Przegląd piśmiennictwa • Journal Club Nomenklatura wariantów

Przegląd piśmiennictwa • Journal Club Nomenklatura wariantów

diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics
2011 • Volume 47 • Number 3 • 357-366
Przegląd piśmiennictwa • Journal Club
Nomenklatura wariantów genetycznych
w zaburzeniach hemostazy.
Aktualne wytyczne Komitetu Naukowego
i Standaryzacyjnego Międzynarodowego
Towarzystwa Badań nad Krzepnięciem
(ISTH - International Society on Thrombosis and Haemostasis)
W ciągu ostatnich dziesięciu lat dwie międzynarodowe organizacje, t.j. Human Genome Organisation (HUGO) oraz
International Federation of Human Genetics Societies przy
współpracy z Human Genome Variation Society (HGVS)
podjęły wysiłek wprowadzenia ujednoliconej terminologii
do opisywania wariantów sekwencji ludzkiego genomu.
Diagnostyka molekularna (genetyczna) zaadoptowała tę
terminologię z powodzeniem, choć zdarza się często, że
w niektórych obszarach diagnostyki, tak jest na przykład
w koagulologii, stosuje się terminologię historyczną, zwyczajową, opierającą się o idiosynkratyczne nazwy genów lub
białek. Wynika to z faktu, że większość genów czynników
krzepnięcia została sklonowana w latach osiemdziesiątych,
jeszcze przed wprowadzeniem standaryzowanej nomenklatury. Aby uniknąć nieporozumień na tym polu, Komitet
Naukowy i Standaryzacyjny ISTH wydał kolejno w latach
2001 i 2003 zalecenia dotyczące ujednoliconej nomenklatury opartej o konwencję HGVS dla mutacji i polimorfizmów
genu czynnika von Willebranda (vWF) oraz antygenów płytkowych. Cytowany artykuł opisuje pokrótce aktualne zalecenia Komitetu Nomenklatury Genetycznej HUGO (Gene
Nomenclature Committee - HGNC) w odniesieniu do diagnostyki genetycznej zaburzeń hemostazy. Ponadto na stronie
internetowej czasopisma (http://onlinelibrary.wiley.com/
doi/10.1111/jth.2011.9.issue-4/issuetoc) dostępne są, jako
załączniki, przykłady poprawnej pisowni oraz szczegółowe
notacje dla konkretnych mutacji genowych, polimorfizmów
i wariantów poszczególnych białek czynników krzepnięcia.
Nazwy genów. Symboliczny opis każdego genu składa się
z kilku liter alfabetu łacińskiego oraz cyfr arabskich, które odnoszą się do nazwy genu i nie zawierają informacji odnośnie
gatunku. Stosuje się natomiast hierarchię dotycząca rodziny
genów (np. czynników krzepnięcia czy antygenów płytkowych). Dla odróżnienia, że stosowany symboliczny opis dotyczy genu a nie białka, zapisu dokonuje się kursywą; geny
czynników krzepnięcia II, V i VIII: F2, F5 i F8, odpowiednio; geny glikoprotein płytkowych: GP1BA, GP1BB i GP6.
W przypadku pseudogenów dodatkowo na końcu stosuje
się literę P; pseudogeny dla vWF lub białka S, odpowiednio:
VWFP and PROSP.
Zmiany sekwencji DNA. Adenina (A) z kodonu startowego
dla każdego białka (ATG – kodon dla aminokwasu metioniny)
jest numerowana jako +1; kolejny 5’-nukleotyd jest numerowany jako -1 (nie ma nukleotydu 0). Przy opisie zmian w sekwencji DNA podawana jest litera „c.” gdy zmiana dotyczy nukleotydu; pozycja nukleotydu: 567, 456; symbol nukleotydu: A,
T, C, G, odpowiednio; rodzaj zmiany: substytucja „>”, delecja
„del”, insercja „ins”. Przykładowo: c.567A>T oznacza zamianę
nukleotydu A na T w pozycji 567; c.345_7del3TAG oznacza
delecje trzech nukleotydów w pozycji 345-347. Jeśli mutacja
dotyczy sekwencji intronowej, podaje się pozycję najbliższego egzonu oraz liczbę nukleotydów od niej: c.456 +2T>C. Nie
stosuje się w terminologii genetycznej strzałek „→”.
Zmiany sekwencji aminokwasów. Odpowiednio do zasady numerowania nukleotydów, w pozycji +1 znajduje się
metionina (Met). W przypadku białek czynników krzepnięcia, które ulegają postranslacyjnym modyfikacjom, sekwencje sygnałowe lub sekwencje propetydów są numerowane
ujemnie, gdyż początek sekwencji liczony jest od pierwszego aminokwasu dojrzałego białka. Nie stosuje sią strzałek
(substytucje) ani oznaczeń pozycji aminokwasu w postaci
indeksu górnego. W praktyce klinicznej zaleca się oznaczenia trzyliterowe dla aminokwasów, jednoliterowe są akceptowane w publikacjach naukowych: p.Gly143Ser (p.G143S).
Insercje i delecje oznacza się podając pozycje flankujących
aminokwasów, odpowiednio: p.Lys45_Leu46insGlnSer
(p.K_45L46insQS).
Sekwencje referencyjne (RefSeq) i numery dostępu do
polimorfizmów genowych (rs)
Amerykańskie Centrum Biotechnologii i Informacji (American
National Centre for Biotechnology Information - NCBI) prowadzi rejestr sekwencji genomowych, transkryptomowych
i białek (peptydów), co pozwala na wolny dostęp do zintegrowanych informacji pochodzących z różnych źródeł.
Każdy opis sekwencji, dotyczy to także wyników badań
diagnostycznych oraz publikacji, powinien zawierać numer RefSeq dla DNA lub białka, na podstawie którego dokonano analizy wariantow genetycznych. Dla przykładu,
wynik badania mutacji dla genu VWF powinien zawierać:
pozycję nukleotydu liczoną od „A” dla kodonu Met, pozycję
aminokwasu liczoną od Met oraz sekwencje referencyjne
dla nukleotydów (RefSeq NM_000552.x) i aminokwasów
(RefSeq NP_000543.x). Numery dostępu (rs; RefSNP accesion numbers) są używane do opisania pojedynczej
mutacji (polimorfizmu) nukleotydowego (SNP; single nucleotide polymorphism) i są odnośnikiem do odpowiedniej
bazy polimorfizmow (dbSNP).Numery rs powinny być użyte
przede wszystkim do opisu mutacji w celu ułatwienia jej jednoznacznej identyfikacji.
Zastosowanie nowej nomenklatury genetycznej
Dostęp do aktualizowanej bazy danych czynnikow krzepnięcia prowadzonej przez ISTH (CoagBase) http://www.isth.
org/default/index.cfm/standards/coagbase/ ułatwia wpro357
Przegląd piśmiennictwa
wadzenia nowej, wystandaryzowanej nomenklatury do opisu
wariantów genetycznych czynników krzepnięcia.
Według: Goodeve AC, Reitsma PH, McVey JH, on behalf of
the Working Group on Nomenclature of the Scientific and
Standardisation Committee of the International Society on
Thrombosis and Haemostasis. Nomenclature of genetic
variants in hemostasis. J Thromb Haemost. 2011; 9: 852–5.
DOI: 10.1111/j.1538-7836.2011.04191.x
Opracowała: Ewa Stępień
Katedra i Zakład Biochemii Klinicznej, CMUJ, Kraków
Ustalenie wartości referencyjnych wskaźników przebudowy tkanki kostnej u dzieci
i młodzieży
Do najważniejszych procesów odpowiedzialnych za optymalny rozwój szkieletu w dzieciństwie i w okresie dojrzewania należą: wzrost kości na długość, modelowanie i remodelowanie. Modelowanie obejmuje procesy resorpcji
i tworzenia kości związane ze zmianą rozmiarów i kształtu
szkieletu w czasie wzrostu. Podczas modelowania proces
kościotworzenia przeważa nad procesem resorpcji, co prowadzi do wzrostu kości na długość i grubość. Modelowanie
występuje w dzieciństwie oraz w okresie dojrzewania, w różnych miejscach anatomicznych szkieletu. Remodelowanie,
czyli proces przebudowy wewnętrznej tkanki kostnej, umożliwia naprawę mikrouszkodzeń i regenerację po złamaniach;
remodelowanie trwa przez całe życie.
Do oceny ilościowej i jakościowej kośćca u dzieci tradycyjnie wykorzystuje się badanie densytometryczne (DXA).
W przeciwieństwie do pomiaru DXA biochemiczne wskaźniki przebudowy tkanki kostnej odzwierciedlają dynamiczną
naturę tkanki kostnej. Niewątpliwą zaletą stosowania markerów przebudowy kostnej jest to, że umożliwiają powtórzenie
badania, w razie potrzeby, po znacznie krótszym czasie niż
pozostałe metody oraz pozwalają monitorować zmiany tempa przebudowy kości i jej mikroarchitektury oraz struktury
kolagenu zanim nastąpią zmiany masy kostnej, czy dojdzie
do progresji choroby u dzieci.
Biochemiczne wskaźniki przebudowy kości są to fragmenty
białkowych elementów strukturalnych kości powstające podczas jej syntezy lub degradacji oraz enzymy specyficzne dla
komórek kostnych, uwalniane do krążenia w czasie aktywności metabolicznej osteoblastów i osteoklastów. Markery
przebudowy kości ze względu na proces, który odzwierciedlają dzieli się na: markery tworzenia kości oraz markery
resorpcji. Markery tworzenia kości są syntetyzowane przez
osteoblasty i odzwierciedlają różne aspekty ich aktywności.
Do markerów tworzenia kości zalicza się: m.in. frakcję kostną fosfatazy alkalicznej (b-ALP), propeptydy prokolagenu
typu I (PICP, PINP) a także osteokalcynę (OC), którą raczej
358
uważa się za marker obrotu kostnego. Większość markerów resorpcji kości stanowią produkty rozpadu kolagenu,
do których zalicza się: C-końcowy usieciowany telopeptyd
łańcucha α kolagenu typu I (CTx), N-końcowy telopeptyd
łańcucha α kolagenu typu I (NTx), pirydynolinę (PYD), deoksypirydynolinę (DPD), C-końcowy telopeptyd kolagenu
typu I (ICTP, CTx-MMP), hydroksyprolinę. Do markerów resorpcji zalicza się także enzymy m.in. winianooporną fosfatazę kwaśną (TRAP). Wskaźniki przebudowy tkanki kostnej
u dzieci zdrowych, w przeciwieństwie do zdrowych dorosłych, charakteryzują się dużą zmiennością osobniczą,
występują w wysokich stężeniach we krwi i ściśle korelują
z szybkością wzrastania.
W omawianej pracy podjęto próbę wyznaczenia wartości referencyjnych dla wybranych wskaźników przebudowy tkanki kostnej u dzieci zdrowych. Autorzy oprócz wpływu wieku
i płci, zbadali wpływ stanu odżywienia na stężenie markerów kostnych oraz wyliczyli pediatryczny przedział wartości
referencyjnych zgodnie z zaleceniami CLSI 28-A3 (Clinical
and Laboratory Standards Institute, dokument 28-A3). Do
badań, spośród 356 osobników, włączono 345 dzieci i młodzieży w wieku od 6 do 16 roku życia. Przy wyznaczaniu
wartości referencyjnych wykluczono dzieci charakteryzujące
się wartościami BMI z -scores <-2 lub >+2, nieprawidłowym
stężeniem zarówno witaminy D jak i PTH oraz dzieci stosujące wziewne sterydy w leczeniu astmy oraz przyjmujące leki
stosowane w leczeniu chorób tarczycy.
W surowicy krwi oznaczono stężenie fosfatazy alkalicznej
(ALP), frakcji kostnej fosfatazy alkalicznej (b-ALP), N końcowego propeptydu prokolagenu typu 1 (P1NP), osteokalcyny,
CTx, PTH oraz 25OH witaminy D3. Wyznaczone przedziały referencyjne wykazały zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami istotną zależność wskaźników przebudowy tkanki
kostnej od wieku i płci oraz stadium dojrzewania płciowego.
Stężenie witaminy D3 wywiera istotny wpływ na wartości
wskaźników przebudowy tkanki kostnej, zwłaszcza w okresie dojrzewania płciowego. Wartości wszystkich markerów
z wyjątkiem ALP były istotnie wyższe w okresie dojrzewania
płciowego u dzieci charakteryzujących się stężeniem witaminy D3 > 75 nmol/L (>30 ng/mL).
Na poziom wskaźników przebudowy tkanki kostnej u dzieci
wpływają: wiek, płeć, etap dojrzewania płciowego określonego w skali Tannera oraz, zwłaszcza w okresie dojrzewania
płciowego, stężenie witaminy D. Czynniki te odgrywają istotną rolę w wyznaczaniu wartości referencyjnych wskaźników
przebudowy tkanki kostnej u zdrowych dzieci.
Według: Y. Huang, E. Eapen, S. Steele, V. Grey: Establishment of reference intervals for bone markers in children and
adolescents. Clin Biochem 2011; 44: 771–778
Opracowała: Agnieszka Pater
Katedra i Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej,UMK CM,
Bydgoszcz
Przegląd piśmiennictwa
Peptydy natiuretyczne u dzieci: fizjologia
i kliniczna użyteczność
Do natiuretycznych peptydów zalicza się: przedsionkowy
peptyd natriretyczny (ANP), mózgowy peptyd natriuretyczny (BNP), zwany również peptydem natriuretycznym typu
B oraz peptyd natriuretyczny typu C (CNP). Przedsionkowy
peptyd natriuretyczny jest syntetyzowany, magazynowany
i uwalniany przede wszystkim w warstwie podwsierdziowej
miocytów przedsionków serca, w mniejszym stężeniu w komorach serca i mózgu. W komórkach mięśniowych przedsionków serca człowieka od N-końca prepro- ANP ulega
odszczepieniu peptyd sygnałowy i powstaje pro-ANP, który
zawiera 126 aminokwasów. W przeciwieństwie do ANP, BNP
nie jest magazynowany, lecz wydzielany zaraz po wytworzeniu. Poziom BNP może się zwiększać w wyniku: tachykardii
nadkomorowej, oddziaływania hormonów tarczycy, glikokortykosteroidów oraz peptydów wazoaktywnych: endoteliny 1
i angiotensyny II. Mózgowy peptyd natriuretyczny jest syntetyzowany w postaci propeptydu (pro-BNP).
U zdrowych dzieci stężenie ANP (zakres referencyjny 2,498 pg/ml) wzrasta w odpowiedzi na przedsionkowe napięcie
ścian naczyń mające miejsce przy zwiększonej objętości
wewnątrznaczyniowej. Choroby serca związane z nadmierną objętością przedsionkową i nadciśnieniem prowadzą do
20-krotnego wzrostu stężenia ANP oraz jeszcze większego
wzrostu stężenia BNP. Stężenie BNP wzrasta w dzieciństwie,
aż do osiągnięcia wieku dojrzałego. Obserwuje się wyższe
stężenia u dziewczynek w okresie dojrzewania płciowego
i dorosłych kobiet w porównaniu do mężczyzn, co prawdopodobnie wynika z hamującego działania testosteronu na
tworzenie BNP. Sugeruje się, że u dzieci u których występują objawy choroby sercowo-naczyniowej, stężenia BNP
u noworodków przekraczające 170 pg/ml, a w grupie pacjentów starszych - 41 pg/ml, mogą wskazywać na anatomiczne
uszkodzenia w obrębie serca.
CNP cechuje krótki okres połowicznego rozpadu i jego stężenie w krążeniu jest niskie. Stężenie NTproCNP w osoczu
koreluje ze wzrostem szkieletu i markerami tworzenia kości
u dzieci i noworodków.
BNP i NTproBNP są klinicznie użytecznymi narzędziami
diagnostycznymi i prognostycznymi markerami choroby sercowo-naczyniowej u dzieci. Stężenia BNP i/lub NTproBNP
są podwyższone u dzieci z trwałym nadciśnieniem płucnym
rozpoczynającym się w okresie noworodkowym, nadciśnieniem płucnym u starszych pacjentów, wrodzoną chorobą
serca, kardiomiopatią, chorobą Kawasaki (skórno-śluzówkowy zespół węzłów chłonnych) i zastoinową niewydolnością
serca. Stężenie NTproBNP jest także podwyższone u dzieci
z bezdechem sennym, obniża się natomiast do wartości prawidłowych po wycięciu migdałków. Podwyższone stężenie
NTproBNP stwierdzane w ostrym stadium gośćcowego zapalenia serca ulega normalizacji po zastosowaniu właściwego leczenia.
BNP u dzieci poddanych zabiegom chirurgicznym na sercu
lub transplantacji jest również użytecznym markerem prognostycznym. U dzieci z wrodzoną chorobą serca przeciętne
stężenie BNP (próbki krwi pobierane co 6 godzin przez 24
godziny) podczas pierwszego pooperacyjnego dnia koreluje
z ciężkością choroby, czasem trwania procedury otwierania
klatki piersiowej, potrzebą wentylacji i długością hospitalizacji. U dzieci po transplantacji serca stężenie BNP powyżej
250 pg/ml wskazuje na gorszą prognozę i konieczność intensywnej obserwacji z powodu zwiększonego ryzyka zgonu
lub potrzeby ponownej transplantacji.
Według: A.M. Lenz. Natriuretic peptides in children: physiology and clinical utility. Curr Opin Pediatr 2011; 23: 452–459
Opracowała: Agnieszka Pater
Katedra i Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej,UMK CM,
Bydgoszcz
Immunogenność indukowanych komórek
pluripotencjalnych
Indukowane komórki pluripotencjalne (ang.: induced pluripotent stem cells - iPS cells) wytwarzane z komórek somatycznych są nadzieją medycyny regeneracyjnej jako odnawialne źródło autologicznych komórek dowolnej tkanki.
Pomimo odgórnego założenia, że takie komórki nie powinny
być odrzucane przez biorcę, badania nad immunogennością
komórek iPS nie zostały dotychczas szczegółowo przeprowadzone. Aby sprawdzić czy komórki iPS są immunogenne,
wykorzystano zdolność komórek pluripotencjalnych do tworzenia potworniaka (Teratoma) in vivo.
Syngeniczne, embrionalne komórki macierzyste pozyskiwane z embrionów myszy szczepu B6 (B6 ESC) wprowadzone
podskórnie myszom szczepu B6 wytwarzały potworniaka,
który nie wykazywał oznak odrzucenia. Stwierdzano to na
podstawie braku wykrywalnej infiltracji limfocytów T CD4+.
Wykorzystanie allogenicznych komórek pochodzących
z niespokrewnionego szczepu 129 (129 ESC) powodowało
odrzucenie przeszczepu objawiające się brakiem lub niewielkim wzrostem potworniaków, które wykazywały silną
infiltrację limfocytów T CD4+. Możliwość powstawania komórek CD4+ z wszczepianych komórek pluripotencjalnych
została wykluczona poprzez testy tworzenia potworniaka
z użyciem komórek B6 ESC oraz 129 ESC na myszach
szczepu NOD-SCID. Żadne z powstałych potworniaków nie
posiadały śladów infiltracji limfocytów T. Powyższe doświadczenia pozwoliły stwierdzić, iż test tworzenia potworniaka jest
odpowiednim do weryfikacji immunogenności komórek iPS.
Pierwszą populacją testowanych komórek były komórki
iPS (ViPSC) wytworzone przez reprogramowanie komórek
somatycznych szczepu B6 przy pomocy transdukcji wektorami wirusowymi zawierającymi geny pluripotencjalności
takie jak Oct4 i Sox2. Komórki te posiadały prawidłowy fe359
Przegląd piśmiennictwa
notyp pluripotencjalny, były w stanie wytworzyć potworniaka
u myszy NOD-SCID oraz przechodziły pozytywnie test komplementacji blastocysty tworząc myszy-chimery. Po wstrzyknięciu syngenicznym myszom B6 powodowały powstawanie
potworniaków, których rozmiar był znacznie mniejszy, niż
w przypadku kontroli z zastosowaniem myszy NOD-SCID.
Analiza histochemiczna wykazała, że potworniaki posiadały
infiltrację limfocytami T. Przyczyną tego mogła być nadekspresja genu Oct4 spowodowana permanentnym wprowadzeniem dodatkowych kopii w trakcie reprogramowania, co
zostało wcześniej pokazane przez inną grupę badawczą.
Żeby wykluczyć taką możliwość, wytworzono populację komórek iPS z użyciem nieintegrującego wektora plazmidowego (EiPSC), oraz przetestowano ją na obecność niespecyficznych miejsc integracji. EiPSC były w stanie wytworzyć
potworniaka u syngenicznych myszy szczepu B6 ze zdecydowanie większą wydajnością niż ViPSC. Mimo to, guzy były
mniejszych rozmiarów od tych zaobserwowanych u kontroli
NOD-SCID oraz posiadały ślady inwazji limfocytów T.
W celu zrozumienia różnic pomiędzy B6 ESCs a B6 EiPSC
porównano profile ekspresji genów w potworniakach wytworzonych przez oba typy komórek. Zaobserwowano wzrost
ekspresji kilku testowanych genów (m.in. Lce1f, Zg16, Retn,
Hormad1). Aby sprawdzić, czy geny te mogą mieć wpływ
na odrzucenie potworniaków pochodzących z EiPSC zmodyfikowano genetycznie wektorami plazmidowymi komórki
B6 ESC, wprowadzając każdy z genów osobno oraz pusty
wektor jako kontrolę negatywną. Powstałe linie komórkowe
testowano na szczepach B6. Potworniaki zostały wytworzone przez komórki kontroli negatywnej oraz te posiadające nadekspresję genów Lce1f oraz Retn. Z drugiej strony,
znaczna część iniekcji komórek Zgy16-B6 ESC oraz Hormad-B6 ESC nie doprowadziła do powstania potworniaków,
a te powstające wykazywały dużą infiltrację limfocytami T.
Kontrola z wykorzystaniem myszy NOD-SCID nie wykazała
różnic między populacjami modyfikowanych komórek.
Zmniejszenie rozmiaru potworniaków oraz odrzucenie komórek powstałych z B6 ViPS, jak i Zgy16-B6 ESC oraz Hormad-B6 ESC, tak intensywne u dzikich myszy szczepu B6,
nie zostało jednak zaobserwowane w przypadku zmodyfikowanych szczepów B6 CD4-/- oraz B6 CD8-/-. Wskazuje to, iż
wrodzona odporność nie odgrywa istotnej roli w odrzucaniu
komórek potworniaka wytworzonego z komórek iPS. O udziale odporności nabytej w odrzucaniu potworniaków świadczy
fakt, iż nadekspresja genów Zgy16 oraz Hormad1 w komórkach dendrytycznych stymulowanych lipopolisacharydem
powodowała wydzielanie interferonu γ przez limfocyty T in
vitro. W tym samym eksperymencie komórki dendrytyczne
transfekowane pustym wektorem oraz wykazujące ekspresję genów eGFP i Retn nie dawały takiego efektu. Pomimo
niezidentyfikowania specyficznych peptydów odpowiedzialnych za aktywacje limfocytów T stwierdzono jednoznacznie,
iż niefizjologiczny poziom ekspresji genów Hormad1 i Zg16
powoduje immunogenność komórek powstałych z EiPS
u organizmów syngenicznych. Nadekspresja Hormad1 zo360
stała także stwierdzona w komórkach iPS szczepu B6 otrzymanych za pomocą adenowirusów, wektorów plazmidowych
oraz białek rekombinowanych.
Podsumowując, zmiany w ekspresji niektórych genów przyczyniają się do różnic pomiędzy komórkami powstałymi z komórek iPS i ESC pochodzącymi z tego samego organizmu.
Niefizjologiczna ekspresja niektórych genów może być przyczyną odrzucania przez syngenicznych biorców komórek
wytworzonych z indukowanych komórek pluripotencjalnych.
Niezbędna jest zatem optymalizacja wytwarzania komórek
iPS mająca na celu zmniejszenie epigenetycznych różnic
dzielących je od komórek embrionalnych. Przedstawiona
metoda testu immunogenności in vivo może stać się wydajnym narzędziem służącym do ulepszenia technologii reprogramowania komórek somatycznych.
Według: Zhao T, Zhang ZN, Rong Z i wsp. Immunogenicity of
induced pluripotent stem cells. Nature 2011; 474 (7350):212215
opracowali: Marek Żurawski i Marcin Majka
Zakład Transplantologii Katedry Immunologii Klinicznej
i Transplantologii, PAIP, UJ CM
Wytwarzanie indukowanych komórek pluripotencjalnych z hematopoetycznych komórek macierzystych oraz izolacja komórek progenitorowych śródbłonka z krwi
pępowinowej magazynowanej przez okres
od 21 do 23,5 lat
Mrożenie krwi pępowinowej, zawierającej m.in. hematopoetyczne komórki macierzyste (ang: hematopoietic stem cells
– HSC) oraz komórki progenitorowe śródbłonka (ang: endothelial progenitor cells – EPC) jest nieodłącznym etapem jej
magazynowania do późniejszych zastosowań kilnicznych.
Procedura ta może jednak wpływać na żywotność mrożonych komórek. Praca opisuje aktywność hematopoetyczną
komórek krwi pępowinowej po długotrwałym mrożeniu, zawartość aktywnych komórek progenitorowych śródbłonka
oraz podatność HSC na reprogramowanie, czyli procedurę
otrzymywania indukowanych komórek pluripotencjalnych
(ang: induced pluripotent stem cells – iPS).
Badając zamrożone preparaty krwii pępowinowej zaobserwowano wydajne odzyskanie komórek hematopoetycznych
z 23 różnych preparatów przechowywanych przez okres od
21 do 23,5 lat. Wydajność formowania kolonii granulocytowo-monocytarnych (CFU-GM) nie zmieniła się w większości przypadków w porównaniu do kontroli wykonywanych 5,
10 i 15 lat po zamrożeniu i wyniosła więcej niż 80% kolonii
zaobserwowanych przy analizie nie mrożonego materiału.
Intensywność proliferacji rozmrożonych komórek hematopoetycznych była wysoka i porównywalna z intensywnością
Przegląd piśmiennictwa
komórek izolowanych ze świeżej krwi pępowinowej. Populacja komórek CD34+ izolowana z 21-23,5 letnich preparatów krwi pępowinowej wykazywała zdolność wydajnego zasiedlania szpiku myszy szczepu NSG przez 6-7 miesięcy.
Wykazano ponadto, że przeszczepienie zasiedlonych w ten
sposób komórek do kolejnych myszy NSG powodowało dalsze zasiedlanie niszy szpikowych przez okres 6 miesięcy, co
świadczyło o wysokim potencjale krwiotwórczym. Badanie
aktywności limfocytów T obecnych w rozmrażanych preparatach wykazało istnienie funkcjonalnych subpopulacji. Ich
obecność konieczna jest do wytworzenia odporności immunologicznej u osoby po transplantacji.
Zbadano także możliwość izolacji z krwi pępowinowej komórek progenitorowych tworzących kolonie komórek śródbłonka (ang: endothelial colony forming cells – ECFCs). Okazało się, że w rozmrożonych, 6-miesięcznych i 21-letnich
preparatach żywotność tych komórek była niższa o 80-90%
od żywotności komórek uzyskiwanych ze świeżej krwi pępowinowej. Świadczy to o tym, że metoda mrożenia która
tak dobrze przechowuje komórki hematopoetyczne, nie jest
optymalna dla komórek progenitorowych śródbłonka.
Komórki iPS mogą być wytwarzane z komórek pochodzących z różnych źródeł, także z komórek krwi pępowinowej.
Komórki CD34+ wyizolowane z rozmrażanych preparatów
zostały reprogramowane genami KLF4, SOX2, NANOG
oraz cMYC dostarczonymi za pomocą lentiwirusów. Pluripotencjalność komórek potwierdzono eksperymentalnie.
Otrzymane komórki iPS wykazywały ekspresję genów pluripotencjalności (OCT4, SOX2 i NANOG) na poziomie podobnym do poziomu występującego w ludzkich embrionalnych
komórkach macierzystych szczepu E9 (E9 hESC). Ponadto,
komórki iPS były w stanie różnicować się w komórki pochodzenia ekto, mezo i entodermalnego in vitro (tworzenie ciałek embrionalnych) oraz in vivo (test tworzenia potworniaka
u myszy pozbawionych układu odpornościowego).
Wyniki badań wskazują, że możliwe jest wydajne odzyskanie
populacji w pełni funkcjonalnych komórek hematopoetycznych z preparatów magazynowanych w ciekłym azocie przez
dłuższy okres czasu oraz zastosowanie ich do wytwarzania
indukowanych komórek pluripotencjalnych, co może w przyszłości rozszerzyć spektrum zastosowań terapeutycznych.
Z drugiej strony, należy opracować lepszą metodę mrożenia
krwi pępowinowej pod kątem potencjalnego odzysku komórek progenitorowych śródbłonka.
Według: Broxmeyer HE, Lee MR, Hangoc G i wsp. Hematopoietic stem/progenitor cells, generation of induced
pluripotent stem cells, and isolation of endothelial progenitors from 21- to 23.5-year cryopreserved cord blood. Blood
2011; 117 (18):4773-4777.
opracowali: Marek Żurawski i Marcin Majka
Zakład Transplantologii Katedry Immunologii Klinicznej
i Transplantologii, PAIP, UJ CM
Większa
aktywność
koagulolacyjna
u chorych będących pseudohomozygotami mutacji czynnika V Leiden w porównaniu do chorych będących homozygotami
dla tej mutacji
Polimorfizm genowy występujący u ok. 5% rasy białej
(w Polsce u ok. 3%; przyp. tłum) określa się jako mutację
Leiden czynnika V (F5 p.R506Q; RefSeq NP_000121.2).
Polimorfizm ten wiąże się z opornością czynnika V (FV) na
inaktywację przez kompleks aktywnego białka C (APC). Bardzo rzadko u osób będących heterozygotycznymi nosicielami mutacji Leiden współwystępuje mutacja komplementarnego allela genu FV, która prowadzi do całkowitej utraty jego
funkcji. Tym samym pseudohomozygoty FV Leiden wykazują obecność wyłącznie zmutowanego czynnika V a jego poziom w osoczu jest średnio o 50% niższy niż normalnie. Badania laboratoryjne polegające na ocenie oporności na APC
wykazują zwiększoną aktywność koagulacyjną, podobną jak
u homozygot FV Leiden. Badania genetyczne na obecność
mutacji F5 p.R506Q potwierdzają heterozygotyczną postać
nosicielstwa mutacji (przyp. tłum.). Nie zostało do tej pory
opisane ryzyko wystąpienia ŻChZZ (żylnej choroby zakrzepowo-zatorowej) u takich chorych. Ci sami autorzy stwierdzili
natomiast, że u pseudohomozygot FV Leiden jest znacząco
niższy poziom inhibitora szlaku czynnika tkankowego (TFPI;
ang. tissue factor pathway inhbitor), co może mieć związek
ze zwiększonym ryzykiem ŻChZZ u tych chorych.
W pracy autorzy porównali częstość występowania ŻChZZ,
poziomy protrombiny i FV, stężenie całkowitego białka S
i wolnego TFPI u homozygot (n=18) i pseudohomozygot
(n=9) mutacji FV Leiden. U pseudohomozygot stwierdzono
istotnie niższe stężenie TFPI (6,5 ± 2,0 vs. 10,5 ± 3,4 ng/
ml; p=0,004) i niższy poziom FV (62,9 ± 8,5 vs. 104,1 19,3
%; p<0,001) niż u homozygot FV Leiden. Ponadto autorzy
zbadali generację trombiny w obu grupach przy użyciu metody automatycznego trombogramu (CAT; ang. calibrated
automated thrombogram). Tą metodą zmierzono maksymalne stężenie trombiny przy niskim (1,7 pM) i wysokim
(6,8 pM) stężeniu TF (czynnik tkankowy; ang. tissue factor)
w obecności APC (16 nM), oraz endogenny potencjał trombiny, czyli pole pod krzywą przyrastania stężenia trombiny w
czasie (ETP; ang. endogenous thrombin potential). Użycie
tak wysokiego stężenia APC (w testach do oznaczania oporności na APC używa się 5 nM) pozwoliło na zróżnicowanie
homozygot od pseudohomozygot FV Leiden pod względem
aktywności koagulacyjnej osocza. Autorzy zaobserwowali
1,6 razy wyższe maksymalne stężenie trombiny u pseudohomozygot niż u homozygot (85,2 ± 48,53,3 vs. 53,3 ± 26,8
nM; p=0,008) mierzone przy niskim TF i bez APC. Ponadto
autorzy stwierdzili znacząco wyższy ETP u pseudohomozygot niż u homozygot (312 vs. 213 nM/min; p=0,003) przy
wysokim TF i w obecności APC.
Autorzy konkludują, że zwiększona aktywność koagulacyjna
osocza u pseudohomozygot może przekładać się na zwięk361
Przegląd piśmiennictwa
szone ryzyko ŻChZZ u tych chorych, stąd wymagają oni podobnej profilaktyki przeciwzakrzepowej jak homozygoty FV
Leiden. Ponadto autorzy zwracają uwagę, że dotychczas
stosowane testy do oznaczania oporności na APC nie różnicują pseudohomozygot od homozygot FV Leiden, ponieważ
są niewrażliwe na stężenie TFPI (np. testy oparte o pomiar
APTT), lub wykorzystuje się w nich zbyt niskie stężenia APC.
Autorzy zwracają także uwagę na to, że podobne zjawisko
(pseudohomozygotyczność) może dotyczyć również nosicieli innych mutacji czynników krzepnięcia.
Według: Duckers C, Simioni P, Tormene D, Carraro S, Rosing J, Castoldi E. Factor V. Leiden pseudo-homozygotes
have a more pronounced hypercoagulable state than factor
V Leiden homozygotes. J Thromb Haemost. 2011;9:864-7.
doi: 10.1111/j.1538-7836.2011.04205.x.
Opracowała: Ewa Stępień
Katedra i Zakład Biochemii Klinicznej CMUJ, Kraków
Presepsyna (sCD14-ST): rozwój i ocena
jednostopniowej metody ELISA z zastosowaniem nowego standardu, który jest podobny do formy presepsyny występującej
u pacjentów z sepsą.
Współczesna diagnostyka sepsy opiera się głównie na
oznaczeniu poziomu prokalcytoniny (PCT) jako wskaźnika
zaawansowania procesu chorobowego. Jednakże badania
nad strukturą PCT wykazały niską wartość diagnostyczną tego markera jako czynnika umożliwiającego różnicowanie sepsy od innych nieinfekcyjnych przyczyn. Trwają
poszukiwania doskonalszych markerów posocznicy, które
umożliwią szybką i dokładną diagnostykę różnicową sepsy
we wszystkich stadiach jej rozwoju. Badacze odkryli nową
rozpuszczalną formę CD14 tzw. presepsynę (podtyp sCD14ST), która jest wysoce specyficzna dla pacjentów z sepsą.
Udowodniono, że presepsyna jest bardziej czułym markerem niż dotychczas rutynowo oznaczana interleukina-6, czy
PCT. Pierwotnie poziom presepsyny w osoczu oznaczano
metodą ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) typu
„sandwich” z zastosowaniem jako standardu rekombinowanego antygenu CD14. Niestety 4 godzinne oznaczenie nie
charakteryzowało się tak wysoką czułością i z tego względu metodykę oznaczania poddano modyfikacji. Stworzono
nowy standard rekombinowanej ludzkiej presepsyny. Sklonowano cDNA kodujące ludzki antygen CD14 w celu stworzenia N-terminalnego fragmentu białka CD14, który jest
identyczny z fragmentem występującym w natywnej presepsynie u pacjentów z posocznicą. Modyfikacja metody oznaczania polegała na wyeliminowaniu rozcieńczania próbek,
zastosowaniu nowego standardu (sCD14-ST) oraz zwięk-
362
szeniu czułości poprzez użycie dwóch nowych przeciwciał
wiążących presepsynę. Dzięki tym zmianom skrócono czas
analizy o 2,5 godziny. Oceniono wpływ obecności substancji
interferujących, które zakłócają oznaczenie gdy przekroczą
następujące stężenia: bilirubina związana 200 mg/l; bilirubina niezwiązana 208 mg/l; hemoglobina 4840 mg/l; trójglicerydy 2000 mg/dl i RF 500 IU/ml. Dzięki wysokiej czułości
jednostopniowej metody minimalny poziom detekcji wynosi
0,05 ng/ml, a efekt Hooka obserwowano dopiero przy stężeniu powyżej 192 mg/ml. Stwierdzono liniową korelację pomiędzy poprzednią i nową metodą oznaczania; współczynnik regresji wynosi 0,988.
Powyższe doświadczenia wskazują na użyteczność tej
nowej metody w oznaczaniu biomarkera sepsy jakim jest
presepsyna. Wysoka czułość analityczna i szeroki zakres
pomiarowy opisywanej metody pozwalają na wykorzystanie
wyników oznaczeń w ocenie stopnia zaawansowania zmian
chorobowych. Ponadto, czas detekcji jest optymalny dla rutynowej diagnostyki klinicznej.
Według: Shirakawa K, Naitou K, Hirose J, Takahashi T, Furusako S. Presepsin (sCD14-ST): development and evaluation
of one-step ELISA with a new standard that is similar to the
form of presepsin in septic patients. Clin Chem Lab Med.
2011 May;49(5):937-9.
Opracowała: Alicja Sonsala
Laboratorium Centralne, SP Szpital Kliniczny nr.1 w Zabrzu
Skuteczność diagnostyczna oznaczeń
mieloperoksydazy do oceny ostrych zespołów wieńcowych
Diagnostyka laboratoryjna ostrych zespołów wieńcowych
(ACS) jest zawsze wyzwaniem dla diagnosty laboratoryjnego. Według wytycznych Grupy Roboczej Europejskiego
Towarzystwa Kardiologicznego ds. diagnostyki i leczenia
ostrych zespołów wieńcowych diagnostyka laboratoryjna
zawału serca towarzyszącego ACS powinna opierać się
o pomiar troponin sercowych cTnT lub cTnI, ponieważ są
one bardziej swoiste i czułe niż tradycyjnie wykorzystywane enzymy sercowe, takie jak kinaza kreatyninowa (CK)
i jej izoenzym MB (CK-MB), jednak troponiny są słabymi
markerami prognostycznymi we wczesnych rozpoznaniu
ACS. Mieloperoksydaza (MPO) jako enzym uwalniany przez
ganulocyty obojętnochłonne w reakcjach zapalnych, ma
niewątpliwie istotne znaczenie w rozwoju reakcji zapalnej
w ścianie naczynia, która w konsekwencji może prowadzić
do okluzji naczynia i niedokrwienia mięśnia sercowego.
W pracy opublikowanej przez Marcina Sawickiego i współpracowników autorzy podjęli się oceny skuteczności diagnostycznej oznaczeń markera zapalnego (MPO) w połą-
Przegląd piśmiennictwa
czeniu z oznaczeniami troponiny sercowej (cTnI) w osoczu
chorych z bólem w klatce piersiowej, przyjętych do szpitala
celem zdiagnozowania ACS. Jednym z kryteriów włączenia do badania było wystąpienie objawów bólowych nie
później niż 6 godzin przed badaniem. Ponadto u każdego
chorego wykonano badanie elektrokardiograficzne w celu
oceny zawału z uniesieniem odcinka ST (STEMI). Do badania włączeni zostali chorzy z niestabilną dusznicą bolesną (UA) oraz z zawałem serca STEMI lub bez uniesienia
odcinka ST (NSTEMI). Jako grupę kontrolną wykorzystano
zdrowych ochotników (non-ACS). U wszystkich badanych
wykonano ponadto oznaczenia laboratoryjne cTnI, MPO,
hsCRP, liczbę leukocytów (WBC) i oznaczanie stężenia
mózgowego peptydu natriuretycznego (BNP). Do oceny
użyteczności diagnostycznej badanych parametrów posłużono się metodą krzywych ROC (Reciver operator characteristic) i analizą pól powierzchni pod tymi krzywymi. Zastosowanie strategii opierającej diagnostykę ACS o pomiar
dwóch markerów laboratoryjnych zwiększa czułość i swoistość metody z 86,2% i 91,8% dla cTnI do 92% i 100% dla
MPO i cTnI łącznie.
Autorzy sugerują, że pomiar MPO w ciągu pierwszych
6 godzin od wystąpienia objawów bólowych ułatwia rozpoznanie ACS, szczególnie u chorych, u których nie stwierdzono wzrostu poziomu troponiny. Poziom MPO związany jest
z rozwojem reakcji zapalnej, a nie martwicy komórek mięśniówki serca jak w przypadku troponin sercowych.
Według: Sawicki M, Sypniewska G, Kozinski M, Gruszka M,
Krintus M, Obonska K, Pilaczynska-Cemel M, Kubica J. Diagnostic efficacy of myeloperoxidase for the detection of acute
coronary syndromes. Eur J Clin Invest. 2011 Jun;41(6):66771. doi: 10.1111/j.1365-2362.2010.02457.x.
Opracowała: Ewa Stępień
Katedra i Zakład Biochemii Klinicznej CMUJ, Kraków
Stężenie białka YKL-40 u pacjentów
z cukrzycą typu 2 z różnym poziomem wydalania albuminy z moczem.
Przez wiele lat pojęcie mikroalbuminurii kojarzone było
z zaburzeniem czynności nerek w przebiegu cukrzycy.
Obecnie nie ulega wątpliwości, że mikroalbuminuria w przebiegu cukrzycy nie tylko istotnie zwiększa ryzyko schyłkowej
niewydolności nerek ale również znacznie zwiększa szanse
zachorowań i zgonów z przyczyn sercowo-naczyniowych.
Albuminuria przez wielu badaczy uznana została za wiarygodny wskaźnik prognostyczny rozwoju chorób układu
krążenia a ze względu na fakt, iż jest ona pierwszym, stosunkowo łatwo uchwytnym klinicznym sygnałem nefropatii
powinna być uwzględniana w ocenie ryzyka sercowo-naczy-
niowego. Już w 1989 roku została sformułowana tzw. Steno hipoteza, mówiąca o albuminurii jako odzwierciedleniu
uogólnionego uszkodzenia naczyń. Koncepcja ta wzbudziła
duże zainteresowanie i została pozytywnie zweryfikowana
przez wielu badaczy. Obecnie mikroalbuminuria najczęściej
definiowana jest jako nerkowy objaw uogólnionej dysfunkcji
śródbłonka.
Białko YKL-40 pierwotnie opisywane było w odniesieniu do
chorób ostrych i zakaźnych. W ostatnich latach wykazano
wysokie poziomy YKL-40 także u pacjentów z zawałem mięśnia sercowego oraz z chorobą niedokrwienną serca. Coraz
częściej mówi się o białku YKL-40 jako nowym markerze
chorób sercowo-naczyniowych. Stąd też powstał pomysł
sprawdzenia związku pomiędzy omawianym białkiem YKL40 a obecnością i różnym nasileniem albuminurii u pacjentów z cukrzycą typu 2.
Celem omawianej pracy była ocena poziomu YKL40 u osób z cukrzycą typu 2 z współistniejącą albuminurią. W badaniu wzięły udział 204 osoby podzielone na 3 grupy: 107 osób z prawidłowym stężeniem
albuminy w moczu (<30 mg/24h), 64 osoby z mikro(30-300 mg/24h) oraz 34 osoby z makroalbuminurią (>300
mg/24h). Przebadane grupy nie różniły się pod względem
wieku, czasu trwania cukrzycy, HbA1c, BMI, ciśnienia tętniczego, stężenia lipidów i kreatyniny. Pomiaru YKL-40 dokonano w surowicy przy użyciu techniki ELISA.
W przeprowadzonym badaniu zaobserwowano znamienne
statystycznie różnice w stężeniu YKL-40 pomiędzy wszystkimi ocenianymi grupami. Stężenie białka YKL-40 wśród
osób z prawidłowym wydalaniem albumin wynosiło 87±57
ng/ml, u osób z mikroalbuminurią 119 ± 68 ng/ml i makroalbuminurią 157±75 ng/ml. Znamienność statystyczną osiągnięto pomiędzy grupą z mikroalbuminurią a normoalbuminurią (p=0,001), makroalbuminurią z normoalbuminurią
(p<0,001), a take pomiędzy osobami z mikroalbumi-nurią
i makroalbuminurią (p=0,013).
Ponadto wykazano, że osoby z makroangiopatią posiadają wyższy poziom YKL-40 (115±72 ng/ml) w porównaniu do
osób bez makroangiopatii (87±49 ng/ml).
Przedstawione badanie stanowi pierwszą próbę oceny poziomu białka YKL-40 w zależności od stężenia albuminy
w moczu osób z cukrzycą typu 2. W przyszłości należałoby
dodatkowo zbadać czy wzrost YKL-40 u osób z występującą albuminurią jest konsekwencją rozległej miażdżycy czy
stanowi czynnik ryzyka obu zaburzeń: mikro- i makroangiopatii.
Według: Johanna-M. Brix, Florian Hollerl, Renate Koppensteiner. YKL-40 in type 2 diabetic patients with different levels of albuminuria. European Journal of Clinical Investigation
2011; 41(6): 579-692.
opracowała: Katarzyna Gawlik
Zakład Diagnostyki, Katedra Biochemii Klinicznej, CMUJ
w Krakowie
363
Przegląd piśmiennictwa
Ekspresja osteoprotegeryny w tkance
tłuszczowej i potencjalny związek między zwapnieniem naczyń a metabolizmem
tkanki tłuszczowej u chorych z przewlekłą
niewydolnością nerek
Osteoprotegeryna (OPG) jest glikoproteiną o specyficznej
funkcji w regulacji procesów kościotwórczych. OPG jako
receptor „atrapa” (ang. decoy receptor) dla liganda receptora-aktywatora czynnika transkrypcyjnego NFκ-B (RANKL)
hamuje stymulację procesów związanych z przebudową kości, to jest działa protekcyjnie na kości poprzez hamowanie
procesów osteoklastogenezy. Ochronny efekt OPG wiąże
się też między innymi z ochroną przed zwapnieniami naczyń
wieńcowych i aorty. Nie mniej jednak badania populacyjne
pokazały, że podwyższony poziom OPG towarzyszy zarówno zwapnieniom ściany aorty, jak i zwiększonemu ryzyku
zgonu u chorych z przewlekłą niewydolnością nerek (CKD).
Co więcej, otyłości brzusznej towarzyszy wzrost poziomów
OPG w krwi, a utrata masy ciała wiąże się ze spadkiem OPG.
O złożoności regulacji procesów zwapnień przez oś mediatorów OPG/RANKL/RANK świadczy też fakt, że zaobserwowano podwyższony poziom OPG u bezobjawowych osób
z nadciśnieniem tętniczym, stenozą aortalną oraz u chorych
z przerzutami nowotworów piersi, co sugeruje, że OPG może
być markerem prognostycznych w leczeniu tych chorób.
W niedawno opublikowanej pracy Anny Witasp i współpracowników, autorzy skupili się na analizie związku między metabolizmem kostnym i tkanki tłuszczowej u chorych
z CKD. Badali oni ekspresję dwóch mediatorów (markerów)
metabolizmu: OPG i AHSG (α2-HS-glikoproteina; fetuina)
w podskórnej tkance tłuszczowej (SAT) pobranej od chorych
poddawanych dializom (CDK-5) i porównywali z ekspresją
w tkance osób zdrowych. W badaniach wykorzystano techniki immunohistochemiczne (OPG i AHSG) oraz analizy ekspresji mRNA (messenger RNA) metodą reakcji łańcuchowej
polimerazy w czasie rzeczywistym (Real Time PCR) z zastosowaniem sond TagMan. Ponadto u chorych wykonano
rutynowe badania biochemiczne oraz pomiary markerów zapalnych (CRP i interleukiny 6), albuminy, markera aktywacji
śródbłonka (sVCAM-1) i OPG w krwi obwodowej.
W wyniku przeprowadzonych analiz autorzy stwierdzili, że
chorzy z przewlekłą niewydolnością nerek (CKD-5) charakteryzowali się istotnie statystycznie podwyższonymi poziomami IL-6, sVICAM-1 i OPG mimo statystycznie niższych
wartości wskaźnika masy do powierzchni ciała (BMI) u tych
chorych względem kontroli. Odpowiednio, IL-6: 6,8 (3,7-9,9)
vs 2,7 (2,1—4,4) pg/ml; sVICAM-1: 1050 (871-1230) vs 614
(542-647) ng/ml; OPG: 9,3 (7,1-11,0) vs 4,2 (3,5-5,0) pmol/l;
BMI: 23,5 (21,2-25,5) vs 26,4 (24,4-29,9) kg/m2. Co ciekawe, nie stwierdzono korelacji między poziomami OPG w krwi
a ekspresją mRNA dla OPG w tkance tłuszczowej, przy czym
w grupie CKD-5 poziom mRNA dla OPG był istotnie niższy
niż o zdrowych, natomiast analiza immunohistochemiczna
nie potwierdziła tej różnicy. Nie stwierdzono ekspresji AHSG
364
w podskórnej tkance tłuszczowej w obu analizowanych grupach. Analiza 5-letniego przeżycia chorych CDK-5 (KaplanMayer) pokazała, że chorzy u których poziom OPG zawierał
się w trzecim przedziale tercylowym (>8,34 mol/l) charakteryzowali się istotnie gorszym przeżyciem (4-krotny wzrost
ryzyka zgonu).
Autorzy konkludują, że podwyższone wartości OPG u chorych z CKD-5 wiążą się z istotnym ryzykiem powikłań. Mniejsza ekspresja OPG w SAT u tych chorych sugeruje, że tkanka tłuszczowa uczestniczy w regulacji procesu powstawania
zwapnień w naczyniach u chorych dializowanych, choć mechanizm nie został przez autorów wyjaśniony.
Według: Witasp A, Carrero JJ, Hammarqvist F, Qureshi AR,
Heimbürger O, Schalling M, Lindholm B, Nordfors L, Stenvinkel P. Expression of osteoprotegerin in human fat tissue;
implications for chronic kidney disease. Eur J Clin Invest.
2011;41:498-506. doi: 10.1111/j.1365-2362.2010.02432.x.
Opracowała: Ewa Stępień
Katedra i Zakład Biochemii Klinicznej, CMUJ, Kraków
Wpływ obecności śródmiąższowych chorób płuc na poziom KL-6 u chorych na
raka płuca
Palenie papierosów oraz ekspozycje na dym tytoniowy uważa się nie tylko za czynniki ryzyka zachorowania na raka płuca ale także wielu śródmiąższowych chorób płuc (IDL). Nowym wskaźnikiem aktywności tych chorób zarówno o znanej
etiologii (pylica, azbestoza, krzemica, zapalenie płuc z nadwrażliwości), jak i idiopatycznego zwłóknienia płuc jest KL-6
– wysokocząsteczkowa glikoproteina należąca do polimorficznych nabłonkowych mucyn, której epitop zlokalizowano
za pomocą przeciwciał anty–KL6 w miejscu glikozylacji przy
Thr/Ser resztach aminokwasowych na powtarzającym się
tandemie peptydu MUC-1. Podwyższony poziom tego markera stwierdza się także u chorych na raka płuca. Sugeruje
się, że antygen może pochodzić zarówno z pneumocytów
typu II jak i komórek nowotworowych chociaż mechanizm
uwalniania do krążenia KL-6 nie został do końca poznany.
W pracy poszukiwano odpowiedzi na pytanie czy u chorych
na raka płuca ze współistniejącą śródmiąższową chorobą
płuc (IDL) poziom KL-6 jest wyższy aniżeli u chorych na raka
płuca bez IDL, oraz czy podwyższony poziom tego markera posiada wpływ na rokowanie chorych na raka płuca. Badania KL-6 przeprowadzono w grupie 273 chorych głównie
na niedrobnokomórkowego raka płuca w różnych stopniach
zaawansowania klinicznego: u 29% chorych w I-IIB, 36%
w IIIA-B, i 35% w IV stopniu. Do oceny występowania IDL
wykorzystywano konwencjonalną tomografię komputerową lub tomografię komputerową o wysokiej rozdzielczości.
Obecność śródmiąższowych chorób płuc potwierdzono
Przegląd piśmiennictwa
u 1/4 chorych na raka płuca i w tej grupie chorych poziom
KL-6 był istotnie wyższy aniżeli u pozostałych chorych,
a odsetek wyników przekraczających wartość odcinająca
wynosząca 500 U/ml wynosił 73,5%. U chorych na raka
płuca bez zmian śródmiąższowych, w porównaniu do tych
z obecnymi zmianami, odsetek podwyższonych wyników był
istotnie niższy i wynosił 33,7% (p = 0,0001), a jednak u 40
z 69 chorych z podwyższonym stężeniem KL-6 w tej podgrupie stwierdzano wyższy od 1000 U/ml poziom markera.
Powodem tak wysokich stężeń może być zaawansowanie
nowotworu, ponieważ aż u 90% chorych z tej podgrupy
stwierdzano obecność odległych przerzutów. Pomimo, że
w pracy nie wykazano zależności pomiędzy typem histologicznym nowotworu a występowaniem śródmiąższowych
chorób płuc, to jednak u większości chorych z poziomem
KL-6 przekraczającym 1000 U/ml rozpoznano gruczolakoraka.
Przedmiotem pracy była także ocena wartości prognostycznej KL-6. Odmiennie do innych autorów, nie wykazano
wpływu stężenia KL-6 na przeżycie chorych na raka płuca
w podgrupie ze współtowarzyszącą śródmiąższową chorobą
płuc, natomiast podwyższone przed leczeniem stężenie KL6, oprócz stadium zaawansowania i nałogu palenia tytoniu,
było niekorzystnym czynnikiem rokowniczym w podgrupie
chorych na raka płuca bez zmian śródmiąższowych.
Podsumowując, u chorych na raka płuca poziom KL-6 wzrasta zasadniczo niezależnie od współistniejących zmian
śródmiąższowych. Autorzy uważają, że brak wartości prognostycznej KL-6 u chorych na raka płuca ze współtowarzyszącymi śródmiąższowymi chorobami płuc wymaga dalszej
weryfikacji w większej grupie chorych.
Według: Ishikawa H, Kurishima K, Kagohashi K, Kawaguchi
M et al. Serum KL-6 levels in lung cancer patients with or
without interstitial lung disease. J Clin Lab Anal, 2010,24:
295-99
Opracowała: Ewa Wójcik
Zakład Analityki i Biochemii Klinicznej, Centrum Onkologii,
Oddział w Krakowie
Rola metaloproteinazy-2 i -9 w przewidywaniu progresji nowotworu piersi
Rak piersi jest najczęstszym nowotworem złośliwym u kobiet.
Z licznych obserwacji wynika, że pacjentki posiadające ten sam
stopień zaawansowania raka piersi różnią się między sobą
w znaczny sposób odpowiedzią na zastosowane leczenie
oraz postępem choroby. Obecnie stosowane metody skryningowe w postaci samokontroli oraz okresowej mammografii często bywają niewystarczające do postawienia wczesnej
diagnozy. Dotychczasowe prognozowanie przebiegu choroby nowotworowej i leczenia opiera się głównie na dokładnym
określeniu stopnia zaawansowania klinicznego. Zrozumienie komórkowych procesów odpowiedzialnych za rozsiew
nowotworów oraz poznanie molekularnych markerów inwazyjności może być użyteczne ze względu na uzupełnienie
dotychczasowej diagnostyki o nowe parametry pomocne
w wykrywaniu choroby, prognozowaniu jej przebiegu a także
w przyszłości do stworzenia leków skierowanych wybiorczo
w stosunku do czynników odpowiedzialnych za inwazyjność
nowotworów.
Komórki nowotworowe zarówno w procesie intrawazacji jak
i ekstrawazacji muszą przekroczyć błonę podstawną, otaczającą warstwę śródbłonka naczyń. Proces ten wymaga aktywacji enzymów proteolitycznych w tym m.in. metaloproteinaz
macierzy zewnątrzkomórkowej (matrix metalloproteinase
MMPs). Metaloproteinazy to rodzina 23 białek związanych
z remodelingiem macierzy zewnątrzkomórkowej - zdolnych
do degradacji błony podstawnej i składników macierzy pozakomórkowej. To właśnie te funkcje sprawiają, że MMP leżą
u podstaw procesów inwazji oraz przerzutowania nowotworów. Żelatynaza A (MMP-2) oraz żelatynaza B (MMP-9) różnią
się od innych metaloproteinaz swoją zdolnością do rozkładu
żelatyny i kolagenu głównych składników błony podstawnej
stanowiącej barierę pomiędzy rakiem in situ a inwazyjnym.
Ze względu na fakt, że tkankowe MMP wydzielane są do krwi,
postuluje się ich rolę jako istotnego markera biologicznego
pozwalającego na wcześniejsze wykrycie choroby, prognozowanie jej progresji oraz monitorowanie leczenia. Najnowsze badania dowodzą, że zwiększona aktywność MMP-2
i MMP-9 w surowicy stanowi niezależny wskaźnik agresywnej postaci choroby wiążący się z niepomyślnym rokowaniem. I choć liczne badania wskazują na dużą wagę oznaczania metaloproteinaz wprowadzenie tych enzymów do
rutynowej diagnostyki nadal pozostawia wątpliwości. Wiąże się to przede wszystkim z błędami przedanalitycznymi
w znacznej mierze wpływającymi na wynik badania. Stosowanie antykoagulantów (EDTA, heparyna) celem uzyskania
osocza może prowadzić do zablokowania MMPs, natomiast
użycie środków przyspieszających tworzenie skrzepu może
stymulować aktywacje płytek i wytwarzanie MMPs. W związku z tym najlepszym materiałem do badania wydaje się być
surowca bez dodatku akceleratorów krzepnięcia i właśnie
taki materiał wykorzystali autorzy omawianej pracy.
W przeprowadzonym badaniu brało udział 60 kobiet z pierwotnym nowotworem piersi, 40 kobiet z niezłośliwymi zmianami piersi (m.in. gruczolakowłókniaki, torbiele, cysty), oraz
60 zdrowych ochotniczek stanowiących grupę kontrolną.
Poziomy MMP-2 i MMP-9 oznaczono w surowicy bez dodatku akceleratora krzepnięcia i przy użyciu techniki ELISA.
Wyniki badania wykazały znamienny wzrost MMP-2 (p<
0,05) i MMP-9 (p<0,001) w grupie kobiet ze zdiagnozowanym nowotworem piersi w porównaniu do grupy kontrolnej,
dodatkowo poziomy omawianych metaloproteinaz były znamienne wyższe u osób w bardziej zaawansowanym stadium
nowotworu. MMP-9 okazało się znamiennie wyższe nie tylko
w porównaniu z kontrolą, ale także w porównaniu z kobieta365
Przegląd piśmiennictwa
mi niezłośliwymi zmianami w piersi. Znaczny wzrost MMP-9
zaobserwowano wśród osób z obecnymi przerzutami oraz
u chorujących krócej niż 1 rok. Przeprowadzona analiza
ROC wykazała większą wartość diagnostyczną oznaczania
MMP-9, aniżeli MMP-2, z czułość i swoistość diagnostyczna MMP-9 wynosi 80% przy punkcie odcięcia wynoszącym
315 ng/ml.
Wyniki przeprowadzonego badania wskazują na większą
wartość diagnostyczną oznaczania MMP-9 aniżeli MMP-2
w ocenie progresji nowotworu piersi. Autorzy badania potwierdzają sugestie odnośnie udziału omawianych żelatynaz
w procesach transformacji nowotworowej. Brak znamiennych różnic pomiędzy poziomem MMP-2 u chorych z nowotworem piersi oraz osobami z nienowotworowymi zmianami
może świadczyć o braku udziału tego enzymu w rozwoju
nowotworu. W przypadku MMP-9, istotne różnice pomiędzy
zmianami złośliwymi i niezłośliwymi mogą natomiast sugerować istotną rolę tej metaloproteinazy w rozwoju nowotworu
i jego inwazyjności.
Według: Patel S, Sumitra G, Koner BC, Saxena A. Role of
serum matrix metalloproteinase-2 and -9 to predict breast
cancer progression. Clin Biochem. 2011; 44:869-872.
Opracowała: Katarzyna Gawlik
Zakład Diagnostyki, Katedra Biochemii Klinicznej, CMUJ
w Krakowie
366