Ocena przydatności badań laboratoryjnych w diagnostyce

diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics
2012 • Volume 48 • Number 1 • 25-31
Praca oryginalna • Original Article
Ocena przydatności badań laboratoryjnych
w diagnostyce sferocytozy wrodzonej
Usefulness of laboratory diagnostics in hereditary spherocytosis
Wioleta Żarlak1, Anna Adamowicz-Salach2, Olga Ciepiela1, Iwona Kotuła1,
Anna Szmydki-Baran2, Urszula Demkow1
1
Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej i Immunologii Klinicznej Wieku Rozwojowego, Warszawski Uniwersytet Medyczny, 2Katedra i Klinika
Pediatrii, Hematologii i Onkologii, Warszawski Uniwersytet Medyczny
Streszczenie
Wprowadzenie: Sferocytoza wrodzona (ang. HS) jest najczęstszą wrodzoną niedokrwistością hemolityczną w populacji północnoeuropejskiej i Ameryce Północnej. Przyczyną HS są zaburzenia ilościowe i/lub jakościowe białek cytoszkieletu krwinek
czerwonych: α i β spektryny, ankyryny, białka prążka 4.2 i przezbłonowego białka prążka 3.
Cel badań: Celem pracy było porównanie przydatności diagnostycznej testu EMA z użyciem cytometru przepływowego oraz
testu hemolizy krwinek czerwonych w zakwaszonym glicerolu AGLT50w rozpoznawaniu sferocytozy wrodzonej.
Materiał i metody: Badania zostały wykonane we krwi pełnej u 77 pacjentów z podejrzeniem HS. U pacjentów oceniano ekspresję białek błonowych erytrocytów przy pomocy cytometrycznego testu EMA oraz oporność osmotyczną krwinek czerwonych testem AGLT50.
Wyniki: W przeprowadzonych badaniach wykazano, że test EMA charakteryzuje się 92,86% czułością i 100% swoistością
w porównaniu ze 100% czułością i 66,6% swoistością testu AGLT50.
Wnioski: Na podstawie przeprowadzonych badań można stwierdzić, że test EMA lepiej spełnia warunki badania przesiewowego w kierunku sferocytozy wrodzonej niż test AGLT50.
Summary
Introduction: Hereditary spherocytosis (HS) is the most common inherited hemolytic anaemia in Northern Europe and Northern
America. The molecular basis of spherocytosis is a quantitative or qualitative deficiency or dysfunction of one of the erythrocyte’s membrane proteins: α and β spectrin, ankyrin, protein 4.2 or transmembrane band 3 protein.
Aim: The aim of the study was to compare diagnostic usefulness of the flow cytometric (FC) analysis of EMA (eosin-5-maleimide) and acidified glycerol lysis test (AGLT50) in diagnostics of hereditary spherocytosis.
Materials and methods: The study was performed in peripheral blood (PB) from 77 patients suspected of HS. Expression of
erythrocytes membrane proteins was analyzed by FC EMA dye method and osmotic fragility was measured with acidified
glycerol lysis test.
Results: The results of the studies indicate, that sensitivity of the EMA dye method is 92,86%, whereas specificity was 100%.
Although, the sensitivity of AGLT50 was 100%, the specificity was only 66,6%.
Conclusions: On the basis of obtained results it can be concluded, that the eosin-5-maleimide (EMA) binding dye test is more
accurate screening test for hereditary spherocytosis than acidified glycerol lysis test (AGLT50).
Słowa kluczowe:sferocytoza wrodzona, test EMA, test hemolizy krwinek czerwonych w zakwaszonym glicerolu (AGLT50)
Key words:hereditary spherocytosis, the EMA test, acidified glycerol lysis test (AGLT50)
Wstęp
Sferocytoza wrodzona (ang. hereditary spherocytosis, HS),
zwana chorobą Minkowskiego-Chauffarda, jest najczęściej
rozpoznawaną wrodzoną niedokrwistością hemolityczną
w populacji północnoeuropejskiej i Ameryce Północne. Występuje z częstością około 1 przypadek na 2000-5000 urodzeń [1, 2, 3, 4]. Choroba może ujawnić się w każdym wie-
ku, najczęściej jest rozpoznawana w okresie niemowlęcym
i wczesnodziecięcym [1, 5, 6].
Sferocytoza wrodzona jest uwarunkowana genetycznie
i w około 80% przypadków występuje rodzinnie. W około 75%
przypadków dziedziczy się autosomalnie dominująco. Pozostałe 25% dziedziczy się w sposób autosomalny recesywny
i/lub jest wynikiem mutacji powstałych de novo [3, 4, 6, 7, 8].
25
Ocena przydatności badań laboratoryjnych w diagnostyce sferocytozy wrodzonej
HS jest spowodowana zaburzeniami w budowie błony komórkowej krwinek czerwonych, które są wynikiem anomalii
ilościowych i/lub jakościowych białek błony i cytoszkieletu
powstałych na skutek mutacji w genach kodujących te białka.
Obserwuje się niedobór jednego lub kilku białek, najczęściej
α i β spektryny, ankyryny, białka prążka 4.2 i białka prążka
3 [1, 2, 6, 7, 8]. W większości przypadków sferocytozy wrodzonej nie jest znany niedobór białka. Jest to spowodowane
tym, że elektroforezę białek błon erytrocytów (SDS-PAGE)
i badania genetyczne wykonuje się bardzo rzadko [3].
Niedobór białek błonowych i cytoszkieletu jest przyczyną
nieprawidłowej budowy krwinek czerwonych. Cechują się
one osłabieniem budowy cytoszkieletu, zmniejszeniem powierzchni erytrocyta, utratą dwuwklęsłego kształtu i przyjęciem postaci kulistego sferocyta. Takie krwinki mają mniejszą
elastyczność i zdolność do odkształcania podczas przechodzenia przez drobne naczynia włosowate. Uszkodzone
krwinki czerwone są zatrzymywane w układzie siateczkowośródbłonkowym śledziony i następnie niszczone [3, 6, 8, 9].
Przy rozpoznawaniu sferocytozy wrodzonej dziedziczonej
autosomalnie dominująco ważną rolę pełni wywiad i obraz
kliniczny, który potwierdza rodzinne występowanie choroby
i skłonność do zażółcenia powłok skórnych i powiększenia
śledziony. U pacjenta w badaniach laboratoryjnych stwierdza się niedokrwistość, która może być skompensowana,
wzrost średniego stężenia hemoglobiny w krwinkach czerwonych (MCHC) oraz rozpiętość rozkładu objętości erytrocytów (RDW). W rozmazie krwi obwodowej stwierdza się
anizocytozę i poikilocytozę, mogą być obecne mikrosferocyty. Liczba retykulocytów bywa niekiedy znacznie zwiększona. W ciężkiej i umiarkowanej postaci sferocytozy wrodzonej
oporność osmotyczna krwinek czerwonych jest zmniejszona, w łagodnej prawidłowa [3, 6]. W badaniu fizykalnym
dziecka stwierdza się mniej lub bardziej nasilone zażółcenie
białkówek ocznych i skóry, czasem powiększenie śledziony,
zwłaszcza w przebiegu kryzy hemolitycznej, rzadziej obecność kamieni w pęcherzyku żółciowym [1, 3, 5, 6, 8, 9, 10,
11]. W przypadku nietypowego przebiegu choroby konieczne
jest wykluczenie niedokrwistości autoimmunohemolitycznej,
zie krwi obwodowej nie wykrywa się mikrosferocytów lub
są one pojedyncze [3]. Choroby Minkowskiego-Chauffarda
nie można również rozpoznać tylko na podstawie obecności
sferocytów w rozmazie krwi obwodowej, bo mogą się one
pojawiać także w innych chorobach [2, 4, 14].
Badanie oporności osmotycznej metodą Daciego lub za pomocą testu hemolizy krwinek czerwonych w zakwaszonym
glicerolu (AGLT50) nie jest badaniem swoistym dla sferocytozy wrodzonej, choć wykonywanym od wielu lat podczas
przesiewowej diagnostyki tej choroby. Badanie nie pozwala
na rozpoznanie HS bez konieczności wykonywania innych
testów, ponieważ nie różnicuje innych niedokrwistości hemolitycznych jak niedokrwistości autoimmunohemolitycznej
czy niedokrwistości spowodowanych konfliktem serologicznym w układzie AB0, w przebiegu których są obecne sferocyty we krwi obwodowej [2, 3, 8, 9, 10, 12, 15].
Testem służącym do przesiewowej diagnostyki sferocytozy
wrodzonej, który pozwala dość szybko ocenić czy istnieje
niedobór jednego z białek błonowych czy cytoszkieletu krwinek czerwonych, jest test EMA z użyciem cytometru przepływowego. Charakteryzuje się on wysoką czułością i swoistością w rozpoznawaniu HS. Wprowadzenie tego testu,
w 2000 roku przez M.JKing i wsp. poprawiło znacznie możliwości diagnostyczne u osób z łagodną postacią choroby
[16]. W przypadku dużej grupy chorych HS nie była wykrywana przy pomocy badań stosowanych wcześniej, w tym
u noworodków i niemowląt [1, 10, 12, 15].
Zaletą testu EMA jest niewielka ilość materiału potrzebna do
wykonania badania oraz możliwość jego przeprowadzenia
po upływie 3-7 dni od momentu pobrania krwi, ponieważ
upływ czasu nie ma znaczącego wpływu na wynik badania
i jego interpretację [8, 17]. Jest to bardzo ważne u noworodków i niemowląt, które często mają nasiloną hemolizę
i wymagają natychmiastowej transfuzji krwi, a przyczyna niedokrwistości nie jest znana. Wówczas wykorzystuje się do
wykonania testu EMA próbkę krwi pozostałą po wykonaniu
badania morfologii krwi [8, 13, 16, 18].
Bardzo rzadko wykonuje się analizę składu białkowego błony
erytrocytów za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamido-
hemoglobinopatii czy defektów enzymatycznych w krwince
czerwonej (np. niedobór aktywności dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej, kinazy pirogronianowej) [2, 3, 6, 12].
Znacznie trudniejsze w zdiagnozowaniu są łagodne i umiarkowane postacie choroby, oraz dziedziczone autosomalnie
recesywnie. Pacjenci zwykle mają prawidłowe stężenie hemoglobiny i bilirubiny. Liczba retikulocytów może być tylko
nieznacznie zwiększona, a w rozmazie krwi obwodowej
można nie znaleźć mikrosferocytów. Diagnostyka sferocytozy wrodzonej u noworodków i niemowląt również jest bardzo trudna, a to ze względu na fizjologicznie skrócony czas
przeżycia erytrocytów zawierających hemoglobinę płodową,
zwiększoną oporność osmotyczną krwinek, fizjologicznie
zwiększoną liczbę retykulocytów i osłabioną erytropoezę [2,
8, 9, 13].
U około 10% chorych na sferocytozę wrodzoną w rozma-
wym (SDS-PAGE), która pozwala na jakościową i ilościową
ocenę niedoborów białek w błonie, oraz badania genetyczne
identyfikujące mutacje w genach kodujących białka cytoszkieletu. Diagnostykę tę wdraża się tylko w przypadku podejrzenia sferocytozy wrodzonej o nietypowym obrazie lub
ciężkim przebiegu klinicznym [1, 2, 4, 6, 15].
26
Cel pracy
Celem pracy było porównanie przydatności diagnostycznej
testu EMA i testu hemolizy krwinek czerwonych w zakwaszonym glicerolu (AGLT50) w rozpoznawaniu sferocytozy
wrodzonej.
Materiały i metody
Materiał do wykonanych badań stanowiła krew pełna pobierana z żyły łokciowej do probówek zawierających 34% roz-
twór EDTA-K2. Test EMA każdorazowo wykonywano we krwi
pełnej pacjenta i w 5 próbkach krwi dawców z prawidłowymi
wynikami parametrów morfologicznych (próbki referencyjne).
Krew pochodziła od dzieci hospitalizowanych w Klinice Pediatrii, Hematologii i Onkologii Dziecięcej, u których podejrzewano sferocytozę wrodzoną. Grupę badaną stanowiło 77
dzieci: 29 dziewczynek i 48 chłopców w wieku od 1 miesiąca
do 18 lat. Mediana wieku wyniosła 10.
Test EMA.
W celu wykonania testu EMA dla każdego pacjenta i 5
próbek referencyjnych przygotowywano po dwie probówki
wirówkowe typu eppendorf, jedną dla właściwej próbki badanej, a drugą dla odpowiedniej kontroli. Do każdej z nich
dodawano 5 µl krwi i uzupełniano do 1 ml roztworem PBS
(zbuforowany roztwór soli fizjologicznej). Zawartość probówki dokładnie mieszano i wirowano przez 30 sekund z prędkością 8500g na wirówce Mini spin (Eppendorf). Następnie
odrzucano supernatant. Do peletki przepłukanych krwinek
czerwonych (próbka badana) dodawano po 25 µl barwnika
EMA o stężeniu 0,5 mg/ml i inkubowano przez 1 godzinę
w ciemni w temperaturze pokojowej cały czas mieszając
probówki na mieszadle. Do próbek kontrolnych, zamiast
barwnika fluorescencyjnego, dodawano po 25 µl roztworu
PBS i traktowano dalej tak jak próbki badane. Po upływie
czasu inkubacji wszystkie próbki wirowano przy maksymalnej prędkości (8500g przez 30 sekund) i odciągano supernatant. Pozostałą w probówce peletkę krwinek czerwonych
trzykrotnie przepłukiwano 1ml 0,5% roztworu FBS (surowica
płodowa cielęca) w PBS i zawieszano w 500 µl 0,5% roztworu FBS w PBS. Do analizy cytometrycznej pobierano 100
µl zawiesiny wyznakowanych erytrocytów – próbka badana
oraz 100 µl zawiesiny nietraktowanych barwnikiem krwinek
czerwonych – odpowiednia próbka kontrolna, i dodawano je
do 1,4 ml 0,5% roztworu FBS w PBS.
Analizę wyznakowanych krwinek czerwonych przeprowadzano natychmiast. Pomiaru intensywności fluorescencji
barwnika dokonywano przy fali wzbudzenia 495 nm i fali
emisji 520 nm (fluorescencja zielona) w cytometrze przepływowym Cytomics FC 500 (Beckman Coulter). Analizowano
100 000 komórek w każdej próbce.
Oceniano redukcję intensywności fluorescencji u osób chorych w stosunku do średniego wyniku z 5 próbek referencyjnych. Wyniki przedstawiano jako procent obniżenia średniej
fluorescencji barwnika.
Zmniejszenie emisji świecenia barwnika w stosunku do
średniego wyniku uzyskanego w próbkach referencyjnych
wskazuje na obniżenie zawartości białka prążka 3 w błonie komórkowej lub wtórnie innych białek [18]. Obniżenie
wartości średniej fluorescencji w teście EMA poniżej 80%
w stosunku do próbek referencyjnych pozwala na rozpoznanie sferocytozy wrodzonej, przy wartościach powyżej 80%
należy wykluczyć niedokrwistość dyserytropoetyczną typu
II (CDAII) [8]. Dokładna procedura przeprowadzanego testu
została opisana przez autorów wcześniej [19].
Test hemolizy krwinek czerwonych w zakwaszonym glicerolu (AGLT50).
Test hemolizy krwinek czerwonych w zakwaszonym glicerolu wykonywano wg modyfikacji Zanelli i wsp. Zasada metody
polega na określeniu czasu wyrażonego w sekundach, jaki
jest potrzebny do powstania 50% hemolizy krwinek czerwonych zawieszonych w zbuforowanym kwaśnym hipotonicznym roztworze NaCl z glicerolem.
W celu wykonania badania sporządzano hemolizat - dodając
20 µl krwi pełnej do 5 ml wody destylowanej, oraz zawiesinę
krwinek czerwonych w PBS - przez dodanie 20 µl krwi pełnej
do 5 ml roztworu PBS (zbuforowany 0,9% roztwór NaCl o pH
6,85±0,01) i dokładnie mieszano. Następnie w celu przygotowania próby „ślepej” pobierano 1 ml hemolizatu, a w przypadku próby badanej 1 ml zawiesiny krwinek czerwonych
w PBS i przenoszono do kuwet spektrofotometrycznych
o pojemności 4 ml. Do kuwety z próbą „ślepą” dodawano
2 ml odczynnika glicerolowego (23 ml glicerolu i 300 ml roztworu PBS uzupełnione wodą destylowaną do 1 litra), dokładnie mieszano i wstawiano do spektrofotometru Semco
S91E (Emco), celem ustawienia absorbancji światła dla tej
próby. Do kuwety z próbą badaną dodawano 2 ml odczynnika glicerolowego, szybko mieszano i wstawiano do aparatu.
Natychmiast włączano stoper i mierzono absorbancję wyjściową przy długości fali 625 nm. Następnie określano czas
w sekundach, po upływie którego absorbancja wyjściowa
zmniejszyła się o połowę (AGLT50).
Prawidłowy wynik testu AGLT50 wynosi powyżej 1800 sekund. U osób ze sferocytozą wrodzoną, oraz cierpiących na
inne niedokrwistości hemolityczne, jest znacznie skrócony
i wynosi 25 – 150 sekund.
Ocena wybranych parametrów morfologii krwi obwodowej.
Na podstawie wyników rutynowych badań morfologii krwi
obwodowej wykonanych w badanej grupie dzieci dokonano analizy wybranych parametrów takich jak: liczba krwinek
czerwonych (RBC), stężenie hemoglobiny (HGB), wartość
hematokrytu (HCT), średnia objętość krwinki czerwonej
(MCV), średnia masa hemoglobiny w krwince czerwonej
(MCH), średnie stężenie hemoglobiny w krwince czerwonej
(MCHC) i rozpiętość rozkładu objętości erytrocytów (RDW).
Morfologię krwi obwodowej wykonywano we krwi pełnej pobieranej z żyły łokciowej do probówek zawierających 34%
roztwór EDTA-K2 przy pomocy 5-parametrowego („5-diff”)
analizatora hematologicznego HMX (Beckman Coulter).
Analiza statystyczna.
Wyznaczono czułość i swoistość diagnostyczną testu EMA
i AGLT50 wg następujących wzorów:
Czułość = PD / (PD + FU) x 100%, Swoistość = PU / (PU +
FD) x 100%,
gdzie: PD – wyniki prawdziwie dodatnie, FU – wyniki fałszywie ujemne, PU – wyniki prawdziwie ujemne, FD – wyniki
fałszywie dodatnie.
Analizę statystyczną wyników testu EMA i testu hemolizy
27
Ocena przydatności badań laboratoryjnych w diagnostyce sferocytozy wrodzonej
krwinek czerwonych w zakwaszonym glicerolu (AGLT50)
oraz wybranych parametrów morfologii krwi obwodowej
wykonano testem Manna Whitney’a U. Poziom istotności
ustalono dla p<0,05. Korelację między wynikami testu EMA
a wynikami testu hemolizy krwinek czerwonych w zakwaszonym glicerolu liczono za pomocą nieparametrycznego testu
Chi-kwadrat. W celu wyliczenia punktu odcięcia dla wyników
pozytywnych w teście EMA wykreślono krzywą ROC.
Wyniki
Test EMA.
Test EMA wykonano u 77 pacjentów z podejrzeniem choroby Minkowskiego-Chauffarda. W 13 przypadkach (16,9%)
potwierdzono kliniczne rozpoznanie sferocytozy wrodzonej,
ponieważ średnia wartość fluorescencji krwinek czerwonych
w stosunku do referencyjnych kontroli wyniosła poniżej 80%.
U pozostałych 64 pacjentów (83,1%) uzyskany wynik nie pozwalał na rozpoznanie HS, gdyż średnia fluorescencja erytrocytów mieściła się w granicach wartości referencyjnych.
U jednego z pacjentów, u którego wcześniej rozpoznano sferocytozą wrodzoną, nie stwierdzono obniżenia średniej fluorescencji względem wartości referencyjnych, co może być
związane z postawionym wcześniej błędnym rozpoznaniem
i wymaga dalszej analizy.
Wartość średniej fluorescencji po wykonaniu testu EMA dla
chorych na sferocytozę wrodzoną wynosiła 72,43 ± 6,40
MCF (jednostki średniej fluorescencji, ang. mean channel
of fluorescence), a w przypadku pacjentów bez HS 98,67
± 9,18 MCF, p< 0,001. (Ryc. 1). Czułość wykonanego testu
EMA określono na 92,86%, a swoistość na 100%.
*
AUC = 0,9875
Rycina 2
Krzywa ROC dla testu EMA. AUC – pole pod krzywą.
czona powyżej. Powierzchnia pod krzywą (AUC – ang. area
under curie) wynosi 0,9875 przy p<0,0001.
Test hemolizy krwinek czerwonych w zakwaszonym glicerolu (AGLT50).
Badanie oporności osmotycznej erytrocytów za pomocą testu hemolizy krwinek czerwonych w zakwaszonym glicerolu
(AGLT50) wykonano u 28 pacjentów z podejrzeniem sfero-
cytozy wrodzonej. U 12 pacjentów (42,9%) wartość oporności osmotycznej erytrocytów mieściła się w zakresie 25
– 150 sekund, jak w sferocytozie wrodzonej. Jednak tylko
u 4 pacjentów rozpoznanie HS potwierdził test EMA. U pozostałych 8 pacjentów pomimo obniżonej wartości oporności
osmotycznej, nie potwierdzono HS. U 16 pacjentów (57,1%)
test hemolizy krwinek czerwonych w zakwaszonym glicerolu
pozwalał na wykluczenie choroby, ponieważ wartość oporności osmotycznej była prawidłowa.
Średnia wartość oporności osmotycznej krwinek czerwonych u pacjentów chorych na sferocytozę wrodzoną wynosiła 54,00 ± 6,63 sekundy, a u pacjentów bez sferocytozy
1034,5 ± 856,8 sekundy, p= 0,0453 ( Ryc. 3.). Czułość testu
AGLT50 określono na poziomie 100%, jednak jego swoistość
była bardzo niska, gdyż wynosiła tylko 66,6%.
*
Rycina 1
Wartość średniej fluorescencji erytrocytów wyznakowanych barwnikiem EMA z uwzględnieniem odchylenia standardowego (SD)
u pacjentów chorych na sferocytozę wrodzoną i osób zdrowych.
Gwiazdka (*) oznacza,że porównywane grupy wyników różnią się
istotnie statystycznie.
Wyznaczono również punkt odcięcia dla wyników pozytywnych w teście EMA, co obrazuje krzywa ROC przedstawiona
na Ryc. 2. Czułość i swoistość testu EMA dla wyznaczonej
wartości punktu odcięcia - 80,98% jest taka sama jak wyli28
Rycina 3
Średnia wartość oporności osmotycznej krwinek czerwonych
z uwzględnieniem odchylenia standardowego (SD) dla określonych
grup pacjentów: chorych na sferocytozę wrodzoną i zdrowych.
Gwiazdka (*) oznacza, że porównywane grupy wyników różnią się
istotnie statystycznie.
Nie zaobserwowano korelacji pomiędzy wynikami testu EMA
i testu AGLT50 w grupie pacjentów chorych na sferocytozę
wrodzoną i zdrowych, p>0,05.
Ocena wybranych parametrów morfologii krwi obwodowej
u pacjentów z podejrzeniem sferocytozy wrodzonej.
Ocenę liczby krwinek czerwonych i wybranych parametrów
morfologii krwi obwodowej wykonano u 34 dzieci z podejrzeniem HS (9 dziewczynek i 25 chłopców). U 6 pacjentów
wyniki sugerowały sferocytozę wrodzoną a u pozostałych 28
pozwoliły na wykluczenie tej choroby.
Średnia liczba krwinek czerwonych u osób chorych na sferocytozę wrodzoną wynosiła 3,3±0,7 x 10^6/1µl i była niższa
niż u pacjentów bez HS 3,7±0,8 x 10^6/1µl.
Stężenie hemoglobiny u większości przebadanych osób
chorych na sferocytozę wrodzoną i bez HS (25 pacjentów)
było obniżone poniżej 11 g/dl. Stężenie HGB w grupie osób
chorych wynosiło 9,4±2,0 g/dl i było niższe niż u pacjentów
bez HS – 10,5±1,7 g/dl.
Wartość hematokrytu u wszystkich osób z HS była obniżona
i wynosiła 27,0±5,4 %. Średnia wartość hematokrytu u pacjentów bez HS również była obniżona i wynosiła 31,2±5,4 %.
Średnia objętość krwinki czerwonej (MCV) w grupie osób
chorych na HS mieściła się w zakresie wartości referencyjnych i wynosiła 82,7±10,1 fl, podobnie jak dla osób bez HS
– 85,8±8,7 fl.
Średnia masa hemoglobiny w krwince czerwonej (MCH)
u osób chorych na HS wyniosła 28,6±3,1 pg, a u pacjentów
bez HS 28,9±3,0 pg.
Średnie stężenie hemoglobiny w krwince czerwonej (MCHC)
u osób chorych na sferocytozę wrodzoną (HS) wynosiło 34,6±1,2 g/dl i było wyższe niż u pacjentów bez HS –
33,7±1,3 g/dl.
Rozpiętość rozkładu objętości erytrocytów (RDW) dla grupy
pacjentów z HS wynosiła 21,6±8,5 %, a dla pacjentów bez
HS 15,7±3,8 % .
Tabela I.
Średnia wartość RBC, HGB, HCT, MCV, MCH, MCHC i RDW u dzieci chorych na sferocytozę wrodzoną i bez HS.
Badany parametr
Dzieci chore na sferocytozę wrodzoną
Dzieci bez sferocytozy wrodzonej
RBC ± SD x 10^6/1µl
3,3 ± 0,7
3,7 ± 0,8
HGB ± SD [g/dl]
9,4 ± 2,0
10,5 ± 1,7
HCT ± SD [%]
27,0 ± 5,4
31,2 ± 5,4
MCV ± SD [fl]
82,7 ± 10,1
85,8 ± 8,7
MCH ± SD [pg]
28,6 ± 3,1
28,9 ± 3,0
MCHC ± SD [g/dl]
34,6 ± 1,2
33,7 ± 1,3
RDW ± SD [%]
21,6 ± 8,5
15,7 ± 3,8
HCT – hematokryt, HGB –stężenie hemoglobiny, HS – sferocytoza
wrodzona, MCH – średnia masa hemoglobiny w krwince czerwonej,
MCHC – średnie stężenie hemoglobiny w krwince czerwonej, MCV
– średnia objętość krwinki czerwonej, RBC – liczba krwinek czerwonych, RDW – rozpiętość rozkładu objętości erytrocytów.
Wyniki powyżej analizowanych parametrów morfologii krwi
obwodowej nie różnią się istotnie statystycznie.
Opisane dane dotyczące liczby krwinek czerwonych i pozostałych parametrów ocenianych podczas analizy morfologii
krwi obwodowej u dzieci chorych na sferocytozę wrodzoną
i bez HS zostały zebrane w Tabeli I.
Dyskusja.
Sferocytoza wrodzona należy do najczęściej występujących
wrodzonych niedokrwistości hemolitycznych. Objawy kliniczne w przebiegu HS mogą być mało charakterystyczne,
zwłaszcza w łagodnej i umiarkowanej postaci choroby, co
dodatkowo sprawia trudności w rozpoznaniu. Stosowane do
niedawna badania diagnostyczne, opierające się na wyniku
morfologii krwi obwodowej i ocenie rozmazu oraz badaniu
oporności osmotycznej, nie zawsze dają zadawalające wyniki i mogą być nieraz źródłem pomyłek w rozpoznawaniu
sferocytozy wrodzonej [1, 2, 3, 9]. Natomiast wprowadzenie
testu EMA, jako badania o większej swoistości w stosunku
do sferocytozy wrodzonej, pozwoliło na poprawę wykrywalności tej choroby [8, 12, 20].
Celem niniejszej pracy było porównanie przydatności diagnostycznej testu EMA i testu hemolizy krwinek czerwonych
w zakwaszonym glicerolu (AGLT50) w rozpoznawaniu choroby Minkowskiego-Chauffarda, oraz ocena wybranych parametrów morfologii krwi obwodowej.
Test EMA jest badaniem pozwalającym ocenić czy istnieje
niedobór jednego lub kilku białek błony i cytoszkieletu krwinek czerwonych. Zasada testu jest oparta na łączeniu się
barwnika fluorescencyjnego – 5-maleimidu eozyny (EMA)
z lizyną (Lys-430) zawartą w pętli zewnątrzkomórkowej białka prążka 3. Zmniejszenie intensywności świecenia barwnika w stosunku do kontroli w 75-95% przypadków wskazuje
na niedobór jednego lub kilku białek błonowych. W pozostałych przypadkach może być spowodowany niedoborem
innych białek, np. z układu Kell lub Rh, które wpływają na
wiązanie barwnika z białkiem prążka 3 [8, 12, 18].
Zaletą testu EMA jest niewielka ilość materiału jaka jest potrzebna do wykonania badania (10μl - próbka pozostała po
wykonaniu morfologii krwi) oraz możliwość przechowania
próbki przez kilka dni, bez istotnego wpływu na ostateczny wynik (od 3 do 7 dni od momentu pobrania). Pozwala to
na zabezpieczenie materiału do badania w przypadku konieczności wykonania w trybie pilnym transfuzji krwi i wykonanie testu EMA w późniejszym terminie. Taka możliwość
wykonania badania w istotny sposób pomaga w postawieniu prawidłowej diagnozy [17]. Wadą testu EMA może być
konieczność posiadania cytometru przepływowego do jego
wykonania, oraz trudności w interpretacji wyniku testu, jeśli przeprowadza się go we krwi pobranej od wcześniaków,
w której występują duże krwinki płodowe lub od osób z infekcją, ponieważ wówczas następuje wzrost wiązania barwnika
EMA [8].
Przeprowadzone badania wykazały, że test EMA charakteryzuje się bardzo wysoką czułością (92,86%) i swoistością
29
Ocena przydatności badań laboratoryjnych w diagnostyce sferocytozy wrodzonej
(100%) i dlatego jest wiarygodną metodą diagnostyczną
w rozpoznawaniu sferocytozy wrodzonej. Potwierdza to
także King M J i wsp. oraz inni badacze [1, 8, 12, 16, 20].
W swoich pracach podkreślają, że wprowadzenie testu EMA
jako badania przesiewowego w kierunku sferocytozy wrodzonej znacznie poprawi możliwości diagnostyczne, zwłaszcza u pacjentów z łagodną postacią choroby oraz noworodków i niemowląt.
W przedstawionym materiale u jednego z pacjentów ze
zdiagnozowaną wcześniej chorobą Minkowskiego-Chauffarda nie uzyskano obniżenia średniej fluorescencji względem
wartości referencyjnych (wynik fałszywie ujemny). Wynik taki
może być spowodowany przez zły dobór grupy kontrolnej,
niezachowanie odpowiedniego odstępu od ostatniej transfuzji, wysoką retykulocytozą i obecność zwiększonej liczby
dużych krwinek czerwonych czy infekcją wymagającą stosowania antybiotyków. Również znaczny niedobór ankiryny
może mieć wpływ na wynik testu EMA [8, 15, 18, 20].
Bolton-Maggs P H B i wsp. wskazują, że obniżenie średniej wartości fluorescencji (dodatni wynik testu EMA) można
uzyskać w rzadko występujących zaburzeniach erytrocytów
takich jak wrodzona niedokrwistość dyserytropoetyczna
typu II (CDA II), owalocytoza czy kriohydrocytoza [1, 12], ale
obniżenie wartości MFI jest zwykle mniejsze niż u pacjentów
ze sferocytozą [12]. Potwierdzają to również inne prace [10,
16]. Swoistość testu EMA na poziomie 100% uzyskano, gdyż
brak było w grupie badanej wyników fałszywie dodatnich.
Na podstawie przeprowadzonych badań wykazano, że powszechnie wykonywany test hemolizy krwinek czerwonych
w zakwaszonym glicerolu (AGLT50) nie jest tak swoistym
badaniem przesiewowym w kierunku sferocytozy wrodzonej jak test EMA, ponieważ nie wykrywa łagodnych postaci choroby, a na jego wartość mają również wpływ czynniki
niezwiązane z defektem białek cytoszkieletu erytrocytów
[12]. Czułość wykonanego testu AGLT50 określono na 100%,
jego swoistość była bardzo niska i wynosiła zaledwie 66,6%.
Uzyskaną 100% czułość testu hemolizy krwinek czerwonych
w zakwaszonym glicerolu dla HS potwierdzają wyniki otrzymane przez Zanellę i wsp., chociaż Rutherford i wsp. po-
skiego-Chauffarda, ponieważ około 10–20% osób, z umiarkowaną lub łagodną HS, ma prawidłową wartość oporności
osmotycznej erytrocytów [1, 8, 10, 12]. W analizowanym
materiale negatywny wynik testu AGLT50 uzyskano u jednego pacjenta ze sferocytozą wrodzoną. Prawidłową wartość
oporności osmotycznej krwinek czerwonych u osób z HS
(wynik fałszywie ujemny) można także uzyskać w przypadku
niedoboru żelaza, w hiperbilirubinemii pozawątrobowej oraz
w fazie zdrowienia po kryzie aplastycznej, gdy we krwi obwodowej wykrywa się duży odsetek retikulocytów [1, 12].
Stoya G. i wsp. wskazują na silną korelację pomiędzy testem
EMA i testem hemolizy krwinek czerwonych w zakwaszonym glicerolu (AGLT50) w rozpoznawaniu sferocytozy wrodzonej. Postulują, aby oba testy były używane do wykrywania HS, pomimo różnych ich czułości, którą dla testu EMA
i testu AGLT50 określono odpowiednio na 98% i 73% [20].
Przeprowadzone przez nas badania nie potwierdziły tego,
gdyż nie obserwowano korelacji pomiędzy testem EMA i testem AGLT50.
Test AGLT50 nie pozwala na pewne zdiagnozowanie sferocytozy wrodzonej bez wykonywania dodatkowych badań
diagnostycznych, ponieważ na jego podstawie nie można
odróżnić HS od innych niedokrwistości hemolitycznych,
w przebiegu których obecne są sferocyty we krwi obwodowej
[1]. Dotychczas uważano, że dzięki jego wysokiej czułości
oraz temu, że jest szybkim, prostym i tanim badaniem, jest
użytecznym testem przesiewowym służącym do diagnostyki
sferocytozy wrodzonej [5].
Z przeprowadzonej analizy morfologii krwi obwodowej wynika, że liczba krwinek czerwonych oraz parametry czerwonokrwinkowe u chorych na sferocytozę wrodzoną mogą być
prawidłowe. Sytuacja taka ma miejsce w przypadku skompensowanej niedokrwistości. Uzyskane wyniki świadczą zatem o tym, że ocena morfologii krwi obwodowej podobnie
jak analiza rozmazu ręcznego pełnią tylko rolę pomocniczą
w rozpoznawaniu choroby Minkowskiego-Chauffarda.
W sferocytozie wrodzonej o łagodnym przebiegu klinicznym
nie zaobserwowano w morfologii krwi obwodowej istotnych
odstępstw parametrów od zakresów wartości referencyjnych,
dają, że czułość tego testu jest nieco niższa (92,3%) [5].
W wykonanych badaniach obniżoną wartość oporności
osmotycznej odnotowano nie tylko u wszystkich chorych
na sferocytozę wrodzoną, ale i u dzieci bez HS, u których
nie można było wykluczyć innych chorób przebiegających
z obecnością sferocytów we krwi obwodowej. Ponieważ
obniżoną wartość wyników tego testu obserwuje się także
u osób chorych na niedokrwistość autoimmunohemolityczną, ostre białaczki, przewlekłą białaczkę szpikową, mielofibrozę oraz u pacjentów z przewlekłą niewydolnością nerek
i u kobiet w ciąży, opierając się jedynie na jego wyniku nie
można postawić ostatecznego rozpoznania [5]. W tym zakresie otrzymane wyniki potwierdzają doniesienia innych
badaczy [11, 14].
Prawidłowa wartość testu hemolizy krwinek czerwonych
w zakwaszonym glicerolu nie wyklucza choroby Minkow-
co potwierdza badanie wykonane przez Bolton-Maggsa P H
B i wsp. [1]. Badaną grupę stanowiły dzieci z medianą wieku = 10, dla której nie udało się wykazać charakterystycznych dla sferocytozy wrodzonej znaczących zmian wartości
wskaźników czerwonokrwinkowych (wzrost wartości MCHC
i RDW). Wyniki takie są zwykle stwierdzane w grupie dorosłych chorych z HS [1, 9].
Przeprowadzone badania upoważniają do wyciągnięcia
wniosku, że najlepszym badaniem przesiewowym w kierunku sferocytozy wrodzonej jest test EMA. Zdecydowanym ograniczeniem w stosowaniu tej metody w rutynowej
diagnostyce są niestety wysokie wymagania sprzętowe (cytometr przepływowy z laserem argonowym, umożliwiający
odczyt fali o długości 520 nm). Uzyskane wyniki pozwalają
również stwierdzić, że prawidłowe postawienie diagnozy powinno opierać się nie tylko na dodatnim wyniku testu EMA,
30
ale przede wszystkim na dobrze zebranym wywiadzie klinicznym, badaniu fizykalnym pacjenta oraz wynikach dodatkowych badań diagnostycznych obejmujących morfologię
krwi obwodowej z rozmazem, oceną liczby retykulocytów
i stężenia bilirubiny.
Wnioski
1. Test EMA jest lepszym testem przesiewowym w rozpoznawaniu sferocytozy wrodzonej niż test hemolizy krwinek
czerwonych w zakwaszonym glicerolu (AGLT50).
2. Wprowadzenie testu EMA do rutynowej diagnostyki sferocytozy wrodzonej znacznie poprawiło jej rozpoznawanie, szczególnie u pacjentów z łagodną postacią choroby
oraz u noworodków i niemowląt.
3. Test hemolizy krwinek czerwonych w zakwaszonym glicerolu (AGLT50) nie jest swoisty dla sferocytozy wrodzonej
i nie pozwala na zróżnicowanie jej od innych niedokrwistości
przebiegających z obecnością sferocytów.
4. W morfologii krwi obwodowej u pacjentów ze sferocytozą
wrodzonej można nie znaleźć nieprawidłowości poszczególnych parametrów czerwonokrwinkowych.
13. Adamowicz-Salach A, Zdebska E, Matysiak M, GołębiowskaStaroszczyk S. Postępy w diagnostyce wrodzonych niedokrwistości hemolitycznych u niemowląt i dzieci w Polsce. Fam Med
Prim Care Rev 2007; 9: 589-591.
14. Kłopocka J, Jabłońska-Skwiecińska E. Wstępna ocena znaczenia diagnostycznego próby hemolizy w zakwaszonym glicerolu.
Diagn Lab 1993; 29: 315-318.
15. Bogusławska DM, Heger E, Sikorski AF. Molekularny mechanizm dziedzicznej sferocytozy. Merkuriusz Leki 2006. XX: 112116.
16. King MJ, Behrens J, Rogers C, et al. Rapid flow cytometric test
for the diagnosis of membrane cytoskeleton-associated hemolytic anemia. Br J Hematol 2000; 111: 924-933.
17. Szmydki-Baran A, Adamowicz-Salach A, Gołębiowska-Staroszczyk S i wsp. Ocena wpływu długości przechowywania próbki krwi na wynik testu EMA. Doniesienie wstępne. Pediatr Pol
2009; 84: 423-425.
18. King MJ, Smythe JS, Mushens R. Eosin-5-maleimide binding
to band 3 and Rh relatedproteins forms the basis of a screening test for hereditary spherocytosis. Br J Hematol 2004; 124:
106-113.
19. Potapińska O, Kotuła I, Zalewska W i wsp. Test EMA w diagnostyce sferocytozy wrodzonej. Diagn Lab 2008; 44: 389-399.
20. Stoya G, Gruhn B, Vogelsang H, et al. Flow
�����������������������
cytometry as a diagnostic tool for hereditary spherocytosis. Acta Haematol 2006;
116: 186-191.
Piśmiennictwo
1. Bolton-Maggs PHB, Stevens RF, Dodd NJ, et al. Guidelines for
the diagnosis and management of hereditary spherocytosis. Br
J Haematol 2004; 126: 455-474.
2. Christensen RD, Henry E. Hereditary Spherocytosis in Neonates with Hyperbilirubinemia. Pediatrics 2010; 125: 120-125.
3. Mariani M, Barcellini W, Varcellati C, et al. ������������������
Clinical and hematologic features of 300 patients affected by hereditary spherocytosis grouped according to the type of the membrane protein
defekt. Haematologica 2008; 93: 1310-1317.
4. Webb D. Disorders of the red cell membrane. ���������������
Current Paediatrics 2005; 15: 40-43.
5. Apel D, Mariańska B, Maj S. Wartość diagnostyczna testu lizy
krwinek czerwonych w zakwaszonym glicerolu (AGLT) we wrodzonej niedokrwistości sferocytowej i wybranych zespołach hematologicznych. Acta Haematol Pol 1993; 44: 267-271.
6. Iolascon A, Avvisati RA. Genotype/phenotype correlation in hereditary spherocytosis. Haematologica 2008; 93: 1283-1288.
7. Adamowicz-Salach A, Matysiak M, Albrecht-Stanisławska K.
Niedokrwistości hemolityczne związane z wrodzonym niedoborem białek błony komórkowej krwinek czerwonych – diagnostyka i leczenie. Klin Pediatr 2005; 13: 327-332.
8. Adamowicz-Salach A, Szmydki-Baran A, Gołębiowska-Staroszczyk S i wsp. Przydatność cytometrycznej analizy białek cytoszkieletu i błon erytrocytów (test EMA) w diagnozowaniu wrodzonych niedokrwistości hemolitycznych u dzieci. Pediatr Pol 2009;
84: 419-422.
9. Adamowicz-Salach A. Sferocytoza wrodzona. Onkologia i hematologia dziecięca. Chybicka A, Sawicz-Birkowska K (red.).
Wydawnictwo Lekarskie PZWL Warszawa 2008: 884-889.
10. Adamowicz-Salach A, Zdebska E, Spychalska J i wsp. Postępy
w rozpoznawaniu sferocytozy wrodzonej u niemowląt i dzieci
w Polsce. Pediatr Pol 2006; 81: 347-250.
11. Adamowicz-Salach A. Standardy rozpoznawania wrodzonych
niedokrwistości hemolitycznych. Onkohematologia dziecięca –
co nowego? Kowalczyk JR (red.), Cornetis Wrocław 2009: 5766.
12. Kar R, Mishra P, Pati P. Evaluation of eosin-5-maleimide flow
cytometric test in diagnosis of hereditary spherocytosis. Int Jnl
Lab Hem 2010; 32: 8-16.
Zaakceptowano do publikacji 17.01.2012
Adres do korespondencji:
mgr Wioleta Żarlak
Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej i Immunologii
Klinicznej Wieku Rozwojowego
Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego
00-576 Warszawa, ul. Marszałkowska 24
tel/fax. (22) 6296517
wiola. [email protected]
31