkowych badań
wrażliwości izolatów klinicznych gatunków Haemophilus, zgodnie z zatwierdzoną normą M2,
opublikowaną przez Instytut Norm Klinicznych i Laboratoryjnych (CLSI).1
ZASADY I OBJAŚNIENIE PROCEDURY
Metoda mikrobiologiczna.
Poprzednim podłożem zalecanym do badań Haemophilus influenzae był Mueller Hinton Agar
wzbogacony 1% hemoglobiną i 1% dodatkiem wzbogacającym IsoVitaleX (Mueller Hinton
Chocolate Agar).2 Szczegółowe badania przeprowadzone przez Jorgensena i jego
współpracowników doprowadziły do opracowania podłoża Haemophilus Test Medium Agar
(HTM).3,4 Składa się ono z podłoża Mueller Hinton agar z dodatkiem czynnika X (hemina lub
hematyna), czynnika V (NAD, dinukleotydu nikotynoamidoadeninowego) i wyciągu
drożdżowego.
Istotną zaletą podłoża HTM Agar w porównaniu z Mueller Hinton Chocolate Agar jest
przejrzystość optyczna, umożliwiająca wykonywanie pomiaru średnicy stref na dolnej
powierzchni płytki, zgodnie ze standardem procedury testowej dla drobnoustrojów o niskich
wymaganiach odżywczych na podłożu Mueller Hinton Agar. Ponadto HTM Agar zawiera niski
poziom tymidyny, dzięki czemu lepiej nadaje się do badań trimetoprimu/sulfametoksazolu.
Kryteria interpretacji badań wrażliwości bakterii na antybiotyki przedstawiono w dokumencie
CLSI M100 (M2), dołączonym do dokumentu CLSI M2.1 Dokument ten zawiera dalsze
informacje na ten temat.
BD Haemophilus Test Medium Agar składa się z podłoża Mueller Hinton Agar z dodatkiem
czynnika X (heminy lub hematyny), czynnika V (dinukleotydu nikotynoamidoadeninowego) oraz
wyciągu z drożdży.
ODCZYNNIKI
BD Haemophilus Test Medium Agar (HTM)
Skład* w przeliczeniu na jeden litr wody oczyszczonej
Wyciąg wołowy
2,0 g
Kwaśny hydrolizat kazeiny
17,5
Skrobia
1,5
Agar
17,0
Wyciąg drożdżowy
5,0
Hematyna
0,015
Dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy (NAD) 0,015
pH 7,3 ± 0,1
*Skorygowany i (lub) uzupełniony zgodnie z wymaganiami mającymi na celu spełnienie
kryteriów wydajności.
ŚRODKI OSTROŻNOŚCI
. Wyłącznie do zastosowań profesjonalnych.
Nie należy używać płytek, jeżeli są na nich widoczne oznaki skażenia mikrobiologicznego,
odbarwienia, wyschnięcia, pęknięcia lub inne zjawiska wskazujące na pogorszenie jakości.
Nadmierne obkurczenie się opisywanego podłoża na skutek wysychania może prowadzić do
uzyskania fałszywych wyników wskazujących na występowanie wrażliwości.
Procedury aseptycznej techniki pracy z produktem, zagrożenia biologiczne oraz usuwanie
zużytego produktu opisano w dokumencie OGÓLNE INSTRUKCJE DOTYCZĄCE
STOSOWANIA.
PA-254058.06
-1-
PRZECHOWYWANIE I DOPUSZCZALNY OKRES PRZECHOWYWANIA
Po otrzymaniu, płytki należy przechowywać w ciemnym miejscu w temperaturze od 2 do 8° C, w
ich oryginalnym opakowaniu izolującym do chwili użycia. Unikać zamrażania i przegrzewania.
Posiewu na płytki można dokonywać aż do daty ważności (patrz etykieta na opakowaniu) i
inkubować w zalecanych czasach inkubacji.
Płytek z otwartych stosów zawierających po 10 płytek można używać przez okres jednego
tygodnia, przechowując w czystym miejscu w temperaturze od 2 do 8° C.
KONTROLA JAKOŚCI PRZEZ UŻYTKOWNIKA
Procedury kontroli jakości przez użytkownika przedstawiono w standardach CLSI1 bądź w
odpowiednich standardach krajowych. W zasadzie należy stosować procedury opisane w części
Procedura testowa, używając szczepów referencyjnych wymienionych w części Materiały
niedostarczane.
Wykorzystywane płytki z podłożem BD Haemophilus Test Medium Agar (HTM) oraz krążki
nasycone antybiotykami należy testować co najmniej dwa razy w tygodniu w ramach kontroli
jakości.
Wygląd podłoża bez posiewu: zabarwienie jasnobursztynowe.
PROCEDURA
Dostarczane materiały
Podłoże BD Haemophilus Test Medium Agar (płytki Stacker o śr. 90 mm). Sprawdzane pod
kątem obecności mikroorganizmów.
Materiały niedostarczane
1. Pożywka płynna w probówce, taka jak BD Trypticase Soy Broth (pożywka z ekstraktem
sojowo-kazeinowym) lub Mueller Hinton II Broth (ze skorygowaną zawartością kationów) do
przygotowania standardowego inokulum, a także sterylna pożywka lub roztwór fizjologiczny
do rozcieńczenia inokulum.
2. Standard porównawczy z siarczanem (VI) baru (0,5 ml BaCl2 o stężeniu 0,048 M
[BaCl2·2H2O o stężeniu 1,175% (stężenie wagowo-objętościowe)] w 99,5 ml H2SO4 o
stężeniu 0,18 M [0,36 N] [1% stężenie objętościowo-objętościowe]).
3. Urządzenie fotometryczne do korygowania zmętnienia zawiesiny inokulum, tak aby było
ono równe standardowi 0,5 McFarland.
4. Alternatywnie do wyżej wymienionych materiałów (1-3) można użyć BD Prompt
Inoculation System (urządzenie wolumetryczne do przygotowywania inokulum).5,6
5. Hodowle kontrolne – Haemophilus influenzae ATCC 49247, ATCC 49766 i ATCC 10211.
6. Krążki papierowe nasycone określoną ilością antybiotyków, takie jak krążki do badania
wrażliwości BD Sensi-Disc.
7. Aplikator do nakładania krążków, takie jak 6-pozycyjny aplikator Sensi-Disc.
8. Linijka lub inne urządzenie do pomiaru średnicy stref w milimetrach.
9. Inkubator wytwarzający atmosferę zawierającą 5% CO2 bądź inne urządzenie, które
wytwarza podobną atmosferę tlenową wzbogaconą w CO2.
10. Odczynnik do wykonywania szybkich testów z ß-laktamazą, np. krążki BD Cefinase.
11. Pomocnicze pożywki hodowlane, odczynniki i wyposażenie laboratoryjne zgodnie z
wymaganiami.
Typy próbek
Opisywany produkt jest używany do badań wrażliwości czystych hodowli Haemophilus, które
wyizolowano z próbek klinicznych (zobacz także CHARAKTERYSTYKA WYDAJNOŚCI I
OGRANICZENIA PROCEDURY).
Procedura testowa
1. Przed badaniem wrażliwości należy wykonać barwienie metodą Grama w celu
potwierdzenia czystości hodowli i wstępnej identyfikacji Haemophilus.
PA-254058.06
-2-
2. Materiał do posiewu należy pobrać z kilku wyraźnie oddzielonych kolonii na inkubowanej
przez jedną dobę (najlepiej 20–24 godz.) płytki z podłożem Chocolate Agar.
3. Do szybkiego wykrycia szczepów opornych na penicylinę, ampicylinę i amoksycylinę
należy użyć szybkiego testu z ß-laktamazą.
4. Wykonać zawiesinę badanych drobnoustrojów w pożywce płynnej, takiej jak Mueller
Hinton Broth, Mueller Hinton II Broth lub roztworze fizjologicznym o stężeniu 0,9%.
Zmętnienie tej zawiesiny należy skorygować za pomocą urządzenia fotometrycznego tak,
aby odpowiadało ono standardowi 0,5 McFarland. Zawiesina taka będzie zawierała około
1–4 x 108 CFU/ml. Podczas przygotowywania tej zawiesiny należy zachować ostrożność,
gdyż zbyt duże stężenie inokulum może w przypadku niektórych antybiotyków ßlaktamowych prowadzić do uzyskania fałszywych wyników wskazujących na oporność,
zwłaszcza podczas badania szczepów H. influenzae wytwarzających beta-laktamazę.1
5. Do celów rutynowych badań, w tym badań H. influenzae, za dopuszczalne uznaje się
stosowanie alternatywnych metod przygotowywania inokulum za pomocą urządzeń
umożliwiających bezpośrednią standaryzację inokulum bez korygowania zmętnienia,
takich jak BD Prompt Inoculation System.5,6
6. W ciągu 15 min od skorygowania zmętnienia inokulum należy zanurzyć sterylną
wymazówkę w odpowiednio rozcieńczonym inokulum i kilkakrotnie ją obrócić, mocno
przyciskając do górnej wewnętrznej ścianki probówki, aby odsączyć nadmiar płynu.
7. Wykonać posiew, trzykrotnie rozprowadzając materiał po całej powierzchni podłoża BD
Haemophilus Test Medium Agar na płytce, obracając płytkę za każdym razem o 60°,
aby uzyskać równomierny posiew.
8. Płytkę z uchyloną pokrywką pozostawić w temperaturze pokojowej na 3–5 min., lecz nie
dłużej niż 15 min, w celu zaabsorbowania wilgoci na powierzchni podłoża przed
nałożeniem krążków nasyconych antybiotykami.
9. Nałożyć krążki nasycone antybiotykami za pomocą odpowiedniego aplikatora,
zachowując zasady aseptyki. Podczas badań bakterii z rodzaju Haemophilus większość
antybiotyków powoduje powstanie większych stref zahamowania wzrostu niż w przypadku
innych drobnoustrojów. W związku z tym na pojedynczej płytce o średnicy 100 mm nie
należy umieszczać więcej niż cztery krążki nasycone antybiotykami, w tym nie więcej niż
sześć spośród następujących krążków: cefalosporyny trzeciej generacji (np. cefotaksym,
ceftazidim, ceftriakson, ceftizoksym), aztreonam, imipenem lub ciprofloksacyna. Po
umieszczeniu krążków na agarze należy je lekko docisnąć za pomocą sterylnej igły lub
pincety, aby dokładnie przylegały one do powierzchni podłoża.
10. W ciągu 15 minut od nałożenia krążków płytki należy odwrócić i inkubować przez 16–18
godz., w temperaturze 35°C, w atmosferze tlenowej wzbogaconej 5% dwutlenkiem węgla.
11. Należy też wykonać posiew szczepu H. influenzae ATCC 10211 na płytce z podłożem BD
Haemophilus Test Medium Agar i inkubować ją razem z płytkami, na których badana
jest wrażliwość bakterii na antybiotyki, aby określić, czy na podłożu występuje
zadowalający wzrost.
Wyniki
1. Płytki należy zbadać po 16–18 godzinach inkubacji. Powinien być widoczny zlewny
wzrost. Wystąpienie samych izolowanych kolonii oznacza, że inokulum było zbyt
rozcieńczone. Należy wówczas powtórzyć test.
2. Zmierzyć średnicę stref całkowitego zahamowania wzrostu (ocenianą nieuzbrojonym
okiem), włączając średnicę krążka, w zaokrągleniu do pełnych milimetrów, za pomocą
cyrkla, linijki lub specjalnego szablonu. Urządzenie wykorzystywane do pomiaru należy
przystawić do dna odwróconej płytki umieszczonej na czarnym, nieodbijającym tle i
oświetlonej z góry.
3. Jako granicę należy przyjąć obszar nie wykazujący wyraźnie widocznych oznak wzrostu,
które można dostrzec okiem nieuzbrojonym. Należy pominąć śladowy wzrost oraz małe
kolonie, które można z trudem zauważyć w pobliżu granicy wyraźnej strefy zahamowania.
W przypadku trimetoprimu i sulfonamidów śladowe ilości substancji antagonistycznych w
podłożu mogą umożliwić śladowy wzrost; w związku z tym należy pominąć nieznaczny
wzrost (do 20% wzrostu zlewnego) i zmierzyć najbardziej wyraźną granicę w celu
określenia średnicy strefy.
PA-254058.06
-3-
Obliczanie i interpretacja wyników
Informacje na temat interpretacji wyników uzyskanych w badaniach szczepów Haemophilus
izolowanych z próbek pochodzenia klinicznego przedstawiono w dokumencie CLSI M100-S10
(M2).1 Możliwe są trzy wyniki: oporne, częściowo wrażliwe lub wrażliwe, w zależności od
uzyskanej średnicy strefy.
Drobnoustroje dające dodatni wynik testu na wytwarzanie beta-laktamazy należy uznać za
oporne na ampicylinę, niezależnie od uzyskanej średnicy strefy. Należy jednak pamiętać o
tym, że opisywane były szczepy H. influenzae oporne na ampicylinę, które nie wykazywały
aktywności ß-laktamazy.7
W związku z tym, jeśli średnica strefy wskazuje na wrażliwość na ampicylinę, izolowany
szczep należy uznać za oporny na ten lek, nawet w przypadku ujemnego wyniku testu na ßlaktamazę.
Hodowli kontrolnych należy używać przy każdym badaniu wrażliwości lub raz w tygodniu, jeśli
możliwe jest udokumentowanie zadowalającej wydajności zgodnie ze standardem CLSI M2,
który zawiera tabele (M100) prawidłowych wartości średnic stref.1
Uwaga: Okresowo publikowane są informacyjne dodatki do dokumentu CLSI M2 bądź jego
uaktualnione wersje, zawierające poprawione tabele dla krążków przeciwbakteryjnych oraz standardy
interpretacji. Należy przestrzegać zaleceń podanych w najnowszych tabelach. Pełen standard i dodatki
informacyjne można zamówić pod adresem Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West
Valley Road, Suite 1400, Wayne, PA 19087-1898, USA. Telefon: ++1-610-688-1100.
CHARAKTERYSTYKA WYNIKÓW I OGRANICZENIA DOTYCZĄCE PROCEDURY
A. Badanie odtwarzalności8
Oceniono trzy partie produkcyjne podłoża BD Haemophilus Test Medium Agar, stosując
procedurę badania wrażliwości z krążkami nasączonymi antybiotykami (M2-A4) zalecaną
wówczas przez NCCLS.9 W badaniu użyto łącznie 12 antybiotyków (amoksycylina/klawulanian,
ampicylina, ampicylina/sulbaktam, cefaklor, cefonicyd, ceftriakson, cefuroksym, chloramfenikol,
ciprofloksacyna, rifampicyna, tetracyklina, trimetoprim/sulfametoksazol) oraz 14 szczepów H.
influenzae. Siedem spośród 14 użytych w badaniu szczepów było szczepami ATCC (American
Type Culture Collection), a pozostałe siedem było hodowlami zapasowymi, w tym sześć
izolatów z próbek pochodzenia klinicznego oraz hodowla kontrolna o jakości przemysłowej.
Średnice stref uzyskane w każdej z trzech partii podłoża zostały porównane z kryteriami
interpretacji (Tabela 2A) w dokumencie M2-A4.9 Tylko w sześciu przypadkach strefy uzyskane
w jednej partii należały do innej kategorii interpretacyjnej, niż strefy uzyskane w pozostałych
dwóch partiach. Wśród tych sześciu rozbieżności cztery dotyczyły tetracykliny, jedna cefakloru
i jedna cefuroksymu. W przypadku tetracykliny wynik wskazywał na kategorię interpretacji
oznaczającą wrażliwość lub częściową wrażliwość (mniejszy błąd). W przypadku cefakloru i
cefuroksymu, zaobserwowana różnica 1 mm oznaczała bądź kategorię częściowej wrażliwości,
bądź oporności, co także stanowi mniejszy błąd.
W tym badaniu użyto pięciu szczepów H. influenzae wytwarzających beta-laktamazę. Dla
każdego z tych szczepów średnice stref uzyskane w każdej partii HTM z ampicyliną należało
zinterpretować jako oporność. Dwa z tych pięciu szczepów produkowały także
acetylotransferazę chloramfenikolu (CAT). Strefy uzyskane w badaniu wrażliwości tych dwóch
szczepów na chloramfenikol odpowiadały rzeczywistej oporności tego antybiotyku.10,11
B. Porównanie z podłożem Mueller Hinton Chocolate Agar8
Dla 213 szczepów H. influenzae wyizolowanych z próbek pochodzenia klinicznego wykonana
została procedura NCCLS z krążkami na podłożach HTM Agar i Mueller Hinton Chocolate
Agar.9,12 Badane były następujące antybiotyki: ampicylina, ampicylina/sulbaktam,
amoksycylina/klawulanian i chloramfenikol. Były to jedyne antybiotyki, dla których zostały
zdefiniowane kryteria interpretacyjne średnicy stref dla podłoża Mueller Hinton Chocolate
Agar.13,14 Uzyskano następujące wyniki:
PA-254058.06
-4-
Mueller Hinton
Chocolate Agar
Zgodność: 99,6%
S
I
R
S = Wrażliwe
BD Haemophilus Test Medium Agar
S
I
808
1
0
0
0
0
I = Częściowo
wrażliwe
R
2
0
41
R = Oporne
W przypadku ampicyliny wystąpiły dwa duże błędy i jeden mały błąd. W obu dużych błędach
wynik uzyskany na podłożu BD Haemophilus Test Medium Agar wskazywał na
występowanie oporności, podczas gdy na podłożu Mueller Hinton Chocolate Agar wynik
wskazywał na wrażliwość bakterii na antybiotyk. Oba te szczepy dawały dodatni wynik badania
w kierunku beta-laktamazy. W związku z tym prawidłowe były wyniki wskazujące na
występowanie oporności. Jeden mały błąd dotyczył szczepu, dla którego wynik uzyskany na
podłożu HTM Agar wskazywał na częściową wrażliwość, a na podłożu Mueller Hinton
Chocolate Agar – na wrażliwość.
C. Ograniczenia procedury
W przypadku pewnych połączeń drobnoustrój-antybiotyk strefa zahamowania może nie mieć
wyraźnej granicy, co może prowadzić do nieprawidłowych interpretacji.
Niewłaściwe stężenie inokulum może prowadzić do uzyskania nieprawidłowych wyników. Jeśli
stężenie inokulum jest zbyt duże, strefy zahamowania mogą być zbyt małe, a jeśli stężenie
inokulum jest zbyt małe, strefy mogą być za duże i trudne do zmierzenia.
Niewłaściwe przechowywanie krążków z antybiotykami może spowodować utratę ich mocy i
fałszywe wyniki wskazujące na występowanie oporności.
Wrażliwość drobnoustroju in vitro na określony antybiotyk nie zawsze oznacza, że lek ten
będzie skuteczny in vivo. Wskazówki dotyczące interpretacji wyników przedstawiono w
odpowiednich publikacjach.2,15
PIŚMIENNICTWO
1. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, formerly NCCLS). Approved standard: M2.
Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests. CLSI, Wayne, PA,
USA.Search for latest version at www.clsi.org
2. Thornsberry, C., T.L. Gavan, E.H. Gerlach. 1977. Cumitech 6, New developments in
antimicrobial agent susceptibility testing. Coordinating ed., J.C. Sherris. American Society
for Microbiology, Washington, D.C
3. Jorgensen, J.H., J.S. Redding, L.A. Maher, and A.W. Howell. 1987. Improved medium for
antimicrobial susceptibility testing of Haemophilus influenzae. J. Clin. Microbiol. 25:21052113.
4. Jorgensen, J.H., A.W. Howell, and L.A. Maher. 1990. Antimicrobial susceptibility testing of
less commonly isolated Haemophilus species using Haemophilus test medium. J. Clin.
Microbiol. 28:985-988.
5. Baker, C.N., C. Thornsberry, and R.W. Hawkinson. 1983. Inoculum standardization in
antimicrobial susceptibility testing: evaluation of overnight agar cultures and the rapid
inoculum standardization system. J. Clin. Microbiol. 17:450-457.
6. Marsik, F., G. Evans, J. Fowler, and L. Thompson. 1989. Comparison of the BBL Prompt
system, Abbott A-Just, and visual method for the preparation of Haemophilus influenzae
inoculum for the Bauer-Kirby procedure, abstr. C-67, p. 404. Abstr. 89th Annu. Meet. Am.
Soc. Microbiol. 1989.
7. Doern, G.V., J.H. Jorgensen, C. Thornsberry, D.A. Preston, T.A. Tubert, J.S. Redding, and
L.A. Maher. 1988. A national collaborative study of the prevalence of antimicrobial
resistance among clinical isolates of Haemophilus influenzae. Antimicrob. Agents
Chemother. 32:180-185.
8. Data on file. BD Diagnostic Systems, Sparks, MD, USA.
9. National Committee for Clinical Laboratory Standards. 1990. Approved standard: M2-A4.
Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests, 4th ed. National
Committee for Clinical Laboratory Standards, Villanova, Pa.
PA-254058.06
-5-
10. Azemun, P., T. Stull, M. Roberts, and A.L. Smith. 1981. Rapid detection of chloramphenicol
resistance in Haemophilus influenzae. Antimicrob. Agents Chemother. 20:168-170.
11. Doern, G.V., G.S. Daum, and T.A. Tubert. 1987. In vitro chloramphenicol susceptibility
testing of Haemophilus influenzae: disk diffusion procedures and assays for
chloramphenicol acetyltransferase. J. Clin. Microbiol. 25:1453-1455.
12. National Committee for Clinical Laboratory Standards. 1984. Approved standard: M2-A3.
Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests, 3rd ed. National
Committee for Clinical Laboratory Standards, Villanova, Pa.
13. National Committee for Clinical Laboratory Standards. 1987. Second Informational
Supplement: M100-S2. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing.
National Committee for Clinical Laboratory Standards, Villanova, Pa.
14. Doern, G.V. and R.N. Jones. 1988. Antimicrobial susceptibility testing of Haemophilus
influenzae, Branhamella catarrhalis, and Neisseria gonorrhoeae. Antimicrob. Agents
Chemother. 32:1747-1753.
15. Woods, G.L., and J.A. Washington. 1995. Antibacterial susceptibility tests: dilution and disk
diffusion methods, p. 1327-1341. In P.R. Murray, E.J. Baron, M.A. Pfaller, F.C. Tenover,
and R.H. Yolken (ed.), Manual of clinical microbiology, 6th ed. American Society for
Microbiology, Washington, D.C. USA.
PAKOWANIE / DOSTĘPNOŚĆ
BD Haemophilus Test Medium
Nr katalogowy 254058
Gotowe podłoża na płytkach
hodowlanych, cpu 20
DODATKOWE INFORMACJE
W celu uzyskania dodatkowych informacji należy się skontaktować z lokalnym przedstawicielem
firmy BD.
Becton Dickinson GmbH
Tullastrasse 8 – 12
D-69126 Heidelberg/Germany
Phone: +49-62 21-30 50
Fax: +49-62 21-30 52 16
[email protected]
http://www.bd.com
http://www.bd.com/europe/regulatory/
Prompt is a trademark of 3M
ATCC is a trademark of the American Type Culture Collection
BD, BD Logo and all other trademarks are the property of Becton, Dickinson and Company. © 2013 BD
PA-254058.06
-6-