monografia

Transkrypt

monografia

Śląska Akademia Medyczna w Katowicach
Jarosław-Jerzy Barski
Badania nad funkcją kalbindyny D-28k
w komórkach Purkinjego móżdżku myszy
z wykorzystaniem zwierząt transgenicznych
Rozprawa habilitacyjna
Katowice 2004
Rodzicom
Składam podziękowania Panu prof. Hansowi Thoenenowi za
umożliwienie mi podjęcia badań których wynikiem jest przedstawiona
praca.
Serdecznie dziękuję Panu prof. Michaelowi Meyerowi za
zainteresowanie mnie tematem podjętym w pracy i fachową pomoc
podczas jej wykonywania.
Pragnę również podziękować mojej małżonce
Ewie Barskiej za pomoc w pracach laboratoryjnych oraz
Pani prof. Joannie Lewin-Kowalik i Pani dr Agnieszce Larysz-Brysz
za cenne uwagi redakcyjne.
Praca została wykonana
w Zakładzie Neurobiochemii
Instytutu Neurobiologii Maxa Plancka
w Martinsried/Niemcy
Jaroslaw
Barski
Digitally signed by Jaroslaw
Barski
DN: CN = Jaroslaw Barski, C =
PL, O = UZ, OU = WNB
Reason: I am the author of this
document
Date: 2007.08.22 18:59:18
+02'00'
Spis treści
1 Wstęp…………………………………………………….………….…………………1
1.1 Funkcje jonów Ca2+ w komórce nerwowej................................................................1
1.2 Funkcje móżdżku.....................................................................................................5
1.3 Mechanizm powstawania hamowania długotrwałego – LTD....................................6
1.4 Objawy zaburzenia funkcji móżdżku........................................................................8
1.5 Metody badań uszkodzeń móżdżku stosowane w modelu zwierzęcym.......................9
1.6 Białko pcp2............................................................................................................11
1.7 Rodzina białek „EF-hand”......................................................................................12
1.7.1 Charakterystyka buforów wapniowych obecnych w komórkach Purkinjego..........15
1.7.1.1 Kalbindyna D-28k............................................................................................16
1.7.1.2 Parwalbumina..................................................................................................20
1.8 System Cre/loxP.....................................................................................................20
2. Założenia i cel pracy..............................................................................................24
3. Materiał i metody...................................................................................................26
3.1 Klonowanie DNA...................................................................................................26
3.2 Przygotowanie komórek pnia.................................................................................26
3.3 Zwierzęta eksperymentalne....................................................................................27
3.4 Ekstrakcja DNA i analiza metodą „Southern blot”.................................................27
3.5 Analiza ekspresjii metodą RT-PCR........................................................................27
3.6 Analiza ekspresjii metodą „Western blot”...............................................................29
3.7 Analiza immunohistochemiczna............................................................................30
3.8 Barwienie β-galaktozydazy metodą lacZ.................................................................33
3.9 Test otwartego pola................................................................................................33
3.10 Test na bieżni z przeszkodami..............................................................................35
3.11 Test na równoważni.............................................................................................36
3.12 Badanie odruchów wzrokowych...........................................................................37
3.13 Eksperymenty elektrofizjologiczne i analiza LTD.................................................37
3.14 Pomiary wewnątrzkomórkowego stężenia jonów Ca2+...........................................39
4. Omówienie wyników..............................................................................................41
4.1 Modyfikacja genu kalbindyny przy pomocy sekwencji loxP – linia Calbtm.2..........41
4.1.1 Konstrukcja wektora Calbtm.2............................................................................41
I
Spis treści
4.1.2 Przygotowanie komórek pnia...............................................................................43
4.1.3 Ocena ekspresji kalbindyny.................................................................................45
4.1.4 Analiza behawioralna i testy sprawnościowe.......................................................46
4.2 Wprowadzenie ekspresji rekombinazy Cre do komórek Purkinjego – linia L7Cre...49
4.2.1 Konstrukcja wektora L7Cre.................................................................................49
4.2.2 Przygotowanie komórek pnia...............................................................................49
4.2.3 Ocena ekspresji rekombinazy Cre........................................................................51
4.2.4 Analiza behawioralna i testy sprawnościowe.......................................................54
4.3 Wyłączenie ekspresji kalbindyny w komórkach Purkinjego – linia L7 x Calbtm.2..57
4.3.1 Krzyżówka linii Calbtm.2 i L7Cre-2 – analiza genetyczna..................................57
4.3.2 Ocena rekombinacji allelu Calbtm.2 w komórkach Purkinjego...............................59
4.3.3 Testy behawioralne i sprawnościowe...................................................................63
4.3.3.1 Ocena zachowania eksploracyjnego – test otwartego pola.................................63
4.3.3.2 Analiza koordynacji ruchowej..........................................................................65
4.3.4 Odruchy wzrokowe..............................................................................................69
4.3.5 Hamowanie długotrwałe (LTD)...........................................................................71
4.3.6 Wahania stężeń wapnia Ca2+ pod wpływem stymulacji synaptycznej...................72
5. Dyskusja.................................................................................................................76
6. Wnioski...................................................................................................................89
7. Streszczenie............................................................................................................90
8. Summary................................................................................................................93
9. Bibliografia.............................................................................................................94
II
1 Wstęp
1.1 Funkcje jonów Ca2+ w komórce nerwowej
Jony wapniowe Ca2+ pełnią kluczową rolę w metabolizmie wszystkich typów
komórek (ryc.1). Pośredniczą w wymianie informacji pomiędzy wnętrzem komórki i
przestrzenią międzykomórkową. Regulują procesy metaboliczne zachodzące w obrębie
cytoplazmy, gdzie są nośnikiem informacji pomiędzy organellami komórkowymi, oraz
biorą udział w sterowaniu ekspresją genów w odpowiedzi na bodźce dochodzące do
komórki. W ten sposób mają wpływ na wszystkie podstawowe witalne funkcje komórki,
poczynając od jej narodzin, poprzez proliferację i różnicowanie, a na procesach starzenia
się i śmierci kończąc.
Ryc.1 Procesy komórkowe zależne od udziału jonów wapniowych
Szczególnie ważna rola przypada jonom wapniowym w komórkach pobudliwych,
do których należą przede wszystkim komórki nerwowe. Jony Ca2+ należą do
podstawowych czynników integrujących układ nerwowy jako całość, uczestnicząc w
przewodnictwie synaptycznym, a co za tym idzie są istotnym elementem regulacyjnym w
procesie uczenia i zapamiętywania.
System przekaźnikowy wykorzystujący jony Ca2+ rejestruje zmiany ich stężenia
∆[Ca2+]i w obrębie cytoplazmy. Ponieważ absolutne różnice ∆[Ca2+]i są bardzo
niewielkie, rejestrowanie ich i wykorzystanie przez mechanizmy wewnątrzkomórkowe
możliwe jest jedynie w przypadku, gdy stosunek sygnału do tła, ∆[Ca2+]i : [Ca2+]i(R)
(gdzie [Ca2+]i(R) = spoczynkowe stężenie wolnego Ca2+), jest wysoki. Sytuacja taka
możliwa jest wyłącznie wtedy, kiedy [Ca2+]i(R) utrzymywane jest na bardzo niskim
poziomie - około 100nM. System, który pozwala na względnie stałe utrzymywanie takich
1
Wstęp
relacji, musi spełniać kilka warunków wyjściowych: musi posiadać znaczną pojemność,
gdyż gwałtowny napływ jonów Ca2+ może spowodować nawet 100-krotny wzrost ich
stężenia, musi bardzo szybko reagować na zmiany stężenia jonów wapniowych wahania [Ca2+]i odpowiedzialne za wydzielanie neurotransmiterów trwają około 1ms oraz w razie konieczności musi utrzymać podwyższone wartości [Ca2+]i nawet przez
wiele sekund, np. w przypadku hiperpolaryzacji spowodowanej serią potencjałów
czynnościowych. Należy jednak przy tym pamiętać, iż nadmierne stężenie jonów Ca2+ w
cytoplazmie jest toksyczne dla komórki i może doprowadzić do jej śmierci, w związku z
czym muszą istnieć bardzo sprawne mechanizmy usuwające szkodliwy nadmiar jonów
wapnia z cytoplazmy.
W procesie przenoszenia informacji za pomocą jonów wapniowych możemy
wyróżnić cztery etapy funkcjonalne (ryc.2):

bodziec prowadzący do uruchomienia sygnalizacji wapniowej,

napływ Ca2+ do cytoplazmy, aż do uzyskania „aktywnego” stężenia wapnia,

procesy wapniozależne,

odpływ Ca2+ z cytoplazmy.
Ryc.2 Schemat przedstawiający poszczególne etapy sygnalizacji wapniowej. Oznaczenia barwne odpowiadają kolorom
użytym na rycinie 3
Jony wapnia uczestniczące w sygnalizacji wewnątrzkomórkowej mogą pochodzić z
przestrzeni międzykomórkowej lub z wewnętrznych zbiorników wapnia (ryc.3).
2
Ryc.3 Obieg jonów Ca2+ w komórce nerwowej z uwzględnieniem wapniozależnych procesów komórkowych.
Kolorem niebieskim oznaczono procesy odpowiedzialne za aktywację sygnalizacji wapniowej. Kolorem zielonym
oznaczono procesy związane ze wzrostem stężenia jonów Ca2+. Kolorem czerwonym oznaczono procesy
odpowiedzialne za usuwanie jonów wapniowych z cytoplazmy. ACI/III – cyklaza adenylowa I lub III, AMPA – receptor
α-amino-3-hydroksy-5-metylo-4-izoksalopropionowy, ATP – adenozyno trójfosforan, cADPR – cykliczny adenozyno
dwufosforan rybozy, cAMP – cykliczny adenozyno monofosforan, CAMKII – Ca2+/kalmodulino zależna kinaza
białkowa II, CAM-CN – kalmodulina-kalcyneuryna, Ins(1,4,5)P3 – inozytolo-1,4,5-trifosforan, InsP3R – receptor
inozytolo-1,4,5-trifosforanowy, L, N, PQ, - kanały dla jonów Ca2+, LTD – hamowanie długotrwałe, LTP – wzmocnienie
długotrwałe, mGluR – metabotropowy receptor glutaminergiczny, NMDA – receptor N-metylo-D-asparginianowy,
PMCA – pompa wapniowa błony plazmatycznej, PTP – kanał PTP, RYRI – receptor ryanodynowy, SERCA – pompa
wapniowa retikulum sarkoplazmatycznego.
Jony Ca2+ pochodzące z zewnątrz napływają do cytoplazmy poprzez kanały obecne
w błonie komórkowej, które możemy podzielić ze względu na sposób ich aktywacji na
trzy grupy:

kanały bramkowane napięciem – reagujące na zmiany potencjału elektrycznego
błony cytoplazmatycznej. Do tej grupy należą kanały typu L, N, P/Q, R i T
zaangażowane między innymi w uwalnianie transmiterów z zakończeń
synaptycznych oraz doprowadzające jony wapnia regulujące aktywacje genów,
3
Wstęp

kanały bramkowane chemicznie – związane funkcjonalnie z receptorami
reagującymi na transmitery. W tej grupie znajdują się receptory NMDA (Nmetylo-D-asparaginianowe), nieobecne w komórkach Purkinjego dojrzałych
gryzoni
[157]
oraz
receptory
AMPA
(α-amino-3-hydroksy-5-metylo-4-
izoksalopropionowe) biorące udział w procesach pamięci i uczenia poprzez
regulację długotrwałego wzmocnienia - LTP (ang. long-term potentiation) i
długotrwałego hamowania - LTD (ang. long-time depression),

kanały
bramkowane
pojemnością
–
zależne
od
stanu
wypełnienia
2+
wewnątrzkomórkowych zbiorników Ca , uruchamiające napływ Ca2+ do
wnętrza komórki poprzez nieznany bliżej mechanizm.
Wewnętrznym zbiornikiem jonów wapniowych wykorzystywanych w sygnalizacji
jest retikulum endoplazmatyczne. Wypływ jonów Ca2+ z tego zbiornika kontrolowany
jest przez rożne kanały błonowe, przy czym najlepiej poznanymi są kanały zależne od
receptorów inozytolo-1,4,5-trifosforanowych (InsP3R) [156] oraz ryanodynowych
(RYR),
których
obecność
stwierdzono
we
wszystkich
przedziałach
wewnątrzkomórkowych komórek Purkinjego, za wyjątkiem kolców dendrytycznych
[112, 212]. Dokładna funkcja tych drugich nie została dotychczas ostatecznie wyjaśniona
[105, 121]. Do uwalniania jonów wapnia z retikulum endoplazmatycznego dochodzi w
procesie zwanym „uwalnianiem Ca2+ indukowanym Ca2+” – CICR (ang. Ca2+-induced
Ca2+ release) [121, 176, 208]. Jony wapniowe po spełnieniu swej funkcji przekaźnikowej
są natychmiast usuwane z cytoplazmy przy pomocy pomp wapniowych i wymienników
jonowych. Rozmieszczone w błonie plazmatycznej pompy wapniowe – PMCA (ang.
plasma membrane Ca2+ ATPase) [49, 70, 77, 184] oraz wymienniki Na+/Ca2+ usuwają
nadmiar wapnia na zewnątrz komórki [22, 114], natomiast pompy wapniowe retikulum
sarko-endoplazmatycznego – SERCA (ang. sarco-endoplasmatic reticulum Ca2+ ATPase)
wpompowują jony Ca2+ do rezerwuarów wewnątrzkomórkowych [11, 64].
Strukturami zaangażowanym w usuwanie wapnia z cytoplazmy są również
mitochondria [64]. Pobierają one intensywnie jony wapniowe podczas ich napływu do
cytoplazmy, a następnie uwalniają je wolno podczas odbudowywania spoczynkowego
poziomu wapnia. Pobór wapnia przez mitochondrium odgrywa istotną rolę w regulacji
amplitudy wahań [Ca2+]i oraz ich przestrzenno-czasowej dystrybucji w cytoplazmie.
Transport jonów wapniowych do wnętrza mitochondrium zależny jest od usuwania z
4
jego wnętrza protonów, co z kolei tworzy gradient elektrochemiczny umożliwiający
syntezę ATP. Ten sam gradient napędza transport Ca2+ do wnętrza mitochondrium na
zasadzie uniportu o niskim powinowactwie do jonów wapnia, którego półmaksymalna
aktywacja następuje przy [Ca2+]i około 15µM. Stąd też intensywność akumulacji jonów
wapniowych przez mitochondria zależy od lokalnego ich stężenia, które jest wysokie w
bliskim sąsiedztwie otwartych kanałów wapniowych takich jak np. receptory InsP3 czy
RYR. Zjawisko to sugeruje istnienie wzajemnej zależności funkcjonalnej pomiędzy
mitochondriami i retikulum endoplazmatycznym, w której to retikulum dostarcza Ca2+
pobierane przez mitochondria, natomiast mitochondria regulują proces wydzielania
jonów wapniowych z retikulum endoplazmatycznego. Mitochondria są w stanie
zakumulować znaczne ilości jonów wapniowych, lecz posiadają jednocześnie
mechanizmy enzymatyczne zapobiegające nagromadzeniu nadmiernej ich ilości. Kiedy
stężenie jonów osiągnie poziom spoczynkowy, mitochondrialny wymiennik Na+/Ca2+
wypompowuje zgromadzone jony wapniowe do cytoplazmy, skąd są one odprowadzane
przez retikulum endoplazmatyczne lub usuwane do przestrzeni międzykomórkowej.
Nagromadzenie nadmiernej ilości jonów wapniowych wewnątrz mitochondrium
prowadzi również do uruchomienia mechanizmu zbliżonego do CICR i wydalania jonów
Ca2+ do cytoplazmy poprzez kanały PTP (ang. permeability transition pore) [74, 148].
1.2 Funkcje móżdżku
W wyniku szczegółowych badań prowadzonych od wielu lat poznano i opisano
podstawowe funkcje, jakie spełnia móżdżek w obrębie ośrodkowego układu nerwowego.
Do podstawowych zadań tej struktury należy:
utrzymanie równowagi ciała,
kontrola precyzji i płynności ruchów dowolnych i mimowolnych,
dystrybucja siły skurczów mięśni i koordynacja ruchowa.
Do dziś jednak trwa dyskusja na temat, w jaki sposób móżdżek realizuje wymienione
powyżej funkcje. Rozwój metod eksperymentalnych pozwalających na bardziej dogłębne
badanie układu nerwowego doprowadził do odkrycia nowych aspektów funkcjonowania
móżdżku, a co za tym idzie do powstania nowych teorii opisujących zasadę działania tej
struktury [22, 24, 29, 43, 46, 83, 124, 133, 156, 194]. Podstawą do dyskusji nad
zasadami działania móżdżku stała się teoria, którą w latach 70-tych stworzyli niezależnie
5
Wstęp
od siebie David Marr i James Albus. Wysunęli oni mianowicie hipotezę, iż pętle
neuronalne istniejące w korze móżdżku mogą być wykorzystywane podczas uczenia się
funkcji motorycznych. Uczeni ci stworzyli modele matematyczne zakładające, iż impulsy
dochodzące do komórek Purkinjego za pośrednictwem włókien pnących modyfikują
odpowiedź tych neuronów na informacje docierające z innych obszarów mózgowia za
pośrednictwem włókien kiciastych [5, 129]. Modyfikacja ta ma charakter hamujący i
może utrzymywać się przez dłuższy czas, stąd została nazwana hamowaniem
długotrwałym (ang. LTD – long-time depression).
1.3 Mechanizm powstawania hamowania długotrwałego – LTD
Hamowanie
długotrwałe
realizowane
jest
poprzez
modyfikację
połączeń
synaptycznych komórek Purkinjego. Modyfikacja ta prowadzi do zablokowania
odpowiedzi neuronu postsynaptycznego (komórka Purkinjego) na neurotransmiter
(glutaminian) dostarczany do przestrzeni synaptycznej przez neuron presynaptyczny
(komórka ziarnista).
Na poziomie molekularnym do wywołania LTD w komórkach Purkinjego
potrzebne są trzy zasadnicze elementy (ryc.4):
napływ jonów Ca2+,
aktywacja glutaminergicznych receptorów jonotropowych AMPA,
aktywacja glutaminergicznych receptorów metabotropowych mGluR.
6
Ryc.4 Schemat powstawania hamowania długotrwałego. AA – kwas arachidonowy, AMPA – receptor α-amino-3hydroksy-5-metylo-4-izoksalopropionowy, DAG – dwuacyloglicerol, G – białko z grupy G, InsP3 – inozytolo-1,4,5trifosforan, mGluR – metabotropowy receptor glutaminergiczny, P – grupa fosforanowa, PAF – czynnik aktywujący płytki,
PIP2 – fosfatydyloinozytolo-4,5-bifosforan, PKC – kinaza białkowa C, PLA2 – fosfolipaza A2, PLC – fosfolipaza C, PTK –
kinaza białkowa tyrozynowa, VGCC – kanał wapniowy bramkowany napięciem.
W warunkach fizjologicznych za wzrost stężenia jonów wapniowych
odpowiedzialne są włókna pnące, natomiast aktywacja receptorów AMPA i mGluR
należy do włókien równoległych. Eksperymenty badające szczegółowo przebieg
procesów prowadzących do LTD pokazały, iż w procesie tym może uczestniczyć wiele
przekaźników pośrednich [78, 87, 88, 89], których aktywacja prowadzi do wzrostu
stężenia
jonów
wapniowych
w
wyniku
ich
gwałtownego
wydzielania
z
7
Wstęp
wewnątrzkomórkowych zbiorników Ca2+ (CICR), a następnie do fosforylacji receptorów
AMPA. W następstwie tych procesów dochodzi do długotrwałego hamowania
aktywności receptorów AMPA, które jak wskazują ostatnie badania, odbywa się poprzez
ich internalizację [131].
Rola włókien pnących polegałaby na dostarczaniu „błędnego” sygnału, który w
momencie nałożenia się na podobny „błędny” sygnał pochodzący od włókien
równoległych, powodowałby wygaszenie tego drugiego. Zgodnie z tą teorią włókna
pnące pełniłyby funkcję „komparatora”, czyli jednostki funkcjonalnej rejestrującej
różnice pomiędzy informacją sensoryczną oczekiwaną a rzeczywistą. W miarę
wykonywania kolejnych podobnych i „błędnych” ruchów nieadekwatna informacja
sensoryczna powinna być wygaszana, co w efekcie prowadziłoby do nauczenia się
prawidłowej funkcji motorycznej [87].
1.4 Objawy zaburzenia funkcji móżdżku
Objawy zaburzenia pracy móżdżku u ludzi możemy podzielić zgodnie z klasyczną
klasyfikacją Holmsa [81] na trzy grupy:

hipotonia, czyli spadek napięcia mięśniowego,

ataksja rozumiana jako zaburzenie koordynacji ruchowej przy wykonywaniu
ruchów dowolnych,

drżenie towarzyszące wykonywaniu ruchów, widoczne szczególnie w ich fazie
końcowej.
Pierwszy z objawów wiąże się z obniżeniem napięcia mięśniowego i zmniejszeniem
siły skurczów. Przy pomocy tego zjawiska można wytłumaczyć występowanie tzw.
odruchów wahadłowych. W przypadku badania odruchu kolanowego u pacjentów z
uszkodzeniami móżdżku, po uderzeniu młotkiem neurologicznym powrót kończyny do
pozycji wyjściowej poprzedzony jest kilkoma oscylacjami podudzia.
Do charakterystycznych objawów ataksji pochodzenia móżdżkowego możemy
zaliczyć różnorodne zaburzenia w wykonywaniu ruchów dowolnych. Typowymi
przykładami takich zaburzeń są dysmetria, charakteryzująca się zaburzeniem orientacji
przestrzennej wykonywanych ruchów, oraz dyskineza polegająca na stosowaniu siły
skurczów nieadekwatnej do sytuacji.
8
Do typowych objawów związanych z zaburzeniami w funkcjonowaniu móżdżku
należy również tremor kinetyczny zwany też drżeniem zamiarowym. Widoczny jest on
szczególnie w fazie hamowania ruchu, kiedy dochodzi do aktywacji mięśni
antagonistycznych.
1.5 Metody badań uszkodzeń móżdżku stosowane w modelu zwierzęcym
Celem zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw wymienionych dysfunkcji
motorycznych prowadzi się badania na zwierzętach, głównie na myszach, wykazujących
zaburzenia koordynacji ruchowej przy jednoczesnych zdefiniowanych zmianach
patologicznych w obrębie móżdżku. Od wielu już lat modelem eksperymentalnym w tych
badaniach są linie myszy posiadających spontanicznie występujące mutacje genetyczne
prowadzące do uszkodzenia lub/oraz atrofii dwóch głównych populacji komórkowych
kory móżdżku czyli komórek Purkinjego i komórek ziarnistych [73]. W celach
eksperymentalnych wywołuje się również zdefiniowane uszkodzenia móżdżku:
chirurgicznie poprzez stereotaktyczne uszkodzenie kory móżdżku lub jej dróg
aferentnych czy eferentnych [23, 99, 140, 163, 172], chemicznie poprzez
stereoktaktyczne wprowadzanie substancji neurotoksycznych do wybranych obszarów
móżdżku [8, 33], genetycznie poprzez celowe mutacje genowe prowadzące do
wyłączenia ekspresji białek lub też ich nadekspresji w populacjach neuronalnych
obecnych w móżdżku, w tym przede wszystkim w komórkach Purkinjego [13, 14, 15,
16, 60, 209].
Wprowadzane uszkodzenia powodują nieprawidłowości funkcji móżdżku o różnym
natężeniu (nieraz bardzo subtelnych), widoczne przede wszystkim jako zaburzenia
szeroko pojętej koordynacji ruchowej – ataksje. Natężenie i zakres wprowadzonych
uszkodzeń
można
analizować,
poddając
zwierzęta
eksperymentalne
testom
behawioralnym i sprawnościowym. Do typowego zestawu eksperymentalnego możemy
tu zaliczyć: test otwartego pola (ang. open field) [32], labirynt wodny Morrisa [141], test
na bieżni obrotowej „Rotarod” [92], test na bieżni z przeszkodami oraz test na
równoważni [96]. W skład metod badawczych stosowanych w zwierzęcych modelach
uszkodzenia móżdżku wchodzą również bardziej skomplikowane metodycznie testy
badające odruch optokinetyczny i przedsionkowo-wzrokowy [49, 102, 185, 197]. Odruch
optokinetyczny (OKR – ang. optokinetic reflex) polega na dostosowaniu ruchów gałek
9
Wstęp
ocznych do poruszającego w się w polu widzenia obrazu, natomiast odruch
przedsionkowo-wzrokowy (VOR – ang. vestibulo-ocular reflex) adaptuje ustawienie
gałek ocznych do ruchów głowy. Komórki Purkinjego kory móżdżku należą do
kluczowych elementów uczestniczących w regulacji obu tych odruchów (ryc.5).
Ryc.5 Schemat pętli neuronalnych uczestniczących w odruchu optokinetycznym i przedsionkowowzrokowym. JM/JP – kompleks jąder móżdżku i jąder przedsionkowych, JS – jądra śródmózgowia, JSPM
– jądro siatkowate pokrywy mostu, K – komórka koszyczkowata, P – komórka Purkinjego, WK – włókna
kiciaste, WP – włókna pnące, Z – komórka ziarnista.
Neurony uczestniczące w regulacji VOR tworzą otwartą pętlę neuronalną zwaną
„łukiem Lorente de Nó“. W skład jej wchodzą: neurony zwoju przedsionkowego,
otrzymujące informację z przedsionka, drugorzędowe neurony przedsionkowe
oraz
neurony okoruchowe unerwiające mięśnie gałki ocznej. Koordynacja OKR odbywa się
10
za pomocą zamkniętej pętli neuronalnej utworzonej przez komórki zwojowe siatkówki,
jądra śródmózgowia, część przedsionkową móżdżku oraz kompleks jąder móżdżku i
jąder przedsionkowych. Komórki ziarniste i koszyczkowate części przedsionkowej
móżdżku
otrzymują
również
impulsację
przedsionkową,
optokinetyczną
oraz
okoruchową za pomocą włókien kiciastych. Komórki Purkinjego tej części móżdżku
kontrolują VOR i OKR poprzez połączenia z kompleksem jąder móżdżkowych i
przedsionkowych.
1.6 Białko pcp-2
Tkankowo specyficzne eksperymenty transgeniczne w komórkach Purkinjego
móżdżku stały się możliwe wraz z odkryciem białka L7 zwanego zgodnie z oficjalną
nomenklaturą: pcp-2 (ang. Purkinje cell protein, patrz: Mouse Genome Informatics –
www.jax.org). Białko to opisane po raz pierwszy w 1988 roku przez dwie niezależne
grupy badawcze [148, 149] charakteryzuje się bardzo specyficzną ekspresją i
syntetyzowane jest jedynie w neuronach dwubiegunowych siatkówki oraz komórkach
Purkinjego móżdżku [19, 150]. Gen kodujący to białko zlokalizowany jest na
chromosomie 8 [34, 64] i zbudowany jest z 4 opisanych dotąd eksonów zajmujących
około 4% całej sekwencji o długości 8kb [151, 198]. W trakcie badań własnych
stwierdziłem obecność dodatkowego krótkiego eksonu, znajdującego się pomiędzy
eksonami 3 i 4 [Barski et al., artykuł w przygotowaniu]. Lokus genu pcp-2 koduje
mRNA będące źródłem białka o ciężarze cząsteczkowym 16kD [149]. Translacja
rozpoczyna się od kodonu ATG obecnego w eksonie 2 i obejmuje ekson 3 oraz część
eksonu 4. Pcp-2 zawiera region o sekwencji zbliżonej do czynnika wzrostu pochodzenia
płytkowego oraz domenę GRP (ang. G protein regulatory motif) odpowiedzialną za
interakcję pcp-2 z białkami G [125, 146]. Eksperymenty biochemiczne wykazały, iż pcp2 moduluje uwalnianie GDP z białek Gi oraz Go. Ekspresja tego białka w komórkach
Purkinjego myszy rozpoczyna się podczas pierwszych dwóch tygodni po urodzeniu, a
jego obecność można wykazać poprzez barwienie immunohistochemiczne, Western blot,
hybrydyzację RNA in situ oraz Northern blotting [148, 149]. Oznacza to, iż pcp-2
występuje w komórkach Purkinjego w stosunkowo dużych ilościach, co sugerowałoby
znaczącą rolę tego białka dla tej populacji neuronów. Linie myszy z wyłączonym genem
dla pcp-2 zostały stworzone niezależnie w dwóch laboratoriach [138, 199]. Jednak
11
Wstęp
wbrew oczekiwaniom, nie stwierdzono u tych myszy żadnych zmian fenotypowych,
zarówno pod względem morfologicznym, jak i behawioralnym. Należy jednak dodać, iż
badania te były prowadzone zanim poznano funkcję pcp-2 jako modulatora uwalniania
GDP, tak więc odpowiednie eksperymenty badające ten aspekt funkcjonalny ujawniłyby
może nieodkryte dotychczas odstępstwa od fenotypu dzikiego. Pomimo, iż funkcja pcp-2
pozostaje nadal niewyjaśniona, sekwencje nukleotydów kodujące to białko były
wielokrotnie stosowane w badaniach nad funkcją móżdżku, umożliwiając wprowadzanie
ekspresji genów heterologicznych do komórek Purkinjego [9, 13, 26, 27, 28, 41, 48, 56,
57, 58, 86, 101, 150, 181, 182, 183, 210, 211].
1.7 Rodzina białek „EF-hand”
W przetworzeniu sygnału „wapniowego” na odpowiedź komórkową uczestniczą
białka wiążące jony Ca2+, przy czym zaangażowane są one z jednej strony w
bezpośrednią indukcję wapniozależnych procesów komórkowych (sensory wapnia), z
drugiej natomiast w buforowanie poziomu wapnia na obszarze cytoplazmy (bufory
wapnia). Na szczególną uwagę zasługuje grupa białek należących do tzw. rodziny EFhand. Wspólną cechą strukturalną tej rodziny jest obecność domen wiążących jony
wapnia, zwanych EF-hand [12, 97, 159]. Nazwa ta pochodzi od ich charakterystycznej
budowy przypominającej kształtem dłoń, opisanej po raz pierwszy przez Kretsingera
[108]. Domenę EF-hand tworzą dwie α-helisy oraz pętla zbudowana z 12 aminokwasów,
które wiążą jon Ca2+. Wniknięcie jonu wapnia do domeny prowadzi do jego związania
oraz zmiany konformacji EF-hand (ryc.6).
12
Ryc.6 Schematyczne przedstawienie budowy domeny „EF-hand“ oraz zmiany jej konformacji po związaniu
jonu Ca2+.
Jony wapnia są wiązane ze stałą dysocjacji około 1µM w obecności milimolarnego,
fizjologicznego stężenia jonów magnezu, które mogą być wymiennie wiązane przez
domenę EF-hand na drodze kompetycji. Prototypem białka z rodziny EF-hand jest
kalmodulina, rozpowszechniona praktycznie w całym świecie roślinnym i zwierzęcym.
Kalmodulina posiada cztery domeny EF-hand i jest mediatorem wielu wapniozależnych
procesów komórkowych. W grupie białek buforujących stężenie jonów wapniowych w
cytoplazmie, do najlepiej poznanych należą: kalretynina, parwalbumina i kalbindyna.
Zainteresowanie tymi białkami spowodowane zostało ich specyficzną lokalizacją
ograniczoną do niektórych tylko populacji komórek ośrodkowego układu nerwowego
(OUN) [11, 35, 178]. Jeżeli porównamy ekspresję tych trzech białek w mózgowiu myszy
(ryc.7), dostrzeżemy od razu wyraźne różnice w rozmieszczeniu tych trzech buforów
wapniowych. Szczegółowa analiza immunohistologiczna wykazała, iż obszary
wyznakowane przeciwciałami specyficznymi dla każdego z tych białek, pokrywają się ze
sobą w bardzo nieznacznym stopniu.
13
Wstęp
Ryc.7 Immunohistologiczna lokalizacja buforów wapniowych w mózgowiu myszy. a. kalbindyna D-28k, b.
parwalbumina, c. kalretynina. H – hipokamp, K – kora mózgu, M – móżdżek, MO – most, OD – oliwka dolna, OW –
opuszka węchowa, P – prążkowie, PW – podwzgórze, W – wzgórze, WP – wzgórek przedni, WT – wzgórek tylny.
14
1.7.1 Charakterystyka buforów wapniowych obecnych w komórkach Purkinjego
Jeżeli przyjrzymy się lokalizacji kalretyniny, parwalbuminy i kalbindyny w korze
móżdżku zobaczymy, iż komórki Purkinjego pozbawione są zupełnie kalretyniny,
natomiast zawierają parwalbuminę i kalbindynę. Kalretynina obecna jest na terenie
warstwy ziarnistej, gdzie występuje we wszystkich komórkach ziarnistych [167, 176],
jednobiegunowych komórkach koszyczkowatych [51, 52, 65] oraz komórkach Lugaro
[50, 170] (ryc.8 e,f). W warstwie drobinowej kalretyninę zawierają wyłącznie aksony
komórek ziarnistych, czyli włókna równoległe [170, 176].
Ryc.8 Lokalizacja białkowych buforów wapniowych w móżdżku myszy. a+b. kalbindyna D-28k, c+d parwalbumina,
e+f. kalretynina. KM – kora móżdżku, JM – jądra móżdżku, WD – warstwa drobinowa, WKP – warstwa komórek
Purkinjego, WZ – warstwa ziarnista. Prostokątem zaznaczono obszar przedstawiony przy silniejszym powiększeniu.
a+c+e – bar = 500 µm, b+d+f – bar = 50 µm.
1.7.1.1 Kalbindyna D-28k
15
Wstęp
Kalbindyna D-28k jest produktem genu Calb1 zlokalizowanego u myszy na
chromosomie
4
(szczegółowe
informacje
patrz.:
Ensembl
Genome
Browser,
http://www.ensembl.org/Mus_musculus/geneview?gene=ENSMUSG00000028222 oraz
National Center for Biotechnology Information, NCBI, sekwencje: SEG D25367S oraz
D25352 do D25357). Analiza sekwencji kodujących kalbindynę D-28k wykazała
obecność 11 eksonów oraz sekwencji regulujących ekspresję tego białka, tworzących
region promotorowy zajmujący około 3,5 kb [158, 190]. Efektem ekspresji tego genu jest
białko o masie cząsteczkowej 28kD, posiadające sześć domen EF-hand, z których cztery
wiążą jony Ca2+, natomiast dwie z nich nie posiadają tej zdolności ze względu na
zmieniony skład aminokwasowy [39] (ryc.9).
Ryc.9 Schemat ilustrujący organizację domen „EF-hand“ wchodzących w skład kalbindyny D-28k. Kolorem
czerwonym oznaczono domeny zdolne do wiązania jonów Ca2+, natomiast kolorem niebieskim domeny nieaktywne.
Szczegółowe badania nad kinetyką wiązania jonów Ca2+ przez kalbindynę
ujawniły, iż białko to zawiera domeny EF-hand o zróżnicowanych parametrach
kinetycznych, co wiąże się z ich różnym powinowactwem do jonów wapnia [144].
Domeny o wyższym powinowactwie są domenami wolnymi, a ich stała k+, opisująca
szybkość wiązania jonów wapnia, waha się w zakresie 1,1-1,3 x 107 M-1s-1. Domeny o
niższym powinowactwie są około osiem razy szybsze przy k+Ca2+ = 7,7-8,7 x 107 M-1s-1.
Przedstawione parametry kinetyczne pozwalają określić kalbindynę jako bufor szybki,
zdolny do wiązania jonów wapniowych w pierwszej fazie ich napływu do komórki.
Parametry te wynikają również z faktu, iż kalbindyna wykazuje bardzo niskie
powinowactwo do jonów magnezu, czym różni się zasadniczo od parwalbuminy,
również obecnej w komórkach Purkinjego [76, 117].
Kalbindynę oczyszczono po raz pierwszy z jelita kurzego [192], a następnie
zlokalizowano ją w nerce, gdzie uczestniczy w transporcie jonów wapniowych [59].
Dalsze badania nad występowaniem kalbindyny ujawniły jej rozpowszechnioną
ekspresję w układzie nerwowym wielu gatunków zwierząt, i to zarówno bezkręgowców,
jak i kręgowców [35, 166]. W układzie nerwowym dorosłych ssaków kalbindyna
16
zlokalizowana jest w komórkach nerwowych o długich aksonach, występujących
głównie we wzgórzu, prążkowiu i istocie czarnej oraz w neuronach o krótkich aksonach
takich jak interneurony rdzenia kręgowego, kory mózgu, hipokampa czy komórki
ziarniste zakrętu zębatego [11, 12, 35, 67, 90, 178]. Ekspresja kalbindyny pojawia się
również przejściowo w określonych stadiach rozwoju embrionalnego [7]. U zwierząt
dorosłych poziom ekspresji tego białka utrzymuje się na mniej więcej stałym poziomie,
wykazując tendencję spadkową wraz z wiekiem [120]. Na terenie kory móżdżku
występowanie kalbindyny ograniczone jest tylko i wyłącznie do komórek Purkinjego, w
których rozmieszczona jest ona równomiernie na terenie całej cytoplazmy wypełniając
ich dendryty oraz aksony, a jej stężenie, w zależności od metody pomiaru, oceniane jest
na 210 - 370µM, co stanowi około 15% całkowitej masy białka (ryc.8 a,b).
Badania w warunkach nadekspresji kalbindyny lub po jej wprowadzeniu do
różnych typów komórek wykazały, iż białko to posiada zdolność buforowania jonów
Ca2+ i modulacji funkcji kanałów wapniowych, przez co uczestniczy w regulacji
wewnątrzkomórkowej homeostazy wapniowej [6, 37, 136]. W ten sposób kalbindyna
może wpływać na wapniozależną sygnalizację komórek pobudliwych, jakimi są neurony,
i tym samym wpływać na ich fizjologiczne funkcje. Zjawisko to zostało opisane między
innymi na przykładzie neuronów należących do jądra nadwzrokowego podwzgórza,
które pod wpływem kalbindyny mogą zmieniać rodzaj aktywności elektrycznej z
pulsacyjnej na ciągłą [118]. Neurony jądra nadwzrokowego podwzgórza zaangażowane
są w regulację wydzielania wazopresyny i oksytocyny. Wydzielaniu pierwszego z
hormonów towarzyszą potencjały czynnościowe generowane w sposób pulsacyjny,
natomiast wydzielaniu drugiego z nich towarzyszy impulsacja ciągła [79]. Kolejnym
krokiem w badaniach nad funkcją kalbindyny było stworzenie ogólnych mutantów, czyli
myszy pozbawionych tego białka w całym organizmie [2]. Myszy te nie wykazywały
żadnych zaburzeń rozwojowych czy morfologicznych w obrębie ośrodkowego układu
nerwowego. Obserwacja zachowania tych zwierząt w standardowych warunkach
hodowlanych nie pozwalała dostrzec żadnych anomalii behawioralnych, natomiast
specyficzne testy sprawdzające koordynację ruchową podczas wymuszonej adaptacji do
nowych warunków środowiskowych, wykazała znaczne upośledzenie sprawności
motorycznej [2]. Analiza aktywności elektrycznej komórek Purkinjego będącej
odpowiedzią na stymulację włókien pnących czy równoległych, nie wykazała żadnych
17
Wstęp
zaburzeń spowodowanych brakiem kalbindyny w tych neuronach. Zaobserwowano
natomiast wyraźne zmiany w przebiegu wywoływanych stymulacją synaptyczną wahań
stężenia jonów Ca2+ w dendrytach komórek Purkinjego [2]. Stymulacja komórek
Purkinjego pojedynczym impulsem poprzez włókna równoległe czy pnące powoduje
gwałtowny wzrost stężenia jonów wapniowych, a następnie jego wolniejszy, dwufazowy
spadek, zawierający komponentę szybką i wolną. Amplituda komponenty szybkiej była
czterokrotnie wyższa u zwierząt pozbawionych kalbindyny (Cb-/-) niż u zwierząt
kontrolnych (Cb+/+). Amplituda komponenty wolnej oraz spoczynkowe stężenie jonów
wapniowych pozostawało bez zmian. Na podstawie wyników tych badań powstała
hipoteza robocza, iż kalbindyna D-28k jest szybkim buforem jonów wapniowych
uczestniczącym w regulacji wahań stężenia jonów Ca2+.
Większość danych eksperymentalnych na temat kalbindyny pochodzi jednak z
eksperymentów prowadzonych na neuronach hipokampa. Kalbindyna jest tu obecna w
komórkach ziarnistych zakrętu zębatego i neuronach piramidowych pola CA1, brak jej
natomiast na terenie pola CA3. Stwarza to wygodną sytuację do badań nad jej funkcją
postsynaptyczną przy połączeniach neuronów piramidowych CA3 i CA1 oraz
presynaptyczną w przypadku połączeń pomiędzy neuronami ziarnistymi zakrętu i
piramidowymi pola CA3. Jedne z wcześniejszych badań prowadzonych na hodowanych
neuronach hipokampa w warunkach nadekspresji kalbindyny wykazały zmniejszone
wzmocnienie synaptyczne w tych neuronach [38], co było zgodne z założeniem, iż w
obecności kalbindyny szybciej spada stężenie wolnego wapnia Ca2+ w komórce. Stąd też
obniżone torowanie w komórkach hipokampa pozbawionych kalbindyny było wynikiem
nieoczekiwanym [100]. Niezgodność tę można by wytłumaczyć różnymi populacjami
neuronalnymi analizowanymi w obu tych eksperymentach. Jednak bardziej eleganckim
rozwiązaniem są wyniki nowszych badań, które wykazały, iż obecność szybkiego buforu
jonów Ca2+ po stronie presynaptycznej może prowadzić do zwiększonego torowania
zależnego od częstotliwości – pseudotorowania [173]. W eksperymencie tym,
prowadzonym na neuronach kory szczura, zastosowano chelatory jonów wapniowych
BABTA i EGTA, którymi wypełniano neurony. W przypadku iniekcji przy pomocy
BABTA, po zastosowaniu pierwszego bodźca następowało częściowe wysycenie tego
chelatora jonami Ca2+, czego efektem było zmniejszone buforowanie tych jonów po
zastosowaniu drugiego bodźca, a tym samym wzrost stężenia Ca2+. Efekt ten był jednak
18
widoczny jedynie w przypadku BABTA, który jest szybkim buforem jonów
wapniowych. Nie obserwowano go jednak po zastosowaniu EGTA, będącego buforem
wolnym. Jak już nadmieniłem wcześniej, kalbindyna posiada dwie szybkie domeny
wiążące jony wapniowe, co upodabnia jej właściwości buforujące do chelatora BABTA.
Stąd też niskie lub średnie stężenie kalbindyny (lub BABTA) zwiększa torowanie,
natomiast jej nieobecność (myszy-mutanty pozbawione kalbindyny – Cb-/-) lub bardzo
wysokie
stężenie
(nadekspresja
kalbindyny)
zmniejsza
torowanie.
Celem
dokładniejszego poznania tego procesu w neuronach hipokampa, stworzona została linie
myszy transgenicznych, u których ekspresja kalbindyny została zredukowana przy
pomocy ekspresji antysensownej [139]. U myszy tych mierzono torowanie po
zastosowaniu impulsu parzystego w kolateralach Schaffera, gdzie po stronie
presynaptycznej znajduje się bardzo niewiele kalbindyny [93] i zgodnie z wynikami
uzyskanymi u zwierząt Cb-/- [100] torowanie wykazywało wartości niezmienione.
Zwierzęta z antysensowną ekspresją kalbindyny badano również pod względem
długotrwałej plastyczności neuronów hipokampa i związanej z nią pamięci [93, 100].
Otrzymane wyniki wykazały zaburzenia wzmocnienia synaptycznego (LTP – ang. long
term potentiation) oraz trudności przy wykonywaniu przez zwierzęta testów
behawioralnych sprawdzających orientację przestrzenną.
Badania dotyczące roli kalbindyny w komórkach nerwowych sugerują również jej
możliwy udział w zapobieganiu neurodegeneracji, lecz funkcja ta nie została ostatecznie
potwierdzona [3, 69, 80, 100, 208]. Wysoki poziom ekspresji kalbindyny D-28k w jądrze
nadskrzyżowaniowym (nucleus suprachiasmaticus - SCN) spowodował zainteresowanie
naukowców ewentualną rolą kalbindyny w funkcjonowaniu tzw. „zegara biologicznego”,
dostosowującego
aktywność
fizjologiczną
zwierząt
i
człowieka
do
cyklów
okołodobowych. Przeprowadzone eksperymenty wykazały korelację pomiędzy fazami
cyklu okołodobowego a ekspresją kalbindyny oraz sugerują możliwość regulacji
aktywności neuronów SCN poprzez to białko [77, 91, 114, 115, 180]. Interesujące
wyniki otrzymano również podczas eksperymentów badających ewentualną funkcję, jaką
mogłaby pełnić kalbindyna jako sensor wapniowy. Hipotezę taką wspierają wyniki
analizy fizykochemicznych właściwości kalbindyny oraz pierwsze dane odnośnie
możliwych przekaźników uczestniczących w sygnalizacji inicjowanej przez zmiany
konformacyjne kalbindyny [17, 18].
19
Wstęp
1.7.1.2 Parwalbumina
Oprócz kalbindyny komórki Purkinjego zawierają parwalbuminę, przy czym
występuje ona również w innych elementach neuronalnych kory móżdżku, a mianowicie
w GABA-ergicznych interneuronach warstwy drobinowej, czyli w komórkach
gwiaździstych i komórkach koszyczkowatych, które unerwiają komórki Purkinjego, a
same otrzymują impulsację z włókien równoległych i pnących [35, 106] (ryc.8 c,d).
Parwalbumina jest białkiem cytoplazmatycznym o masie cząsteczkowej 12kD i wypełnia
całe wnętrze komórek Purkinjego, a jej stężenie ocenia się na 50-100µM [106, 161].
Posiada ona trzy domeny EF-hand, w tym dwie aktywne, przy czym ich silne
powinowactwo do jonów magnezu powoduje, iż parwalbumina w warunkach
fizjologicznych wysycona jest tymi jonami, co zasadniczo zmienia jej kinetykę wiązania
jonów Ca2+. Stała dysocjacji dla Ca2+ przy panującym w neuronach stężeniu Mg+ [82,
113, 117, 188] wynosi pomiędzy 80-150nM, co obniża wartość k+ do około 6 x 106 M-1s-1
i czyni parwalbuminę wolnym buforem jonów wapniowych w porównaniu z kalbindyną.
1.8 System Cre/loxP
Mutacje tkankowo specyficzne należą do kluczowych metod biologii molekularnej.
Pozwalają one na wyłączenie lub zmianę funkcji badanego białka w zdefiniowanej
populacji komórkowej, co z jednej strony umożliwia zawężenie badań do wybranego,
interesującego nas obszaru, z drugiej natomiast strony pozwala na uniknięcie problemów
powstających przy tworzeniu mutantów ogólnych. Zdarza się mianowicie często, iż
wyłączenie funkcji genu dla białka uczestniczącego w kluczowych procesach
komórkowych prowadzi do fenotypu letalnego, co może w znacznym stopniu utrudnić,
lub wręcz uniemożliwić, analizę zwierząt homozygotycznych. System Cre/loxP jest
dotychczas najlepiej poznanym i najczęściej stosowanym przy generowaniu mutacji
zdefiniowanych tkankowo [14, 109, 162, 164, 207]. Wykorzystuje on zjawisko
rekombinacji genowej występującej u bakteriofaga P1, opisane w 1981 roku przez
Sternberga i Hamiltona [187]. Opisany przez tych autorów system rekombinacji
wykorzystuje dwa elementy (ryc.10):

sekwencje loxP (ang. loxP sites), które są krótkimi sygnałowymi sekwencjami
DNA,
20

rekombinazę Cre.
Ryc.10 Zasada działania systemu rekombinacji Cre/loxP. a. Skład nukleotydowy sekwencji loxP, strzałką zaznaczono
fragment odpowiedzialny za orientację sekwencji loxP. b. Efekt rekombinacji w zależności od wzajemnej orientacji
sekwencji loxP.
Pojedyncza sekwencja loxP zbudowana jest z 34 par nukleotydów, które kodują trzy
elementy funkcjonalne, a mianowicie rdzeń odpowiedzialny za orientację sekwencji loxP
w łańcuchu DNA oraz dwie marginalne sekwencje będące sygnałami rozpoznawczymi
dla recombinazy Cre (ryc.10a). Rekombinaza Cre jest białkiem enzymatycznym, które po
rozpoznaniu sekwencji loxP obecnych w łańcuchu DNA rekombinuje sekwencje
nukleotydów zawarte między nimi. Efekt rekombinacji zależny jest od wzajemnej
orientacji sekwencji loxP (ryc.10b). Sekwencje loxP skierowane w tę samą stronę
powodują wycięcie zawartego pomiędzy nimi fragmentu DNA, przy czym w
zrekombinowanym
fragmencie
pozostaje
jedna,
kompletna
sekwencja
loxP.
Wprowadzenie sekwencji loxP skierowanych wzajemnie do siebie powoduje odwrócenie
fragmentu DNA zawartego pomiędzy nimi. Chcąc stworzyć linię myszy posiadających w
swoim genomie mutację o zdefiniowanym zakresie występowania, musimy stworzyć
dwie wyjściowe linie myszy. W pierwszej z nich sekwencję nukleotydów, którą chcemy
zrekombinować, modyfikujemy poprzez wprowadzenie sekwencji loxP na jej końcach 3’
oraz 5’. Wprowadzenie sekwencji loxP do badanego genu jest zabiegiem stosunkowo
prostym, możliwym praktycznie w przypadku dowolnej, znanej sekwencji DNA i polega
na zastąpieniu macierzystej sekwencji poprzez sekwencję zmodyfikowaną w drodze
rekombinacji homologicznej. Najistotniejszym aspektem modyfikacji DNA przy pomocy
21
Wstęp
sekwencji
loxP
jest
ryzyko
zaburzenia
ekspresji
białka
kodowanego
przez
zmodyfikowany odcinek DNA. Dlatego też przed dalszymi eksperymentami należy
przeprowadzić analizę jakościową oraz ilościową białka syntetyzowanego na podstawie
informacji zawartej w zmodyfikowanym fragmencie genu, porównując otrzymane
wyniki z danymi pochodzącymi od osobników genetycznie niezmienionych.
Do genomu drugiej linii myszy wprowadzamy sekwencję DNA kodującą
rekombinazę Cre, przy czym jej ekspresja jest sterowana przez elementy regulacyjne
należące do genu o znanym schemacie aktywności tkankowej. Najpoważniejszym
ograniczeniem tej części systemu Cre/loxP jest niewielka liczba genów o ekspresji
zawężonej do wyraźnie zdefiniowanych populacji komórkowych. Dodatkowym
utrudnieniem jest fakt, iż zasadniczo nie możemy wprowadzić do genomu sekwencji
kodujących rekombinazę Cre poprzez rekombinację homologiczną. Zabieg taki
spowodowałby zastąpienie ekspresji endogennego białka poprzez ekspresję rekombinazy
Cre, w wyniku czego dokonalibyśmy genetycznego „nockoutu”. Brak danego białka
mógłby doprowadzić do zmian fenotypowych fałszujących wyniki oczekiwane przez nas
po rekombinacji. Z powyższego powodu elementy kodujące tkankowo specyficzną
ekspresję rekombinazy Cre wprowadzane są do genomu na zasadzie integracji
przypadkowej (ang. random integration). Minusem tej metody jest możliwość, iż
specyficzność oraz poziom ekspresji będą zależały od miejsca integracji w genomie.
Dlatego też konieczne jest zawsze stworzenie kilku linii myszy z ekspresją rekombinazy
Cre i staranne przeanalizowanie każdej z nich pod względem ekspresji tego białka. W
przypadku gdy modyfikujemy gen uczestniczący w regulacji funkcji behawioralnych,
niezbędna jest również analiza linii wyjściowych pod tym kątem.
W następnej kolejności krzyżuje się ze sobą opisane linie myszy, czego efektem jest
rekombinacja materiału genetycznego występująca u osobników dziedziczących
jednocześnie ekspresję rekombinazy Cre oraz fragment genomu „wyznakowany”
sekwencjami loxP.
22
Założenia i cel pracy
2. Założenia i cel pracy
Podstawą do podjęcia eksperymentów przedstawionych w dalszej części tej pracy
stały się następujące fakty dotyczące komórek Purkinjego kory móżdżku:
neurony te są jedynym źródłem impulsacji opuszczającej tę część ośrodkowego
układu nerwowego,
w komórkach tych jony wapnia Ca2+ pełnią kluczową rolę, podobnie jak we
wszystkich komórkach pobudliwych,
kalbindyna D-28k, będąca buforem jonów wapniowych, jest obecna tylko i
wyłącznie w tej grupie neuronów kory móżdżku,
komórki Purkinjego posiadają zdolność do modyfikacji swych połączeń
synaptycznych poprzez proces hamowania długotrwałego – LTD.
Wyjściowym procesem prowadzącym do
powstania
LTD
jest
aktywacja
postsynaptycznych metabotropowych receptorów glutaminergicznych – mGluR [171].
Myszy pozbawione ekspresji receptora mGluR1, będącego podtypem receptora mGluR
obecnym w komórkach Purkinjego [72, 130, 174], wykazują zaburzenia koordynacji
ruchowej pochodzenia móżdżkowego oraz brak LTD [1, 42]. Dalsze eksperymenty
wykazały, że zaburzenia kaskady sygnalizacyjnej receptora mGluR1 prowadzą do
zakłóceń procesu LTD oraz do dysfunkcji koordynacji ruchowej niezależnie od poziomu,
na którym zaburzy się sygnalizację. Dotyczy to zarówno ingerencji w funkcję białka Gαq
[152], fosfolipazy Cβ [95], czy też IP3 [132, 137]. Jak już nadmieniłem wcześniej, ostatni
z
wymienionych
elementów
jest
zaangażowany
w
uwalnianie
Ca2+
z
wewnątrzkomórkowych zbiorników tych jonów [63, 135, 189], który to proces jest
zaangażowany w synaptyczną sygnalizację wapniową prowadzącą w efekcie do LTD
[175, 105]. Wcześniejsze eksperymenty wykazały, że zmiany dynamiki wahań stężenia
jonów Ca2+ spowodowane wyłączeniem ekspresji kalbindyny D-28k mogą również
prowadzić do dysfunkcji koordynacji ruchowej [2]. Ze względu jednak na ogólny
charakter mutacji genu kalbindyny, eksperymenty te nie wyjaśniły, które z wielu grup
neuronów zawierających kalbindynę odpowiedzialne są za obserwowane zmiany
fenotypowe.
Przeprowadzone przeze mnie eksperymenty miały więc dać odpowiedź na
następujące pytania:
24

czy możliwa jest specyficzna i skuteczna ekspresja rekombinazy Cre z
wykorzystaniem sekwencji regulatorowych białka pcp-2?

czy system rekombinacji Cre/loxP pozwoli na specyficzne wyłączenie ekspresji
kalbindyny D-28k w komórkach Purkinjego móżdżku?

czy zaburzenia koordynacji ruchowej obserwowanej u myszy spowodowane są
brakiem kalbindyny w komórkach Purkinjego?

czy kalbindyna D-28k uczestniczy w procesie tworzenia hamowania
długoterminowego LTD?

jak wpływa brak kalbindyny na dynamikę zmian stężenia jonów Ca2+ komórkach
Purkinjego?
W tym celu stworzyłem linię myszy pozbawionych kalbindyny tylko w komórkach
Purkinjego móżdżku. Eksperyment ten wykonałem poprzez mutację tkankowo
specyficzną z wykorzystaniem technologii Cre/loxP, a otrzymane mutanty poddałem
szczegółowej analizie na poziomie komórkowym i behawioralnym.
25
Materiał i metody
3. Materiał i metody
3.1 Klonowanie DNA
Fragment genomowego DNA wykorzystany do konstrukcji wektora dla linii
Calbtm.2 został wyizolowany z biblioteki DNA 129Sv (Stratagene, La Jolla, USA) [2].
Wszystkie etapy klonowania opisane w tej pracy przeprowadziłem na bazie plazmidu
pBluescript SK+ (Stratagene, La Jolla, USA) oraz bakterii DH5α (Stratagene, La Jolla,
USA). Enzymy restrykcyjne wykorzystywane podczas prowadzonych przeze mnie
eksperymentów pochodziły z firmy New England Biolabs, Beverly, USA. Fragmenty
DNA izolowałem z żelu agarozowego przy pomocy zestawu QIAquick Gel Extraction
Kit (Qiagen, Hilden, Niemcy). DNA plazmidowe izolowałem z bakterii przy pomocy
zestawu Plasmid Maxi Kit (Qiagen, Hilden, Niemcy). Kasetę selekcyjną wprowadzoną
do wektora Calbtm.2 otrzymałem od dr R. Fässlera z Instytutu Biochemii Maxa Plancka
(Martinsried, Niemcy) [66]. Plazmid pMCCre, zawierający cDNA kodujące rekombinazę
Cre, pochodził od dr H. Gu i dr K. Rajewskiego z Uniwersytetu w Kolonii (Kolonia,
Niemcy) [74]. Plazmid L7∆AUG pochodził od dr. J. Oberdicka z Uniwersytetu
Stanowego w Ohio (Columbus, USA) [151].
3.2 Przygotowanie komórek pnia.
Przy tworzeniu opisanych przeze mnie w tej pracy linii myszy: Calbtm.2 i L7Cre-2
wykorzystałem komórki pnia R1, będące darem od dr. Andreasa Nagy z Uniwersytetu w
Toronto (Toronto, Kanada) [145]. DNA wprowadzałem do komórek pnia poprzez
elektroporację przy pomocy urządzenia Gene Pulser (BioRad, Hercules, USA).
Komórki pnia hodowałem na warstwie fibroblastów w medium hodowlanym
zawierającym czynnik hamujący białaczkę (LIF – ang. leukemia inhibitory factor),
stosując do selekcji pozytywnej preparat G418 (Stratagene, La Jolla, USA), natomiast do
selekcji negatywnej Gancyclovir w postaci preparatu Cymevene (Roche, Austria). DNA
klonów przeżywające selekcję, trawiłem odpowiednią endonukleazą (patrz: „Wyniki”) i
analizowałem metodą Southern blot. Iniekcja blastocyst została wykonana przy pomocy
urządzenia FemtoJet (Eppendorf, Hamburg, Niemcy), sprzężonego z mikroskopem
Axiovert (Carl Zeiss, Esslingen, Niemcy).
3.3 Zwierzęta eksperymentalne
26
Blastocysty użyte do iniekcji komórek pnia pochodziły od myszy z linii C57Bl/6
(C57Bl/6NCrl BR, Charles River, Sulzbach, Niemcy). Biorcami blastocyst były
pseudociężarne myszy z linii CD-1 (CD-1(ICR)BR Charles River, Sulzbach, Niemcy).
Do krzyżowania chimer i krzyżówek wstecznych linii Calbtm.2 oraz L7Cre-2 używałem
myszy z linii C57Bl/6 (C57Bl/6NCrl BR, Charles River, Sulzbach, Niemcy). Myszy z
linii GtROSA26 pochodziły z ze stacji hodowlanej Jackson Laboratories, Bar Harbor,
USA [184]. Stworzona przeze mnie linia myszy transgenicznych L7Cre-2 jest ogólnie
dostępna pod nazwą Pcp-2-cre w instytucie badawczym The Jackson Laboratory, Bar
Harbor, USA, http://www.jax.org. Dane liczbowe dotyczące zwierząt użytych do testów
sprawnościowych i behawioralnych zamieszczone zostały w opisie poszczególnych
eksperymentów. Wszystkie linie myszy hodowałem w standardowych warunkach
świetlnych w zwierzętarni Instytutu Neurobiologii Maxa Plancka (Martinsried, Niemcy),
gdzie otrzymywały standardową paszę i wodę ad libitum. Eksperymenty były
prowadzone zgodnie z przepisami regulującymi eksperymenty na zwierzętach,
obowiązującymi w Republice Federalnej Niemiec.
3.4 Ekstrakcja DNA i analiza metodą „Southern blot”
DNA stosowane w genotypizacji izolowałem przy pomocy standardowej metody
lizując pobrany materiał w buforze zawierającym 100mM Tris-HCl pH 8,5, 5mM EDTA,
0,2% SDS, 200mM NaCl oraz proteinazę K w ilości 100µg/ml. Otrzymane DNA
trawiłem endonukleazą restrykcyjną, rozdzielałem elektroforetycznie na 0,8% żelu
agarozowym, a następnie poddawałem denaturacji alkalicznej. Zdenaturowane DNA
przenosiłem metodą kapilarną na membranę Hybond+ (Amersham Biosciences,
Amersham Place, Wielka Brytania), którą następnie hybrydyzowałem z wyznakowaną
radioktywnie sondą. Wyniki hybrydyzacji analizowałem przy pomocy urządzenia BAS2500 (Fujifilm Medical Systems, Stanford, USA).
3.5 Analiza ekspresjii metodą RT-PCR
Tkanki przeznaczone do ekstrakcji RNA homogenizowałem przy pomocy
homogenizatora Ultraturrax (Janke & Kunkel, Staufen, Niemcy) w buforze do ekstrakcji
Trizol (Gibco-BRL, Gaithersburg, USA). Po dodaniu chloroformu (150µl/ml
homogenatu), wirowałem homogenat w temperaturze 4oC przy 12000g. Z otrzymanego
27
Materiał i metody
w ten sposób supernatantu wytrącałem RNA dodając izopropanol i po inkubacji przez 16
godzin w temperaturze 4oC, wirowałem ponownie jak wyżej. Po przemyciu 70%
etanolem, rozpuszczałem peletkę w 10µl H2O. Stężenie RNA oznaczałem przy pomocy
spektrofotometru Ultrospec (Amersham Biosciences, Amersham Place, Wielka
Brytania).
Reakcję odwrotnej transkrypcji przeprowadzałem według poniższego schematu:
1µg RNA (1µl) rozcieńczałem w 11µl buforu TE (Tris-EDTA) pH7,4, dodając następnie
1µl primera Oligo(dt)12-18 (Invitrogene, Karlsruhe, Niemcy). Otrzymaną mieszaninę
inkubowałem kolejno: 5min, 90oC; 10min, 37oC; 15min, 20oC, po czym po zwirowaniu
dodawałem do każdej próbki 4µl buforu RT, 2µl 0,1M DTT (dithiothreitol), 0,8µl
odwrotnej trankryptazy SuperScriptII RNaseH- (Invitrogene, Karlsruhe, Niemcy), 0,5µl
dNTP (mieszaniny 4 nukleotydów, 25mM każdy, New England Biolabs, Beverly, USA)
oraz 0,5µl inhibitora RNazy (Boehringer, Mannheim, Niemcy). Przygotowane w ten
sposób próbki inkubowałem przez 1 godzinę w temperaturze 37oC, a po zakończeniu
reakcji dopełniałem je 10µl TE do objętości 30µl.
W wyniku opisanej powyżej reakcji otrzymywałem cDNA, które następnie służyło
mi jako matryca do reakcji PCR. Reakcję tę przeprowadzałem w objętości 25µl w
mieszaninie o następującym składzie: 18,425µl H2O, 0,75µl MgCl2 (50mM), 2,5µl
buforu PCR, 0,125µl polimerazy DNA Taq (Invitrogene, Karlsruhe, Niemcy), 0,2µl
dNTP oraz po 1µl obu primerów o stężeniu 10µM (synteza: Metabion GmbH,
Martinsried, Niemcy), stosując jako matrycę 1µl cDNA otrzymanego w wyniku
odwrotnej transkrypcji. Reakcję PCR wykonywałem w urządzeniu Mastercycler gradient
(Eppendorf, Hamburg, Niemcy) przy następujących parametrach:
dla Cb-28k:
95oC 5min; [95oC 30s; 66oC 30s; 72oC 30s] x 30; 72oC 5min
primery:
Cb sense: 5’-GCAGAATCCCACCTGCAGTCA-3’
Cb anti: 5’-TCGATGAAGCCGCTGTGGTCA-3’
dla GAPDH:
95oC 5min; [95oC 30s; 61oC 30s; 72oC 30s] x 21; 72oC 5min
primery:
GAPDH 5’: 5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’
28
GAPDH 3’: 5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’
Analizę produktów reakcji przeprowadzałem na 2% żelu agarozowym, barwionym
bromkiem etydyny.
3.6 Analiza ekspresjii metodą „Western blot”.
Tkanki wybrane do analizy homogenizowałem przy pomocy homogenizatora
Ultraturrax (Janke & Kunkel, Staufen, Niemcy) w buforze zawierającym: 0,01M TRis
HCl pH 7,4, 0,15M NaCl, 1mM PMSF (fluorek fenylo-metylosulfonylu) oraz leupeptynę
50µg/ml. Otrzymany homogenat wirowałem w ultrawirówce Optima (Beckman, USA)
przy 38000 x g przez 1 godzinę, w temperaturze 4oC. Powstały wyniku wirowania
supernatant podgrzewałem przez 15 min. w temperaturze 65oC, a następnie ponownie
wirowałem przez 15 min. przy ~18000 x g. Otrzymaną frakcję białkową zagęszczałem
przy pomocy filtrów Microcon nr 10 (Millipore, USA). Całkowitą zawartość białka w
otrzymanych frakcjach oznaczałem metodą kolorymetryczną Bradforda na podstawie
wyznaczonej krzywej wzorcowej. Analizy ekstraktów białkowych prowadziłem metodą
Western blot. W tym celu z frakcji białkowych pochodzących z poszczególnych tkanek
pobierałem identyczną
całkowitą
ilość
białka i rozdzielałem na
10%
żelu
poliakrylamidowym. Rozdzielone frakcje białkowe przenosiłem na membranę PVDF
(BioRad, Hercules, USA), którą następnie inkubowałem przez 16 godzin w temperaturze
4oC z przeciwciałami monoklonalnymi skierowanymi przeciwko kalbindynie D-28k w
rozcieńczeniu
1:10000
(Swant,
Bellinzona,
Szwajcaria).
Detekcję
reakcji
immunohistochemicznej przeprowadzałem metodą chemoluminescencji przy pomocy
zestawu ECL Plus (Amersham Biosciences, Amersham Place, Wielka Brytania), a
otrzymane wyniki analizowałem po ekspozycji membrany na materiale światłoczułym
BioMax MR-1 (Eastman Kodak, USA).
3.7 Analiza immunohistochemiczna
Zwierzęta przeznaczone do analizy immunohistochemicznej usypiałem przy
pomocy wodzianu chloralu podawanego dootrzewnowo w dawce 400 mg/1 kg, a
następnie po nacięciu prawego przedsionka perfundowałem przezsercowo wprowadzając
29
Materiał i metody
kaniulę do lewej komory serca. W pierwszej kolejności perfundowałem 20 ml 8% r-ru
NaCl w buforze fosforanowym (PBS), a następnie 30 ml 4% r-ru paraformaldehydu w
tym samym buforze. Po zakończeniu perfuzji izolowałem tkanki wybrane do analizy i
utrwalałem je dodatkowo przez około 16 godzin w r-rze paraformaldehydu
przygotowanym ja wyżej. Utrwalone tkanki przenosiłem następnie do 30% r-ru
sacharozy i pozostawiałem w nim aż do opadnięcia na dno naczynia, po czym zatapiałem
je w medium Tissue-Tek (Sakura, Japonia) i kroiłem na skrawki o grubości 30 µm przy
pomocy mikrotomu Leica CM3050 (Leica, Nussloch, Niemcy).
Procedurę barwienia z zastosowaniem immunofluorescencji wykonywałem na tzw.
skrawkach pływających i inkubowałem je według następującego schematu:
2 godziny w temperaturze 20oC w r-rze zawierającym: PBS, 10% serum
baranie, 0,03% Triton X-100, 0,01% preparat bakteriobójczy Timerosal
(Sigma, Taufkirchen, Niemcy),
około 16 godzin (inkubacja przez noc) w r-rze pierwszorzędowego
przeciwciała przygotowanym w PBS z dodatkiem 1% serum baraniego,
0,03% Triton X-100, 0,01% preparatu bakteriobójczego Timerosal,
płukanie 3 x 15 min w PBS w temperaturze 20oC,
2 godziny w r-rze drugorzędowego przeciwciała przygotowanym w PBS z
dodatkiem 1% serum baraniego, 0,03% Triton X-100, 0,01% środka
bakteriobójczego Timerosal,
płukanie 3 x 15 min w PBS w temperaturze 20oC i 1 x w 0,03% r-rze TRIS.
Podczas wszystkich etapów inkubacji skrawki były poddawane ciągłemu
mieszaniu.
Po zakończeniu barwienia skrawki nakładałem na szkiełka podstawowe i zamykałem w
medium zapobiegającym wygaszaniu fluorescencji Vectashield (Vector, Burlingame,
USA).
Analizę barwienia immunohistochemicznego wykonywałem przy pomocy konfokalnego
mikroskopu
fluorescencyjnego
Leitz
DMR
(Leica,
Bensheim,
Niemcy)
oraz
oprogramowania Image Space (Silicon Graphics, USA).
W przypadku barwienia przeciwciałami przeciwko rekombinazie Cre tkanki
przeznaczone do analizy zatapiałem po utrwaleniu (jak wyżej) w 30% żelatynie, a
następnie kroiłem przy pomocy wibratomu VT1000S (Leica, Bensheim, Niemcy) na
30
skrawki o grubości 50µm. Barwienie immunohistochemiczne przeprowadzałem na
skrawkach pływających, a pozytywną reakcję immunohistochemiczną uwidaczniałem
przy zastosowaniu peroksydazy chrzanowej, inkubując skrawki według poniższego
schematu:
15 min w 1% r-rze H2O2 w PBS/metanol 1:1,
płukanie 3 x 15 min w PBS zawierającym 0,2% Triton X-100,
30 min w 5% r-rze serum świńskiego w PBS z dodatkiem 0,2% Triton X100,
około 16 godzin (inkubacja przez noc) w temperaturze 4oC z poliklonalnymi
przeciwciałami króliczymi przeciwko rekombinazie Cre w 5% r-rze serum
świńskiego w PBS z dodatkiem 0,2% Triton X-100,
30 min w r-rze zawierającym biotynylowane przeciwciała przeciwko
królikowi, 5% serum świńskiego i 0,2% Triton X-100,
30 min w r-rze zawierającym komplex streptawidyny i peroksydazy
chrzanowej (ABC Komplex, Vector, Burlingame, USA),
płukanie 2 x 15 min w PBS,
reakcja barwna (kontrolowana pod mikroskopem) w mieszaninie składającej
się z 5 ml 0,05% r-ru diaminobezydyny (DAB) w PBS, 100 µl 2,5% r-ru
siarczanu niklowo-amonowego oraz 1µl 30% r-ru H2O2.
Po zakończeniu reakcji barwnej nakładałem skrawki na szkiełka podstawowe, po
wysuszeniu odwadniałem w ksylenie i zamykałem w Entelanie (Boehringer, Mannheim,
Niemcy). Otrzymane preparaty mikroskopowe analizowałem i fotografowałem przy
pomocy mikroskopu Axiophot, wyposażonego w system optyczny Nomarskiego (Carl
Zeiss, Esslingen, Niemcy).
Podczas wykonywania analizy immunohistochemicznej stosowałem następujące
przeciwciała pierwszorzędowe:
1.
monoklonalne przeciwciała mysie przeciwko kalbindynie Cb-28k, Swant,
Bellinzona, Szwajcaria, stężenie 1:500,
31
Materiał i metody
2.
poliklonalne
przeciwciała
królicze
przeciwko
parwalbuminie,
Swant,
Bellinzona, Szwajcaria, stężenie 1:400,
3.
poliklonalne przeciwciała królicze przeciwko kalretyninie, Swant, Bellinzona,
Szwajcaria, stężenie 1:500,
4.
poliklonalne przeciwciała królicze przeciwko PEP-19, otrzymane od dr J.
Morgana i dr K.-H. Herzoga, St Jude Children's Research Hospital, Memphis,
USA, stężenie 1:200 [212],
5.
poliklonalne przeciwciała królicze przeciwko PKC-γ, Sigma, Taufkirchen,
Niemcy, stężenie 1:500,
6.
poliklonalne przeciwciała królicze przeciwko GAD, Chemicon, Temecula,
USA, stężenie 1:200,
poliklonalne przeciwciała królicze przeciwko rekombinazie Cre, otrzymane od dr
Ch. Kellendonka, Deutsches Krebsforschungszentrum, Heidelberg, Niemcy, stężenie
1:5000 [98].
Reakcję immunohistochemiczną uwidaczniałem przy użyciu następujących
przeciwciał drugorzędowych:
1.
baranie przeciwciała przeciwko myszy wyznakowane pochodną fluoresceiny –
DTAF, Jackson ImmunoResearch, West Grove, USA, stężenie 1:100,
2.
ośle przeciwciała przeciwko królikowi wyznakowane pochodną rodaminy –
Texas Red, Jackson ImmunoResearch, West Grove, USA, stężenie 1:100,
3.
ośle przeciwciała przeciwko królikowi wyznakowane biotyną, Amersham
Biosciences, Amersham Place, Wielka Brytania, stężenie 1:100.
3.8 Barwienie β-galaktozydazy metodą lacZ
Zwierzęta i tkanki przeznaczone do analizy przygotowywałem w sposób opisany
przy metodach immunohistochemicznych. Mrożone skrawki o grubości 20 µm
naciągałem na szkiełka podstawowe, które następnie inkubowałem przez noc w
temperaturze 30oC w PBS zawierającym: 2 mM MgCl2, 5 mM K3Fe(CN)6, 5 mM
K4Fe(CN)6, 0,01% deoksycholanu sodu, 0,02% Nonidetu P40 oraz 1 mg/ml DMSO
(sulfotlenku dimetylowego) (Sigma, Taufkirchen, Niemcy).
32
Po zakończeniu inkubacji preparaty płukałem w PBS, podbarwiałem w 0,2% r-rze
czerwieni obojętnej (Sigma, Taufkirchen, Niemcy), a następnie po odwodnieniu w
szeregu alkoholowym i preparacie HistoClear (Sigma, Taufkirchen, Niemcy) zamykałem
w balsamie kanadyjskim (Carl Roth, Karlsruhe, Niemcy). Otrzymane preparaty
mikroskopowe analizowałem i fotografowałem przy pomocy mikroskopu Axiophot,
wyposażonego w system optyczny Nomarsky’ego (Carl Zeiss, Esslingen, Niemcy).
3.9 Test otwartego pola
Do przeprowadzenia testu otwartego pola (ang. open field) wykorzystałem ogółem
49 samców i samic w wieku od 2 do 6 miesięcy ze wszystkich linii myszy opisanych w
tej pracy. W celu uniknięcia zafałszowania wyników test przeprowadzałem w tym
samym pomieszczeniu, w którym hodowałem zwierzęta. Test wykonywałem z
wykorzystaniem
podłączonego
zestawu
do
TruScan
standardowego
(Coulbourn
komputera
Instruments,
z
Allentown,
zainstalowanym
USA),
odpowiednim
oprogramowaniem, pochodzącym z tej samej firmy. Zadaniem testu jest sprawdzenie,
czy wprowadzona mutacja wpływa na zachowanie myszy podczas eksploracji
nieznanego środowiska. W tym celu umieszcza się mysz na dnie klatki o szklanych
ścianach, mającej rozmiary 25,9 x 25,9 cm, i pozostawia w niej na określony czas bez
stosowania jakichkolwiek bodźców (ryc.11). Klatka, w której znajduje się mysz,
zaopatrzona jest w dwa pierścienie emitujące promieniowanie podczerwone w postaci
wiązek rozmieszczonych co 1,52 cm. Pierścień umieszczony bezpośrednio nad dnem
klatki rejestruje wszystkie ruchy wykonywane przez myszy w płaszczyźnie poziomej,
natomiast pierścień umieszczony powyżej rejestruje ruchy wykonywane w płaszczyźnie
pionowej. Aktywność zwierząt w obu tych płaszczyznach jest zapisywana przez program
komputerowy jako koordynaty opisujące ich położenie w klatce.
33
Materiał i metody
Ryc.11 Klatka do rejestracji zachowania
eksploracyjnego myszy podczas testu otwartego
pola.
Na podstawie tych wartości można następnie przeprowadzić analizę aktywności
badanego osobnika. W przypadku wykonywanego przeze mnie eksperymentu czas testu
wynosił 30 min., przy czym cały jego przebieg podzielony był na 1 minutowe odcinki
czasowe, będące podstawą do obliczania badanych parametrów. Każda mysz
wykonywała test jeden raz. Test wykonywałem zawsze pomiędzy godziną 14:00 i 17:00
w celu wykluczenia wpływu różnej aktywności dobowej zwierząt na wyniki testu. Aby
uniknąć obcych bodźców zapachowych, myłem klatkę po każdym zwierzęciu. Na
podstawie uzyskanych przeze mnie danych analizowałem dwa parametry:
całkowity dystans pokonywany przez mysz podczas trwania testu,
podnoszenie się przez mysz na tylnych kończynach („stawanie słupka”).
Oba rodzaje aktywności są typowym przejawem eksploracyjnego zachowania
myszy i pozwalają łatwo wychwycić ewentualne odchylenia od normy. Analizę danych
przeprowadziłem przy pomocy programu komputerowego Excel (Microsoft, USA) z
wykorzystaniem testu ANOVA.
34
3.10 Test na bieżni z przeszkodami
Podczas tego eksperymentu wykorzystałem ogółem 70 myszy ze wszystkich linii
mutantów. Test wykonywałem na bieżni wykonanej w warsztacie należącym do Instytutu
Maxa Plancka w Martinsried. W przeprowadzonych przeze mnie eksperymentach
wykorzystałem dwa rodzaje bieżni zbudowane z pręta z tworzywa sztucznego o
przekroju prostokątnym, grubości 2 cm i szerokości 2 lub 0,5 cm. Bieżnia ma długość 1
m i zaopatrzona jest w przeszkody o wysokości i szerokości 0,5 cm rozmieszczone w 10
cm odstępach. Podczas testu oba końce bieżni oparte są na krawędziach klatek, przy
czym jedna z klatek jest klatką „macierzystą” myszy, natomiast druga jest czysta i
wysypana świeżymi trocinami. Klatka macierzysta jest bodźcem zachęcającym mysz do
poruszania się po bieżni w jej kierunku. Klatki wraz z bieżnią ustawione są na stole w ten
sposób, aby bieżnia znajdowała się na wysokości około 0,5 m nad blatem stołu, co
zapobiega spontanicznemu zeskakiwaniu myszy z bieżni. Bieżnię czyściłem po
zakończeniu testu przez kolejne myszy, celem usunięcia bodźców zapachowych. Każda
mysz wykonywała test przez 5 kolejnych dni, przy czym jeden test składał się z 5
następujących po sobie biegów po bieżni, których uśredniona wartość dawała wynik z
jednego dnia. Parametrem mierzonym podczas tego eksperymentu była ilość ześlizgnięć
przednią lub tylną kończyną podczas poruszania się myszy po bieżni (ryc.12).
Ześlizgnięcia były liczone z jednej, widocznej dla obserwatora, strony. Dane
analizowałem przy pomocy programu komputerowego Excel z wykorzystaniem testu
ANOVA.
Ryc.12 Mysz podczas
wykonywania testu na bieżni z
przeszkodami. Na zdjęciu
widoczny jest ześlizg tylnej lewej
kończyny.
35
Materiał i metody
3.11 Test na równoważni
Podczas testu na równoważni zwierzęta umieszczałem na belce z tworzywa
sztucznego o średnicy 1 cm zamocowanej sztywno jednym końcem w statywie.
Zamocowany sztywno koniec był zakończony ekranem uniemożliwiającym myszy
poruszanie się w tę stronę. Podczas eksperymentu zwierzęta siedziały na belce zwrócone
głową w stronę ekranu (ryc.13).
Ryc.13 Mysz podczas
wykonywania testu na
równoważni.
Pod belką umieszczona była kuweta wypełniona trocinami, chroniącymi mysz
przed kontuzją po upadku z belki. Test polegał na mierzeniu czasu przez jaki mysz
potrafi utrzymać równowagę siedząc na belce, przy czym eksperyment przerywałem po
upływie 2 min. Podobnie jak w przypadku testu na bieżni eksperyment trwał przez 5
kolejnych dni z 5 następującymi po sobie powtórzeniami każdego dnia. W
eksperymencie tym wykorzystałem 22 myszy z linii L7Cre-2 x Calbtm.2. Analizę
otrzymanych danych przeprowadziłem przy pomocy programu Excel stosując zawarty w
nim test statystyczny ANOVA.
3.12 Badanie odruchów wzrokowych
Odruchy wzrokowe były badane u 21 myszy z linii L7Cre-2 x Calbtm.2. Wszystkie
eksperymenty zostały przeprowadzone w laboratorium prof. C.I. De Zeeuw w Instytucie
Neurobiologii, Erasmus Universiteit w Rotterdamie. Analiza odruchów wzrokowych:
optokinetycznego i przedsionkowo-wzrokowego polega na rejestracji zmian pola
36
elektromagnetycznego wywoływanych metalową spiralą wszczepioną pod spojówkę oka
u nasady mięśnia prostego bocznego. Zabiegi mikrochirurgiczne i przygotowanie
zwierząt do eksperymentu odbywało się w sposób podobny do procedury opisanej
wcześniej [49, 102, 185, 196]. Implantowana spirala posiadała średnicę zewnętrzną 0,5
mm i składała się z 40 zwojów wykonanych z izolowanego drutu mosiężnego o średnicy
25 µm i oporności 25-35 Ω. Bodźce optokinetyczne i przedsionkowe aplikowano przy
pomocy obrotowego stołu i bębna (Benedict, New York, USA). Oba bodźce miały
charakter sinusoidalny o częstotliwości od 0,1 – 1,6 Hz i szczytowej prędkości kątowej
od 3 – 96o/s. i stosowano je zarówno w ciemności jak i przy standardowych warunkach
świetlnych. Analizowanymi parametrami były amplituda oraz przesunięcie fazowe
opisujące położenie gałek ocznych w stosunku do pozycji bębna. Oba te parametry były
analizowane przy pomocy programu Ced-Anal. Podczas eksperymentów wykorzystano
11 zwierząt z grupy eksperymentalnej (REK) oraz 10 zwierząt z grupy kontrolnej (K).
3.13 Eksperymenty elektrofizjologiczne i analiza LTD
Wszystkie eksperymenty badające elektrofizjologiczne funkcje komórek Purkinjego
przeprowadzone zostały w Instytucie Fizjologii w Ludwig-Maximilians Universität w
Monachium. Rejestracje aktywności elektrycznej prowadzono w skrawkach o grubości
300 µm. Po anestezji CO2 zwierzęta były dekapitowane, po czym pobrany móżdżek
umieszczano w schłodzonym, syntetycznym płynie mózgowo-rdzeniowym o składzie:
125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 2 mM CaCl, 1 mM MgCl2, 1,25 mM NaH2PO4, 26 mM
NaHCO3 i 20 mM glukozy, przez który przepuszczano mieszaninę gazową zawierającą
95% O2 i 5%CO2. Skrawki wykonane z pobranego móżdżku przetrzymywano przed
rozpoczęciem eksperymentu najpierw przez 45-60 min w temperaturze 37oC, a następnie
do 8 godzin w temperaturze 25oC. Rejestrację wykonywano przy pomocy wzmacniaczy
EPC8 lub EPC9 (Heka, Lambrecht/Pfalz, Niemcy), a dane były rejestrowane przy
pomocy programu Pulse (Heka, Lambrecht/Pfalz, Niemcy). Elektrody szklane używane
do rejestracji, o oporności 2-4 MΩ, zostały wykonane ze szkła borowo-krzemowego
(Hilgenberg, Malsfeld, Niemcy). Przed eksperymentem elektrody pokrywano silikonem
(RTV 615, GE Silicons, Leverkusen, Niemcy), a do rejestracji napełniano r-rem
zawierającym 148 mM glukonatu potasu, 10 mM HEPES, 10 mM NaCl, 0,5 mM MgCl2,
4 mM Mg-ATP i 0,4 mM Na3-GTP, pH 7,3. Do analizy oscylacji Ca2+ do r-ru dodawano
37
Materiał i metody
100 µM indykatora Oregon green BAPTA-1 (Molecular Probes, Eugene, USA). Podczas
wszystkich eksperymentów skrawki były perfundowane syntetycznym płynem
mózgowo-rdzeniowym zawierającym 10 µM bikukuliny (Sigma, St.Louis, USA) z
dodatkiem mieszaniny gazowej zawierającej 95% O2 i 5%CO2. Stymulację synaptyczną
wykonywano przy pomocy standardowej pipety do „patch clamping” o oporze 1 MΩ,
wypełnionej 1 mM NaCl i umieszczonej w warstwie drobinowej. Amplituda impulsu
stymulującego trwającego 150 µs wynosiła 2-20 V podczas stymulacji włókien
równoległych i 20-55 V podczas stymulacji włókien pnących. Pobudzające prądy
postsynaptyczne (EPSCs), związane z włóknami równoległymi, rozpoznawane były na
podstawie cech charakterystycznych, jakimi są stopniowo narastająca amplituda
odpowiedzi i hamowanie przy nakładaniu się impulsów, natomiast identyfikacja
odpowiedzi pochodzącej z włókien pnących opierała się na typowej dla nich odpowiedzi
zgodnej z regułą „wszystko albo nic” oraz hamowaniu po nałożeniu się impulsów [104,
105]. Próg pobudliwości dla włókien pnących ustalano poprzez podnoszenie
intensywności bodźca aplikowanego z elektrody szklanej stymulującej aż do momentu
uzyskania charakterystycznej odpowiedzi. Włókna równoległe były stymulowane z
częstotliwością 0,2 Hz, a pobudzające prądy postsynaptyczne (EPSCs) były rejestrowane
przy ustalonym napięciu (voltage clamping) aż do uzyskania stabilnej amplitudy
wyjściowej przez okres co najmniej 10 min. W celu wywołania hamowania
długoterminowego (LTD – ang. long-time depression) natężenie bodźca podnoszono do
wartości przekraczającej o co najmniej 20% próg pobudliwości ustalony dla włókien
pnących, a następnie aplikowano 240 bodźców z częstotliwością 1 Hz, w połączeniu z
impulsem depolaryzującym – 200 ms, -60 do 0 mV. Po nałożeniu bodźców natężenie
impulsu obniżano do wartości wyjściowej, a rejestracja EPSCs pochodzących od włókien
równoległych kontynuowano przez następne 60 min. Pasywne właściwości błony
komórkowej
komórek
Purkinjego
kontrolowano
hiperpolaryzujących o napięciu 3 mV.
przy
zastosowaniu
impulsów
Opór szeregowy był monitorowany i
utrzymywany na poziomie ~10-20 MΩ i tylko komórki spełniające to kryterium były
uwzględniane w dalszej analizie. Temperatura r-ru, w którym zanurzone były skrawki,
utrzymywana była na poziomie 32oC.
3.14 Pomiary wewnątrzkomórkowego stężenia jonów Ca2+
38
Analizę oscylacji stężenia Ca2+ wykonywano przy pomocy konfokalnego
mikroskopu skaningowego Odyssey (Noran Instruments, Bicester, Wielka Brytania),
sprzężonego z mikroskopem Axioskop 2 (Zeiss, Thornwood, USA). Zmiany
fluorescencji
rejestrowano
z
częstotliwością 30 Hz przy pomocy programu
komputerowego Image-1 (Universal Imaging Corporation, West Chester, USA),
kontrolując jednocześnie aktywność badanych komórek metodą „patch clamping”.
Analiza otrzymanych danych była prowadzona przy pomocy zmodyfikowanego
oprogramowania bazującego na programie Labview (National Instruments, Austin,
USA). Wahania stężenia jonów Ca2+ w kolcach dendrytycznych rejestrowano przy
pomocy mikroskopu dwufotonowego zbudowanego na bazie systemu laserowego
Ti:sapphire (Tsunami and Millenia, Spectra Physics, Mountain View, USA) oraz
skaningowego systemu laserowego MRC 1024 (BioRad, Hercules, USA) sprzężonego z
mikroskopem BX50WI (Olympus Optical, Tokyo, Japonia). Opisany system
wykorzystywał wiązkę laserową u długości fali 790 nm z częstotliwością 80 MHz i
impulsem <100 femtosekund. Celem uzyskania wysokiej rozdzielczości czasowej,
fluorescencję rejestrowano metodą skanowania liniowego z częstotliwością 160 Hz w
przypadku zwierząt z grupy kontrolnej i 480 Hz w przypadku zwierząt z grupy
eksperymentalnej. Otrzymane wyniki analizowano przy pomocy oprogramowania
Labview (National Instruments, Austin, USA). Fluorescencja wywołana wahaniami
stężenia jonów wapniowych została wyrażona jako wzrost fluorescencji podzielony
przez fluorescencję przed zastosowaniem bodźca (∆F/F0). Zmiany fluorescencji
analizowano z zastosowaniem programu komputerowego Igor Pro (Wavemetrics, Lake
Oswego, USA) oraz Origin (Microcal, Northampton, USA)
39
4. Omówienie wyników
4.1 Modyfikacja genu kalbindyny przy pomocy sekwencji loxP – linia Calbtm.2
Pierwszym etapem prowadzącym do tkankowo specyficznego wyłączenia ekspresji
kabindyny D-28k było stworzenie lini myszy o zmodyfikowanym genie kalbindyny.
Modyfikacja zakładała wprowadzenie sekwencji loxP rozmieszczonych 5’ oraz 3’ w
stosunku do pierwszego eksonu kodującego to białko. Obie sekwencje loxP
wprowadziłem w sposób nie zaburzający ekspresji genu kalbindyny.
4.1.1 Konstrukcja wektora Calbtm.2
Strategia przygotowania wektora DNA wprowadzającego sekwencje loxP do locus
chromosomalnego kalbindyny D-28k została przedstawiona na rycinie 14a.
Ryc.14 Przygotowanie wektora Calbtm.2 wykorzystanego do
stworzenia linii myszy Calbtm.2. a. Kolejne etapy klonowania DNA.
Neo – część kasety selekcyjnej kodująca oporność na neomycynę, TK
– część kasety selekcyjnej kodująca kinazę tymidynową. Symbol
►oznacza sekwencję loxP, symbol → oznacza primer, Cb – pierwszy
kodujący ekson kalbindyny D-28k. b. Analiza DNA wyizolowanego z
komórek pnia po elektroporacji wektorem Calbtm.2.
Materiałem wyjściowym do
konstrukcji wektora
Calbtm.2
był wycinek
genomowego DNA myszy, zawierający fragment promotorowy oraz dwa pierwsze
eksony genu kalbindyny. Pierwszym etapem konstrukcji wektora DNA było
wprowadzenie kasety selekcyjnej „NeoTK”. Wprowadzona kaseta powoduje z jednej
strony ekspresję genu oporności na neomycynę (sekwencja Neo) i pozwala na pozytywną
41
Omówienie wyników
selekcję komórek pnia poprzez dodanie do medium hodowlanego neomycyny. Z drugiej
strony pozwala na negatywną selekcję komórek zawierających sekwencję TK.
Sekwencja ta koduje kinazę tymidynową, która prowadzi do śmierci wytwarzających ją
komórek hodowanych w obecności preparatu antywirusowego – gancyclovir. Kaseta
selekcyjna została wprowadzona wraz z dwoma sekwencjami loxP umieszczonymi na jej
końcach. Umożliwiło to usunięcie kasety z komórek pnia przed ich iniekcją do
blastocyst. W następnym etapie konstrukcji wektora wprowadziłem trzecią sekwencję
loxP po stronie 5’ w stosunku do pierwszego eksonu kalbindyny. Rozmieszczenie i
kierunek ułożenia sekwencji loxP został sprawdzony poprzez sekwencjonowanie
kolejnych fragmentów wektora przy użyciu specyficznych primerów zaznaczonych na
rycinie 14a. Analiza DNA potwierdziła zamierzone rozmieszczenie wprowadzonych
sekwencji
loxP
wprowadzonych
oraz
kasety
sekwencji
selekcyjnej.
loxP
Celem sprawdzenia
przeprowadziłem
eksperyment
funkcjonalności
polegający
na
rekombinacji otrzymanego wektora. W tym celu do bakterii E. coli charakteryzujących
się endogenną ekspresją rekombinazy Cre (E294-Cre) wprowadziłem plazmid
zawierający skonstruowany przeze mnie wektor. Analiza DNA wyizolowanego z bakterii
E294-Cre wykazała obecność dwóch fragmentów DNA o długości około 14,5 kb i 9,5
kb. Dłuższy fragment reprezentuje DNA wektora niezrekombinowanego, natomiast
krótszy DNA wektora pozbawionego fragmentu zawartego pomiędzy najbardziej
zewnętrznymi sekwencjami loxP (ryc.15).
Ryc.15 Test zdolności rekombinacyjnej wektora DNA, wykorzystanego przy tworzeniu linii Calbtm.2. Rycina
przedstawia fragment żelu agarozowego, zawierającego DNA plazmidowe wyizolowane z bakterii E294-Cre (1-12).
K – wektor DNA nie poddany rekombinacji. Przed rozdzieleniem na żelu DNA trawiono endonukleazą SalI.
Wprowadzone sekwencje loxP pozwalają więc na skuteczną rekombinację wektora
Calbtm.2. Pozostałości niezrekombinowanego DNA, widoczne na żelu, są wynikiem
zmniejszonej aktywności rekombinazy Cre podczas inkubacji bakterii w temperaturze
42
wyższej niż 30oC. Z drugiej jednak strony, inkubacja bakterii w tej temperaturze hamuje
w bardzo znacznym stopniu ich wzrost, stąd też zastosowana przeze mnie temperatura
była kompromisem pomiędzy optimum aktywności rekombinazy Cre, a temperaturą
optymalną do namnażania się bakterii.
4.1.2 Przygotowanie komórek pnia
Następny etap eksperymentalny polegał na zmodyfikowaniu genu kalbindyny w
komórkach pnia poprzez zastąpienie jego fragmentu wektorem Calbtm.2. W tym celu
wprowadziłem DNA wektorowe do komórek pnia R1, pochodzących od myszy 129SV,
poprzez ich elektroporację w zawiesinie zawierającej zmodyfikowane DNA. Po tym
zabiegu komórki pnia hodowałem w medium zawierającym neomycynę, a przeżywające
kolonie analizowałem pod kątem zawartego w nich materiału genetycznego.
Wyizolowane DNA trawiłem endonukleazą Hind III, a po rozdziale elektroforetycznym
na żelu agarozowym i przeniesieniu na membranę, hybrydyzowałem z wyznakowaną
radioaktywnie sondą. Użyta do hybrydyzacji sonda była komplementarna do sekwencji
zaznaczonej na rycinie 14. Charakterystyczny rozkład prążków (ryc.14b) świadczących o
homologicznej inkorporacji wektorowego DNA występował w analizowanych klonach
komórek pnia z częstotliwością 1:50. Dwa spośród pozytywnych klonów otrzymanych w
wyniku pierwszej selekcji wybrałem do następnej elektroporacji. Jej celem było
wprowadzenie do komórek pnia ekspresji rekombinazy Cre i wycięcie kasety
selekcyjnej. W tym celu transformowałem komórki pnia plazmidem pMCCre, a
następnie hodowałem je w medium zawierającym gancyclovir. Rekombinacja, jaka
zaszła w komórkach pnia pod wpływem rekombinazy Cre, doprowadziła do powstania
trzech możliwych konfiguracji przedstawionych na rycinie 16. Do iniekcji blastocyst
nadawały się jednak tylko komórki pnia z wariantem
III (ryc.16b), zawierającym
pierwszy ekson kalbindyny wraz z towarzyszącymi mu sekwencjami loxP.
Należy w tym miejscu zauważyć, iż częstotliwość występowania rekombinacji
pomiędzy dwoma sekwencjami loxP jest odwrotnie proporcjonalna do długości łańcucha
DNA znajdującego się pomiędzy nimi. Stąd też prawdopodobieństwo uzyskania tego
właśnie wariantu było najmniejsze. DNA klonów, które przeżyły ten etap selekcji,
analizowałem więc pod względem braku kasety selekcyjnej oraz obecności pierwszego
43
Omówienie wyników
eksonu genu kalbindyny, hybrydyzując wyizolowane DNA z sondą zaznaczoną na
rycinie 16b.
Ryc.16 Schemat rekombinacji jaka zaszła pod wpływem ekspresji wektora pMCCre. a. Warianty rekombinacji
powstałe pod wpływem rekombinazy Cre, b. Szczególy budowy allelu Calbtm.2. Symbol ►oznacza sekwencję loxP.
Klony spełniające powyższe kryteria (n=11), zostały użyte do iniekcji blastocyst
pochodzących od myszy C57BL/6 (B6). Uzyskane chimery krzyżowałem z myszami B6
celem uzyskania pokolenia F1.
Poprzez wprowadzenia sekwencji loxP do sekwencji kodujących kalbindynę
stworzyłem linię myszy zwaną w dalszej części Calbtm.2 (ang. calbindin transgenic
mouse 2). Samice i samce pokolenia F1, będące heterozygotami dla zmutowanego genu
kalbindyny (Calbtm.2/+), krzyżowałem między sobą, w wyniku czego otrzymałem
pokolenie F2, zawierające wszystkie możliwe genotypy pojawiające się zgodnie z
regułami Mendla (ryc.17).
44
Ryc.17 Schemat krzyżówek w obrębie linii
Calbtm2 oraz powstałych w ich wyniku genotypów
Chcąc wykluczyć zafałszowanie wyników uzyskanych w dalszych eksperymentach,
koniecznym było sprawdzenia, czy wprowadzenie sekwencji loxP nie spowodowało
zmian ekspresji kalbindyny lub też nie doprowadziło to zmian na poziomie
behawioralnym i motorycznym. Dalsza analiza tej linii myszy obejmowała więc
ekspresję kalbindyny oraz testy behawioralne i sprawnościowe.
4.1.3 Ocena ekspresji kalbindyny
Poziom ekspresji kalbindyny analizowałem metodą Western blot, oceniając
intensywność reakcji immunohistochemicznej we frakcjach białkowych pochodzących
od
zwierząt
(Calb
tm.2
/Calb
homozygotycznych
dla
zmodyfikowanego
allelu
kalbindyny
tm.2
) (ryc.18).
Ryc.18 Analiza poziomu ekspresji kalbindyny D-28k u zwierząt z linii Calbtm.2 przy pomocy metody Western blot.
Frakcje białkowe stanowiące grupę kontrolną pochodziły od zwierząt o genotypie
dzikim (+/+). Porównanie natężenia reakcji immunohistochemicznej w ekstraktach
45
Omówienie wyników
białkowych pochodzących z móżdżku, kory mózgu i hipokampa nie wykazało różnic
świadczących o zmianie poziomu ekspresji kalbindyny w wyniku wprowadzenia
sekwencji loxP do genu kalbindyny. Podobny wynik otrzymałem analizując zawartość i
rozmieszczenie kalbindyny w komórkach Purkinjego kory móżdżku (ryc.19).
Ryc.19 Immunohistochemiczna analiza ekspresji kalbindyny D-28k w komórkach Purkinjego myszy pochodzodzących
z linii Calbtm.2. Bar = 50 µm
Barwienie immunohistochemiczne skrawków kory móżdżku pochodzących od
myszy Calbtm.2/Calbtm.2 nie wykazało żadnych różnic w porównaniu do podobnych
skrawków pochodzących od osobników dzikich (+/+).
4.1.4 Analiza behawioralna i testy sprawnościowe
Ponieważ wpływ kalbindyny na zachowanie i motorykę jest centralnym punktem
zainteresowania przeprowadzonych przeze mnie eksperymentów, niezbędna była ocena
behawioralna i sprawnościowa mutantów należących do linii wyjściowych: Calbtm.2 i
L7Cre. Zachowanie osobników o genotypie Calbtm.2/Calbtm.2 porównywałem z
zachowaniem osobników z grupy kontrolnej (+/+) podczas swobodnej eksploracji
nieznanego im otoczenia w warunkach testu otwartego pola (ryc.20).
46
Ryc.20 Graficzna analiza zachowania myszy z linii Calbtm.2 podczas testu otwartego pola. a. Aktywność pozioma,
b.Aktywność pionowa. Grupa +/+ n=10, grupa Calbttm2/Calbtm.2 n=10 Wykresy przedstawiają wartości średnie +/- S.D.
Żaden z analizowanych parametrów nie wykazywał statystycznie znamiennych
różnic przy porównaniu wyników uzyskanych przez zwierzęta z grupy eksperymentalnej
i kontrolnej. Rycina 20 pokazuje analizę dwóch wybranych przeze mnie parametrów:
aktywności poziomej i pionowej, które obrazują zachowanie eksploracyjne myszy w
nieznanym im otoczeniu. Aktywność pozioma rozumiana jest w tym przypadku jako
całkowity dystans pokonywany przez mysz podczas przeszukiwania powierzchni klatki,
przy czym wyniki przedstawione są jako wartości średnie przeliczone na każdą kolejną
minutę testu. Aktywność pionowa natomiast obrazuje typowe zachowanie myszy
podczas eksploracji, polegające na podnoszeniu się na tylnych kończynach. Każde
47
Omówienie wyników
podniesienie ciała do pozycji pionowej jest rejestrowane przez górny czujnik (por.
Materiał i metody). Podobnie jak w przypadku poprzedniego parametru, uśrednione
wyniki przedstawiłem w przeliczeniu na każdą kolejną minutę testu. Przedstawione na
wykresie krzywe reprezentują typowe przebiegi, obrazujące spadek aktywności
eksploracyjnej wraz z upływem czasu podczas wykonywania testu.
Sprawność motoryczną myszy z linii Calbtm.2 badałem na bieżni z przeszkodami,
porównując wyniki uzyskane przez zwierzęta o genotypie Calbtm.2/Calbtm.2 ze
zwierzętami o genotypie dzikim (+/+) (ryc.21).
Ryc.21 Graficzna analiza wyników testu na bieżni z przeszkodami, przeprowadzonego ze zwierzętami z linii Calbtm.2.
Grupa +/+ n=10, grupa Calbttm2/Calbtm.2 n=10. Wykres przedstawia wartości średnie +/- S.D.
Test prowadziłem przez pięć kolejnych dni zgodnie ze schematem opisanym w
rozdziale „Materiał i metody”. Analiza statystyczna wyników nie wykazała różnic
pomiędzy osobnikami z grupy eksperymentalnej i kontrolnej na żadnym z etapów testu.
4.2 Wprowadzenie ekspresji rekombinazy Cre do komórek Purkinjego – linia
L7Cre
48
Kolejnym krokiem, przygotowującym tkankowo-specyficzne wyłączenia genu
kalbindyny, było stworzenie linii myszy transgenicznych z ekspresją rekombinazy Cre
ograniczoną do komórek Purkinjego móżdżku. W tym celu postanowiłem wykorzystać
sekwencje regulacyjne genu kodującego białko pcp-2. Wektor DNA zawierający
sekwencję kodującą rekombinazę Cre (cDNA) wprowadziłem do genomu na zasadzie
integracji przypadkowej, chcąc uniknąć wyłączenia endogennej ekspresji białka pcp-2.
4.2.1 Konstrukcja wektora L7Cre
Celem uzyskania ekspresji rekombinazy Cre zgodnej ze schematem opisanym dla
bialka pcp-2 wykorzystałem „minigen” L7∆AUG, składający się z czterech eksonów
oraz sekwencji regulacyjnych obecnych w odcinku 5’ przed pierwszym eksonem (por.
Materiał i metody). Do eksonu czwartego wprowadziłem cDNA kodujące rekombinazę
Cre, otrzymując w ten sposób wektor L7Cre (ryc.22).
Ryc.22 Budowa wektora L7Cre zastosowanego do stworzenia linii L7Cre. 1, 2, 3, 4, oznaczają eksony kodujące
białko pcp-2.
4.2.2 Przygotowanie komórek pnia
Wektor L7Cre wprowadziłem za pomocą elektroporacji do komórek pnia R1,
pochodzących podobnie jak w przypadku linii Calbtm.2, od myszy 129SV. Ponieważ
wektor L7Cre nie posiada kasety selekcyjnej, do zawiesiny elektroporacyjnej dodałem
plazmid zawierający cDNA kodujące oporność na neomycynę. Zabieg ten pozwolił mi
na selekcję neomycyną ze względu na wysokie prawdopodobieństwo jednoczesnego
wprowadzenia wektora L7Cre i plazmidu kodującego oporność na neomycynę. Z kolonii
komórek pnia przeżywających selekcję izolowałem DNA, a następnie po trawieniu
endonukleazą BamH I, rozdziale na żelu agarozowym i przeniesieniu na membranę,
49
Omówienie wyników
hybrydyzowałem z sondą radioaktywną komplementarną do cDNA rekombinazy Cre.
Spośród dziewięciu pozytywnych klonów wybrałem trzy: L7Cre-2, L7Cre-8 i L7Cre-12,
które następnie wykorzystałem do iniekcji blastocyst pochodzących od myszy B6.
Wszystkie trzy klony dały początek liniom transgenicznym. Uzyskane chimery
krzyżowałem z myszami B6 w celu uzyskania pokolenia F1, którego dalsze krzyżówki
umożliwiły otrzymanie zwierząt homozygotycznych L7Cre/L7Cre w pokoleniu F2
(ryc.23).
Ryc.23 Schemat krzyżówek w obrębie linii L7Cre
oraz powstałych w ich wyniku genotypów
Wszystkie oczekiwane genotypy pojawiały się w następnych pokoleniach zgodnie z
regułami Mendla. Do dalszych eksperymentów i krzyżówek z linią Calbtm.2 użyłem linii
L7Cre-2. Dalsza analizy genetyczna tej linii ujawniła wielokrotną integrację
transgenicznego DNA (ryc.24).
Ryc.24 Analiza genetyczna linii L7Cre-2 metodą “Southern blot”. DNA
hybrydyzowałem z sondą zaznaczoną na rycinie 22. TG – prążki
pochodzenia transgenicznego, WT – prążek należący do endogennego allelu
genu pcp-2.
4.2.3 Ocena ekspresji rekombinazy Cre
Celem dalszego
cyklu
eksperymentów
było
sprawdzenie,
czy
ekspresja
rekombinazy Cre jest zgodna z oczekiwanym schematem. W pierwszej kolejności
50
wykonałem barwienie immunohistochemiczne skrawków móżdżku, przy pomocy
przeciwciał przeciwko rekombinazie Cre (ryc.25a,f). Barwienie tkanki pochodzącej od
zwierząt homozygotycznych L7Cre-2/L7Cre-2, wykazało obecność pozytywnej reakcji
immunohistochemicznej w komórkach Purkinjego, świadczącej o ekspresji rekombinazy
Cre w tych neuronach. Jako kontrolę użyłem skrawki móżdżku pochodzące od zwierząt
+/+ i barwiłem je jednocześnie ze skrawkami pochodzącymi od zwierząt
transgenicznych. W tym przypadku jednak barwienie nie wykazało pozytywnej reakcji
histochemicznej, co świadczy o specyficznej reakcji immunohistochemicznej w
komórkach Purkinjego. Lokalizacja reakcji barwnej wskazuje na obecność rekombinazy
Cre na obszarze nukleoplazmy.
Ryc.25 Analiza immunohistochemiczna komórek Purkinjego należących do zwierząt z linii L7Cre-2. a+f. Barwienie
przeciwciałami przeciwko rekombinazie Cre. Strzałki wskazują pozytywną reakcję w jądrach komórek Purkinjego.
b+g. barwienie przeciwciałami przeciwko kalbindinie D-28k, c+h – barwienie przeciwciałami przeciwko PEP-19, d+i
barwienie przeciwciałami przeciwko PKC-γ, e+j – barwienie przeciwciałami przeciwko GAD. Bar = 20 µm.
Ponieważ istniała teoretyczna możliwość, iż wprowadzenie ekspresji obcego białka
do komórek Purkinjego mogłoby mieć wpływ na morfologie i fizjologię tych neuronów,
wykonałem dodatkowe barwienia immunohistochemiczne kory móżdżku (ryc.25). Do
typowych markerów pozwalających ocenić morfologię komórek Purkinjego należą:
kalbindyna (Cb-28k), polipeptyd PEP-19, kinaza proteinowa C-gamma (PKC-γ) oraz
51
Omówienie wyników
dekarboksylaza kwasu glutaminowego (GAD). Analiza skrawków osobników L7-Cre2/L7Cre-2, barwionych przeciwciałami przeciwko wymienionym markerom, nie
wykazała żadnych różnic w morfologii komórek Purkinjego, przy porównaniu ich z
komórkami pochodzącymi od osobników dzikich.
Kolejnym
etapem
eksperymentalnym
było
sprawdzenie
funkcjonalności
rekombinazy Cre wytwarzanej przez komórki Purkinjego. W tym celu myszy linii
L7Cre-2, krzyżowałem z myszami tzw. linii indykatorowej GtROSA26 (por. Materiał i
metody). Wprowadzenie ekspresji rekombinazy Cre do komórek myszy linii GtROSA26
powoduje, poprzez rekombinację, uruchomienie ekspresji ß-galaktozydazy, co można
wykazać za pomocą barwienia X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-ß-D-galaktozydazą).
Niebieska reakcja barwna w preparacie mikroskopowym pokazuje, w których
komórkach doszło do rekombinacji (ryc.26). Do analizy rekombinacji użyłem tkanek
zwierząt heterozygotycznych pod względem obu alleli L7Cre-2/+;GtROSA26/+. Jako
kontrola posłużyły mi tkanki pochodzące od zwierząt tej linii myszy, nie posiadających
allelu rekombinazy Cre: GtROSA26/+. W skrawkach móżdżku barwionych metodą X-gal
i pochodzących od zwierząt o genotypie L7Cre-2/+;GtROSA26/+ widoczne jest
wyraźnie niebieskie zabarwienie komórek Purkinjego, świadczące o rekombinacji
materiału genetycznego zawartego w tych neuronach i uruchomieniu tym samym
ekspresji ß-galaktozydazy. Na rycinie 26d widoczne jest niebieskie zabarwienie pod
postacią drobnych punktów, występujących na terenie warstwy drobinowej. Nie jest ono
jednak wynikiem rekombinacji, która miała miejsce w tym obszarze kory móżdżku, lecz
spowodowane jest transportem produktu reakcji barwnej do dendrytów komórek
Purkinjego.
52
Ryc.26 Ekspresja ß-galaktozydazy u zwierząt z linii indykatorowej GtROSA26 po ich skrzyżowaniu z linią L7Cre-2.
Barwienie metodą X-gal. Niebieskie zabarwienie wskazuje na rekombinację spowodowaną rekombinazą Cre. a.
Przekrój strzałkowy przez móżdżek dorosłej myszy. Przedstawiony przekrój został komputerowo zmontowany z kilku
zdjęć tego samego preparatu, bar = 1 mm. b-d. Kolejne powiększenia zaznaczonych fragmentów kory móżdżku. b –
bar = 100 µm, c – bar = 50 µm, d. Strzałki wskazują niebieskie zabarwienie na terenie dendrytów spowodowane
transportem produktu reakcji barwnej, bar = 20 µm. e-m. Niebiesko wybarwiona ß-galaktozydaza (strzałki) w
komórkach: e – kory ciemieniowej, f – prążkowia, g – dolnej oliwki, h – jąder głębokich móżdżku, i – zakrętu
zębatego, j – pola CA1 hipokampa, k – siatkówki, l – warstwy korowej nerki m – ß-galaktozydaza w komórkach
Barwienie metodą X-gal przeprowadziłem również w skrawkach kory móżdżku
Purkinjego w 6-tym dniu po urodzeniu. e-j, l - bar = 50 µm, k - bar = 25 µm, m – bar = 10 µm.
Barwienie metodą X-gal przeprowadziłem również w skrawkach kory móżdżku
pochodzących od osobników L7Cre-2/+;GtROSA26/+, znajdujących się na różnych
etapach rozwoju postnatalnego. Eksperyment ten pozwolił mi stwierdzić, iż pierwsze
oznaki rekombinacji zachodzącej w komórkach Purkinjego pojawiają się około 6-go dnia
po urodzeniu i nasilają się aż do około 3-go tygodnia życia (ryc.26m). Chcąc ocenić
tkankową specyficzność rekombinacji spowodowanej ekspresją rekombinazy Cre
analizowałem również inne regiony mózgowia barwione metodą X-gal. Z punktu
widzenia całości eksperymentu, szczególnie ważne były regiony zaangażowane w
53
Omówienie wyników
procesy koordynacji ruchowej i uczenia, charakteryzujące się jednocześnie ekspresją
kalbindyny. Rekombinacja i wyłączenie ekspresji tego białka w tych regionach, mogłoby
doprowadzić do zafałszowania przyszłych wyników. Analizie histologicznej poddałem
więc tkanki barwione metodą X-gal pochodzące z okolicy ciemieniowej kory mózgu,
prążkowia, jąder dolnej oliwki, głębokich jąder móżdżku, pola CA1 hipokampa oraz
zakrętu
zębatego
(ryc.26e-m).
We
wszystkich
wymienionych
strukturach
zaobserwowałem jedynie bardzo nieliczne niebiesko zabarwione komórki, co świadczy o
bardzo znikomej rekombinacji ektopowej, nie mogącej mieć wpływu na końcowej
wyniki eksperymentu. Niewielką ilość pozytywnie zabarwionych komórek stwierdziłem
również w warstwie korowej nerki (ryc.26l). Białko pcp-2, którego transkrypcyjne
elementy regulacyjne wykorzystałem do ekspresji rekombinazy Cre, występuje również
w komórkach dwubiegunowych siatkówki. Dlatego też do analizy metodą X-gal
włączyłem również preparaty pochodzące z tej struktury OUN. Wbrew oczekiwaniom
tylko bardzo nieliczne niebiesko zabarwione komórki udało mi się zaobserwować w
warstwie jądrowej wewnętrznej, miejscu lokalizacji komórek dwubiegunowych
(ryc.26k). Brak zjawiska rekombinacji w siatkówce jest jednak bez znaczenia w
przypadku wykonywanych przeze mnie badań.
4.2.4 Analiza behawioralna i testy sprawnościowe
Wprowadzenie ekspresji rekombinazy Cre do komórek Purkinjego mogło
teoretycznie doprowadzić do niezamierzonych zmian w funkcjonowaniu tych neuronów,
które mogłyby mieć wpływ na parametry związane z zachowaniem i motoryką myszy z
linii L7Cre-2. Chcąc wykluczyć taką ewentualność i jej wpływ na wyniki dalszych
eksperymentów, myszy linii L7Cre-2 poddałem tym samym testom, jak to miało miejsce
w
przypadku
linii
Calbtm.2.
Grupę
eksperymentalną
stanowiły
osobniki
homozygotyczne pod względem allelu L7Cre-2, natomiast grupę kontrolną stanowiły
myszy o genotypie dzikim, pochodzące z tej samej linii.
54
Ryc.27 Graficzna analiza zachowania myszy z linii L7Cre-2 podczas testu otwartego pola. a. Aktywność pozioma,
b.Aktywność pionowa. Grupa +/+ n=3, grupa L7Cre-2/L7Cre-2 n=3. Wykresy przedstawiają wartości średnie +/- S.D.
W przypadku testu otwartego pola analizowałem ponownie aktywność poziomą,
której parametrem był dystans pokonywany przez zwierzęta, oraz aktywność pionową
wyrażoną podnoszeniem się na tylnych kończynach (ryc.27). Sprawność motoryczną
myszy z linii L7Cre-2 badałem przy pomocy bieżni z przeszkodami według schematu
opisanego w rozdziale „Materiał i metody”. Podobnie jak w przypadku linii Calbtm.2,
analiza statystyczna wyników uzyskanych na podstawie przeprowadzonych testów, nie
ujawniła znamiennych różnic pomiędzy osobnikami o genotypie L7Cre-2/L7Cre-2, a
osobnikami o genotypie dzikim (ryc.28).
55
Omówienie wyników
Ryc.28 Graficzna analiza wyników testu na bieżni z przeszkodami, przeprowadzonego ze zwierzętami z linii
L7Cre-2. Grupa +/+ n=3, grupa L7Cre-2/L7Cre-2 n=3. Wykres przedstawia wartości średnie +/- S.D.
4.3 Wyłączenie ekspresji kalbindyny w komórkach Purkinjego – linia L7 x
Calbtm.2
Następnym etapem eksperymentalnym było skrzyżowanie linii Calbtm.2 z linią
L7Cre-2, celem tkankowo specyficznej rekombinacji genu kalbindyny D-28k i tym
56
samym wyłączenia ekspresji tego białka w komórkach Purkinjego kory móżdżku
(ryc.29).
Ryc.29 Schemat rekombinacji allelu Calbtm.2 po krzyżówce z linią L7Cre-2. Symbol ►oznacza sekwencję loxP.
4.3.1 Krzyżówka linii Calbtm.2 i L7Cre-2 – analiza genetyczna
Do skrzyżowania linii Calbtm.2 i L7Cre-2 użyłem zwierząt homozygotycznych pod
względem allelu Calbtm.2 (Calbtm.2/Calbtm.2) oraz allelu L7Cre-2 (L7Cre-2/L7Cre-2). W
wyniku tej krzyżówki powstała
nowa linia myszy nazywana dalej L7 x Calbtm.2.
Podwójne heterozygoty otrzymane w pokoleniu F1 (Calbtm.2/+; L7Cre-2/+) krzyżowałem
dalej otrzymując wszystkie możliwe genotypy zgodnie z regułami Mendla (ryc.30).
W celu uproszczenia dalszego opisu eksperymentów, wśród otrzymanych zwierząt
z linii L7 x Calbtm.2 wyróżniłem dwie grupy: kontrolną (K) oraz eksperymentalną
(EXP). W skład grupy kontrolnej weszły wszystkie zwierzęta, u których nie mogło dojść
do rekombinacji sekwencji kodujących kalbindynę, gdyż ich genom nie zawierał
jednocześnie allelu Calbtm.2 i allelu L7Cre-2. Na rycinie 30 są one oznaczone jako
prostokąty białe. W grupie eksperymentalnej znalazły się zwierzęta homozygotyczne pod
względem allelu Calbtm.2 posiadające jednocześnie w swoim genomie jeden lub dwa
allele L7Cre-2. Na rycinie 30 oznaczone je jako prostokąty szare. Prostokąty czarne
reprezentują zwierzęta o genotypach niewykorzystywanych do dalszej analizy.
57
Omówienie wyników
Ryc.30 Schemat krzyżówek, które doprowadziły do powstania linii L7 x Calbtm.2 z zaznaczeniem wszystkich
otrzymanych genotypów. Białe prostokąty oznaczają zwierzęta z grupy kontrolnej, szare prostokąty oznaczają
zwierzęta z grupy eksperymentalnej, czarne prostokąty oznaczają zwierzęta wykorzystane do dalszych
krzyżówek.
4.3.2 Ocena rekombinacji allelu Calbtm.2 w komórkach Purkinjego
58
Pierwszym etapem analizy efektów rekombinacji allelu Calbtm.2 na ekspresję
kalbindyny D-28k, była ocena transkrybowanego mRNA metodą RT-PCR (ryc.31).
Ryc.31 Analiza ekspresji kalbindyny D-28k u zwierząt z linii L7 x Calbtm.2 metodą RT-PCR. EXP – mysz z
grupy eksperymentalnej, K – mysz z grupy kontrolnej, GAPDH - reakcja kontrolna.
W tym celu od osobników z grupy eksperymentalnej i kontrolnej pobrałem:
móżdżek, korę ciemieniową i hipokamp oraz wyizolowałem z tych tkanek RNA
całkowite. Następnie na matrycy zawartego w ekstraktach mRNA zsyntetyzowałem
metodą transkrypcji odwrotnej DNA kodujące (cDNA), które z kolei posłużyło mi jako
matryca do amplifikacji cDNA kodującego kalbindynę D-28k. Produkty reakcji PCR
analizowałem na żelu agarozowym, stosując jako kontrolę pozytywną cDNA
amplifikowane przy pomocy primerów specyficznych dla GAPDH (dehydrogenazy
aldehydu 3-fosfoglicerynowego). Porównanie produktów reakcji wykonanych na bazie
mRNA
pochodzącego
z
kory
ciemieniowej
i
hipokampa
zwierząt
grupy
eksperymentalnej (EXP) i kontrolnej (K) nie wykazało widocznych różnic ilościowych.
Natomiast amplifikacja cDNA pochodzącego z móżdżku myszy eksperymentalnych,
wykazała prawie zupełny brak produktu transkrypcji charakterystycznego dla kalbindyny
D-28k.
Kolejnym
eksperymentem,
rekombinacji allelu Calb
tm.2
jaki
wykonałem,
było
sprawdzenie
efektów
na poziomie translacji białka. Frakcje białkowe izolowałem z
móżdżku, kory ciemieniowej i hipokampa zwierząt grupy eksperymentalnej i kontrolnej,
a następnie analizowałem metodą Western blot (ryc.32).
59
Omówienie wyników
Ryc.32 Analiza ekspresji kalbindyny D-28k u zwierząt z linii L7 x Calbtm.2 metodą Western blot. EXP – mysz z grupy
eksperymentalnej, K – mysz z grupy kontrolnej.
Analiza ekstraktów białkowych otrzymanych z kory ciemieniowej i hipokampa nie
wykazała różnic w poziomie ekspresji kalbindyny D-28k przy porównaniu grupy
eksperymentalnej (EXP) i kontrolnej (K). Jednakże porównanie zawartości kalbindyny
D-28k we frakcjach białkowych pochodzących z móżdżku, ujawniło redukcję tego białka
w grupie eksperymentalnej do około 5% poziomu stwierdzonego w grupie kontrolnej.
W dalszej kolejności przeanalizowałem efekty rekombinacji na poziomie
komórkowym. W tym celu przeprowadziłem barwienie immunohistochemiczne w
skrawkach pochodzących od zwierząt z linii L7 x Calbtm. W pierwszej kolejności
analizowałem ekspresję kalbindyny w korze móżdżku. Barwienie przeciwciałami
skierowanymi przeciwko temu białku ujawniło niewielką ilość pozytywnie zabarwionych
komórek Purkinjego (ryc.33a,b). Chcąc dokładnie określić ilość tych neuronów, w
których nie doszło do wyłączenia ekspresji kalbindyny, porównałem ich liczbę z
całkowitą liczbą komórek Purkinjego. W tym celu skrawki kory móżdżku pochodzące od
homozygot Calbtm.2/Calbtm.2, posiadających jeden lub dwa allele L7Cre-2, barwiłem
przeciwciałami skierowanymi przeciwko kalbindynie oraz parwalbuminie (ryc.33c,d).
Pozwoliło mi to na uwidocznienie kalbindyny w komórkach, w których nie doszło do
wyłączenia ekspresji tego białka, oraz jednoczesną wizualizację wszystkich komórek
Purkinjego. Analiza otrzymanych wyników pokazała, iż w ponad 98% komórek
Purkinjego doszło do wyłączenia ekspresji kalbindyny D-28k poprzez rekombinację
allelu Calbtm.2, przy czym całkowita liczba tych neuronów nie uległa zmianie.
60
Ryc.33 Immunohistochemiczna analiza ekspresji kalbindyny D-28k w móżdżku myszy z linii L7 x Calbtm.2.
a+b. Immunohistochemiczne barwienie kalbindyny D-28k w korze móżdżku w grupie kontrolnej (a) i grupie
eksperymentalnej (b), bar = 20 µm. c+d. Kora móżdżku barwiona przeciwciałami przeciwko kalbindynie D-28k i
parwalbuminie, c – grupa kontrolna, d – grupa eksperymentalna, bar = 20 µm. e+f. Immunohistochemiczne
barwienie kalbindyny D-28k w jądrach głębokich móżdżku, e – grupa kontrolna, f – grupa eksperymentalna, bar
= 40 µm
Efekt wyłączenia ekspresji kalbindyny był również wyraźnie widoczny w innym
regionie móżdżku, a mianowicie w jego części podstawnej, gdzie zlokalizowane są jądra
głębokie móżdżku (ryc.33e,f). W okolicy tej znajdują się zakończenia aksonów komórek
Purkinjego, które tworzą synapsy na ciałach neuronów wchodzących w skład jąder
głębokich. Preparaty mikroskopowe tej części móżdżku pokazują jedynie bardzo
61
Omówienie wyników
nieliczne włókna wybarwione przeciwciałami skierowanymi przeciwko kalbindynie.
Pozostała w móżdżku zwierząt eksperymentalnych, niewielka ilość elementów
neuronalnych zawierających kalbindynę tłumaczy słaby pozytywny sygnał uzyskany
podczas analizy mRNA metodą RT-PCR i analizy ekspresji kalbindyny metodą Western
blot. Barwienie immunohistochemiczne kalbindyny D-28k przeprowadziłem również na
skrawkach pochodzących z innych okolic mózgowia, zaangażowanych w procesy
związane z koordynacją ruchową i pamięcią, charakteryzujących się jednoczesną
ekspresją kalbindyny. Do barwienia tego wybrałem: korę ciemieniową, hipokamp,
prążkowie i oliwkę dolną (ryc.34).
Ryc.34 Immunohistochemiczne barwienie
kalbindyny D-28k wybranych obszarach mózgowia
myszy z linii L7 x Calbtm.2. a+b. Kora
ciemieniowa, bar = 80 µm, c+d. Prążkowie, rejon
gałki bladej, bar = 20 µm, e+f. Oliwka dolna, bar =
20 µm. a+c+f – grupa kontrolna, b+d+f – grupa
k
t l
Szczegółowa analiza nie wykazała widocznych ubytków ekspresji kalbindyny w
tych strukturach, co potwierdziło specyficzność tkankową procesu rekombinacji.
Przeprowadziłem
również
dodatkową
analizę
immunohistochemiczną
komórek
Purkinjego pozbawionych kalbindyny chcąc sprawdzić, czy jej brak nie spowodował
zaburzenia ekspresji białek markerowych tych neuronów. W tym celu skrawki móżdżku
62
pochodzące od myszy z grupy kontrolnej (K) oraz grupy eksperymentalnej (EXP)
inkubowałem z przeciwciałami skierowanymi przeciwko: parwalbuminie, kalretyninie,
kinazie proteinowej C-gamma (PKCγ), polipeptydowi PEP-19 oraz dekarboksylazie
kwasu glutaminowego (GAD) (ryc.35).
Ryc.35 Analiza ekspresji białek markerowych w komórkach Purkinjego zwierząt z linii L7 x Calbtm.2. K – grupa
kontrolna, EXP – grupa eksperymentalna, bar = 25 µm
Porównanie reakcji immunochistochemicznych w komórkach Purkinjego obu grup
zwierząt nie wykazało różnic w ekspresji żadnego z analizowanych markerów.
4.3.3 Testy behawioralne i sprawnościowe
Opisane poniżej eksperymenty miały za zadanie zbadanie wpływu braku
kalbindyny w komórkach Purkinjego na zachowanie się mutantów podczas eksploracji
nowego środowiska oraz wychwycenie i analizę zaburzeń koordynacji ruchowej w
warunkach wymuszających adaptację motoryki do nieznanych wcześniej warunków.
Przeprowadzone testy miały też wykazać ewentualne różnice pomiędzy mutantami
tkankowo specyficznymi (linia L7 x Calbtm.2), a mutantami ogólnymi (linia CbKO).
4.3.3.1 Ocena zachowania eksploracyjnego – test otwartego pola
Obserwacja zwierząt linii L7 x Calbtm.2 znajdujących się w standardowych
warunkach hodowlanych nie ujawniła żadnych widocznych różnic w zachowaniu
pomiędzy zwierzętami, u których zaszła rekombinacja allelu Calbtm.2, a zwierzętami
kontrolnymi. W następnym etapie analizy linii L7 x Calbtm.2 zwierzęta z grupy
63
Omówienie wyników
eksperymentalnej i kontrolnej zostały poddane testowi otwartego pola w celu
sprawdzenia czy brak kalbindyny w komórkach Purkinjego zaburzył spontaniczne
zachowanie się myszy w nowym otoczeniu. W eksperymencie tym uczestniczyły
również myszy z linii mutantów ogólnych (CbKO), o genotypie Cb-/-, pozbawione
ekspresji kalbindyny w całym organizmie. Podobnie jak w przypadku linii Calbtm.2 i
L7Cre-2 do analizy wybrałem aktywność poziomą i aktywność pionową zwierząt.
Porównanie dystansu, jaki przebywały myszy z wszystkich trzech grup, nie ujawniło
statystycznie znamiennych różnic (ryc.36).
Ryc.36 Graficzna analiza całkowitego dystansu pokonywanego przez zwierzęta z linii L7 x Calbtm.2 i linii mutantów
ogólnych podczas testu otwartego pola. Cb-/- - grupa mutantów ogólnych (n=6), EXP – grupa eksperymentalna linii
L7 x Calbtm.2 (n=11), K – grupa kontrolna linii L7 x Calbtm.2 (n=9). Wykres przedstawia wartości średnie +/-S.D.
Odmienny wynik natomiast uzyskałem w przypadku aktywności pionowej myszy.
Analiza tego parametru wykazała, iż myszy z grupy eksperymentalnej linii L7xCalbtm.2
wykonywały znamiennie więcej podnoszeń na tylnych kończynach niż grupa mutantów
ogólnych. Wynik uzyskany przez mutanty tkankowo specyficzne nie różnił się od
wyniku grupy kontrolnej (ryc.37).
64
Ryc.37 Analiza aktywności pionowej myszy z linii L7 x Calbtm.2 i linii
mutantów ogólnych podczas testu otwartego pola. Cb-/- - grupa
mutantów ogólnych (n=6), EXP – grupa eksperymentalna linii L7 x
Calbtm.2 (n=11), K – grupa kontrolna linii L7 x Calbtm.2 (n=9). a.
Średnia liczba podnoszeń przeliczona na 1 minutę testu. b. Całkowita
liczba podnoszeń podczas całego testu. ' - p ≤ 5,77E –04. Wykresy
przedstawiają wartości średnie +/-S.D.
4.3.3.2 Analiza koordynacji ruchowej
Ze względu na powszechnie znaną rolę kory móżdżku w kontrolowaniu i integracji
funkcji motorycznych oraz dane eksperymentalne uzyskane na podstawie wcześniejszych
badań, prowadzone przeze mnie eksperymenty miały odpowiedzieć na pytanie, czy brak
kalbindyny w komórkach Purkinjego prowadzi do zaburzeń koordynacji ruchowej. W
celu wyjaśnienia tego problemu przeprowadziłem szereg testów, którym poddałem
zwierzęta z linii L7 x Calbtm.2 i linii CbKO. Pierwszym z nich był test na bieżni z
przeszkodami przeprowadzony w sposób opisany szczegółowo w rozdziale „Materiał i
metody” (ryc.38).
65
Omówienie wyników
Ryc.38 Graficzna analiza wyników testu na bieżni z przeszkodami. Cb-/- - linia mutantów ogólnych (n=6),
EXP – grupa eksperxmentalna linii L7 x Calbtm.2 (n=20), K – grupa kontrolna linii L7 x Calbtm.2 (n=19). '
- p ≤ 2,63E-03, ' ' - p ≤ 3,17E-06. Wykres przedstawia wartości średnie +/- S.D.
Myszy, u których doszło do rekombinacji allelu Calbtm.2, podczas wszystkich pięciu
dni testu robiły około trzykrotnie więcej błędów (ześlizgnięć) niż myszy z grupy
kontrolnej. Największą jednak ilość błędów obserwowałem w grupie mutantów
ogólnych. Zwierzęta z tej grupy eksperymentalnej wykonywały podczas pierwszego dnia
testu o 40% więcej ześlizgnięć niż to miało miejsce u mutantów tkankowo
specyficznych, przy czym stosunek ten pogarszał się, osiągając 62% w ostatnim dniu
testu. Wyniki uzyskiwane przez zwierzęta z obu grup eksperymentalnych (Cb-/- i EXP)
ulegały poprawie podczas kolejnych dni testu, jednak nigdy nie osiągały one liczby
błędów charakterystycznej dla zwierząt z grupy kontrolnej. Charakterystyczny był
również silne drżenie towarzyszący wykonywaniu testu przez zwierzęta z grup Cb-/- i
EXP.
Dodatkowo
natężenie
zaburzenia
było
zależne
od
stopnia
trudności
wykonywanego testu. Wykazał to test przeprowadzony ze zwierzętami z linii
L7xCalbtm.2 na węższej bieżni o szerokości 1 cm (szerokość standardowa wynosiła 2
cm) (ryc.39).
66
Ryc.39 Analiza wyników uzyskanych przez myszy z linii L7 x Calbtm.2 podczas 10-dniowego testu na wąskiej bieżni
z przeszkodami. EXP – grupa eksperymentalna (n=10), K – grupa kontrolna (n=9). ' - p ≤ 9,20E-05. Wykres
przedstawia wartości średnie +/- S.D.
Podczas pierwszego dnia testu ilość błędów wzrosła dwukrotnie w obu grupach
zwierząt, jednakże piątego dnia eksperymentu ilość błędów popełnianych przez grupę
kontrolną spadła do poziomu osiągniętego w piątym dniu na bieżni standardowej. W
grupie eksperymentalnej natomiast ilość błędów pozostała dwukrotnie wyższa niż na
bieżni standardowej przez cały czas trwania testu. Test na wąskiej bieżni przedłużyłem
do 10 dni, chcąc sprawdzić, czy wydłużony trening może doprowadzić do poprawy
wyników w grupie eksperymentalnej. Jednak otrzymane wyniki wykazały, iż od piątego
sprawność wykonywania testu pozostaje na nie zmienionym poziomie w obu grupach
zwierząt.
Chcąc sprawdzić, czy zwierzęta nie posiadające kalbindyny w komórkach
Purkinjego zapamiętują nabyte raz umiejętności, przeprowadziłem ponownie test na
bieżni z przeszkodami, a następnie powtórzyłem go z tą samą grupą zwierząt po
dwutygodniowej przerwie (ryc.40).
Wyniki testu pokazały, iż w powtórnym teście
zwierzęta należące do grupy eksperymentalnej i do grupy kontrolnej popełniały znacznie
mniej błędów podczas pierwszych trzech dni testu niż to miało miejsce w teście
pierwszym. Ilość ześlizgnięć w grupie eksperymentalnej (EXP) zmniejszyła się w
pierwszym dniu o 42,53%, w drugim dniu o 35,53% i 28,21% w dniu trzecim (wynik
statystycznie nieznamienny), pozostając w dniu czwartym i piątym na poziomie
zbliżonym do testu pierwszego.
67
Omówienie wyników
Ryc.40 Analiza wyników „dwukrotnego“ testu na bieżni przeprowadzonego ze zwierzętami z linii L7 x
Calbtm.2. EXP – grupa eksperymentalna (n=5), K – grupa kontrolna (n=12). ' - p ≤ 1,76E-03, '' - p ≤
4,95E-02. Wykres przedstawia wartości średnie+/- S.D.
W grupie kontrolnej natomiast (K) ilość ześlizgów podczas drugiego testu była
mniejsza niż w teście pierwszym podczas wszystkich pięciu dni o odpowiednio 59,84%,
59,32%, 28,95%, 43,33% oraz 67,74% (w dniu 4 i 5 wynik statystycznie nieznamienny).
Zaburzenia motoryki spowodowane brakiem kalbindyny widoczne były również
podczas następnego przeprowadzonego przeze mnie testu – testu na równoważni.
Zadaniem tego testu była kontrola koordynacji napięcia mięśniowego koniecznego do
zachowania równowagi. W tym celu mysz umieszcza się na belce o okrągłym przekroju,
sztywno zamocowanej za jeden koniec i mierzy się czas do momentu kiedy zwierzę
spadnie z belki. Maksymalny czas trwania testu dla pojedynczej myszy wynosi 120
sekund. Podobnie jak w przypadku testu na bieżni z przeszkodami, test składa się z
pięciu przeprowadzanych po sobie powtórzeń i trwa przez pięć kolejnych dni
(szczegółowy opis patrz: Materiał i metody). Już w pierwszym dniu testu zwierzęta z
grupy kontrolnej potrafiły utrzymać się na belce trzykrotnie dłużej niż zwierzęta z grupy
eksperymentalnej, osiągając limit czasowy czwartego dnia. Czas, przez jaki utrzymywały
się na belce zwierzęta z grupy eksperymentalnej, wydłużał się do trzeciego dnia, przez
cały jednak okres testu stanowił maksymalnie jedną trzecią czasu osiąganego przez grupę
kontrolną (ryc.41).
68
Ryc.41 Analiza wyników testu na równoważni przeprowadzonego ze zwierzętami z linii L7 x Calbtm.2. EXP –
grupa eksperymentalna (n=7), K – grupa kontrolna (n=9). ' - p ≤ 3,21E-02,. Wykres przedstawia wartości
średnie+/- S.D.
4.3.4 Odruchy wzrokowe
Następnym etapem eksperymentalnym było sprawdzenie, czy brak kalbindyny D28k w komórkach Purkinjego móżdżku wpływa na funkcjonowanie odruchu
optokinetycznego (OKR – ang. optokinetic reflex) i przedsionkowo-wzrokowego (VOR
– ang. vestibular-ocular reflex). Odruch optokinetyczny polega na dostosowaniu ruchów
gałek ocznych do poruszającego się w polu widzenia obrazu, natomiast odruch
przedsionkowo-wzrokowy adaptuje ustawienie gałek ocznych do ruchów głowy. Odruch
optokinetyczny wykorzystuje informację sensoryczną pochodzącą z narządu wzroku,
natomiast odruch przedsionkowo-wzrokowy, badany w ciemności, (VOR-D) informację
przedsionkową. Przy normalnych warunkach świetlnych odruch przedsionkowowzrokowy (VOR-L) wykorzystuje dodatkowo również informację wizualną. Dlatego też
dla celów prowadzonych przeze mnie badań odruch przedsionkowo-wzrokowy badany
był w normalnych warunkach świetlnych (VOR-L) oraz dodatkowo w ciemności, celem
wykluczenia komponenty wizualnej (VOR-D). Parametrami charakteryzującymi oba
wymienione odruchy są: amplituda oraz przesunięcie fazowe, które opisują położenie
gałek ocznych w stosunku do ruchu obrazu w polu widzenia lub ruchów głowy (ryc.42).
Analiza otrzymanych wyników wykazała obniżoną wartość amplitudy OKR w
przypadku zwierząt pozbawionych kalbindyny w komórkach Purkinjego (EXP). Efekt
69
Omówienie wyników
ten był widoczny przy wszystkich zastosowanych częstotliwościach (0,1 – 1,6 Hz), przy
średniej wartości p=0,02. Redukcję amplitudy zaobserwowano również w przypadku
badania VOR-L. Podobnie jak w poprzednim wypadku, redukcja miała miejsce przy
wszystkich częstotliwościach stosowanych w eksperymencie (0,2 – 1,6 Hz), przy
średniej wartości p=0,03.
Ryc.42 Analiza odruchów wzrokowych u zwierząt z linii L7 x Calbtm.2. a+b. Odruch optokinetyczny. c+d.
Odruch przedsionkowo-wzrokowy. K – grupa kontrolna (n=5), EXP – grupa eksperymentalna (n=5). Wykres
przedstawia wartości średnie +/- S.D.
W przypadku obu odruchów nie stwierdzono różnicy pomiędzy przesunięciem
fazowym występującym u osobników grupy kontrolnej i eksperymentalnej. Obserwacja
odruchu przedsionkowo-wzrokowego badanego w ciemności (VOR-D) nie wykazała
różnic pod względem żadnego z badanych parametrów.
4.3.5 Hamowanie długotrwałe (LTD)
70
Hamowanie długotrwałe występujące w synapsach łączących włókna równoległe z
komórkami Purkinjego uzależnione jest od jonów wapniowych wydzielanych z
wewnątrzkomórkowych zbiorników Ca2+ w następstwie aktywacji metabotropowych
receptorów glutaminergicznych (mGluRs – ang. metabotropic glutamate receptors). Stąd
też wewnątrzkomórkowe bufory wapniowe powinny wpływać na regulację tego procesu.
Celem sprawdzenia tej hipotezy, hamowanie długotrwałe było analizowane metodą
„ patch clamping” w skrawkach pochodzących od zwierząt pozbawionych kalbindyny w
komórkach Purkinjego. Analiza pobudzających prądów postsynaptycznych (EPSC - ang.
excitatory postsynaptic currents) powstających w komórkach Purkinjego pod wpływem
stymulacji włókien równoległych wykazała 40% spadek ich amplitudy po indukcji LTD,
który utrzymywał się na tym poziomie przez co najmniej 60 minut. Zjawisko to
występowało w podobnym stopniu zarówno w grupie zwierząt z grupy eksperymentalnej
(EXP), jak i grupy kontrolnej (K). Nie stwierdzono również różnic w czasowym
przebiegu hamowania EPSC (ryc.43).
Ryc.43 Analiza hamowania długotrwałego u zwierząt z linii L7 x Calbtm.2. K – grupa kontrolna, EXP – grupa
eksperymentalna. EPSC – pobudzające prądy postsynaptyczne, Rs – opór szeregowy. Górna część ryciny przedstawia
EPSP zarejestrowane na 5 min. przed indukcją LTD (kontrola) oraz 50 min. po indukcji LTD (50 min). Superpozycja
pokazuje redukcję amplitudy EPSP po nałożeniu bodźców. Część środkowa ryciny: podsumowanie wyników 4
eksperymentów +/-SEM. W części dolnej pokazano wahania oporu szeregowego podczas eksperymentu.
4.3.6 Wahania stężeń wapnia Ca2+ pod wpływem stymulacji synaptycznej
71
Omówienie wyników
Stymulacja komórek Purkinjego przy pomocy pojedynczego impulsu aplikowanego
poprzez włókna równoległe prowadzi do szybkiego wzrostu stężenia jonów wapniowych
[Ca2+]i w dendrytach i kolcach dendrytycznych tych neuronów. Zjawisko to, które
definiuje się jako wczesny synaptyczny wzrost stężenia jonów wapniowych – ESTC
(ang. early synaptic calcium transient) – spowodowane jest aktywacją receptorów
AMPA, której towarzyszy lokalna depolaryzacja i napływ jonów Ca2+ do przestrzeni
wewnątrzkomórkowej. Wahania stężenia jonów wapniowych wewnątrz komórki można
scharakteryzować poprzez ich amplitudę oraz stałą czasową informującą nas o szybkości
powrotu stężenia jonów Ca2+ do wartości wyjściowej. Analiza tych wartości w
komórkach Purkinjego pozbawionych kalbindyny wykazała, iż amplituda wahań [Ca2+]i
w tych neuronach była 2- do 3-krotnie wyższa niż to miało miejsce w przypadku
neuronów zwierząt kontrolnych, natomiast stała czasowa była 3- do 4-krotnie mniejsza
(ryc.44a,c).
Ryc.44 Analiza wahań stężenia jonów Ca2+ w komórkach Purkinjego myszy z linii L7 x Calbtm.2. a. Rejestracja
wczesnych synaptycznych wahań stężenia jonów Ca2+ (ESCT) po pojedynczej stymulacji włókien równoległych w
grupie kontrolnej (K) oraz eksperymentalnej (EXP). Zamieszczone obrazy mikroskopowe przedstawiają dendryty z
zaznaczeniem obszaru, w którym rejestrowano względne zmiany fluorescencji ∆F/F. d – dendryt, kd – kolec
dendrytyczny, bar = 1 µm. EPSC - pobudzający prąd postsynaptyczny wywołany bodżcem 30V (K) lub 10V (EXP),
▲- moment podania bodźca. Czerwona linia przedstawia funkcję wykładniczą opisującą spadek stężenia Ca2+. τ =
stała czasowa. b. Rejestracja wczesnych synaptycznych wahań stężenia jonów Ca2+ (ESCT) po stymulacji włókien
pnących w grupie kontrolnej (K) oraz eksperymentalnej (EXP), opis patrz: a. c. Wykresy porównawcze amplitudy i
stałych czasowych otrzymanych w wyniku pomiarów wahań stężenia jonów Ca2+ w grupie kontrolnej (K) i
eksperymentalnej (EXP). kd – kolec dendrytyczny, d – dendryt. Stymulacja włókien równoległych: liczba
analizowanych dendrytów w grupie K i EXP odpowiednio n=21 i n=17, liczba analizowanych kolców denrytycznych w
grupie K i EXP odpowiednio n=30 i n=44. Stymulacja włókien pnących: liczba dendrytów w grupie K i EXP
odpowiednio n=11 i n=18, liczba kolców dendrytycznych w grupie K i EXP odpowiednio n=26 i n=35. Wykresy
przedstawiają wartości średnie +/- SEM. d. Rejestracja późnych synaptycznych wahań stężenia jonów Ca2+ (DSCT)
po powtarzającej się stymulacji włókien równoległych (5 impulsów po 50 Hz) w obecności 40 µM CNQX. K – grupa
kontrolna, EXP – grupa eksperymentalna. ▲- moment podania bodźca, bar = 20 µm. Obrazy mikroskopowe
pokazują obszar w którym rejestrowano względne zmiany fluorescencji ∆F/F. Czerwona linia przedstawia funkcję
wykładniczą opisującą spadek stężenia Ca2+. τ = stała czasowa. Wykres porównuje stałe czasowe uzyskane w obu
badanych grupach, n=5 i n=7 odpowiednio dla grup K i EXP. Przedstawiono wartości średnie +/-SEM.
72
73
Omówienie wyników
Napływ jonów wapniowych do wnętrza komórek Purkinjego można również
wywołać poprzez stymulację włókien pnących (ryc.44b,c). Wzrostowi [Ca2+]i towarzyszy
w tym przypadku odpowiedź zgodna z regułą „wszystko albo nic”, widoczna w zapisie
aktywności elektrycznej komórki jako tzw. potencjał czynnościowy złożony, składający
się z pięciu do sześciu potencjałów czynnościowych (ang. complex spike). Porównanie
potencjałów czynnościowych złożonych zarejestrowanych w komórkach Purkinjego
pozbawionych ekspresji kalbindyny oraz w komórkach Purkinjego zwierząt kontrolnych
nie wykazało różnic świadczących o zmianie odpowiedzi elektrycznej spowodowanych
usunięciem kalbindyny z tych neuronów.
Stymulacja włókien pnących powoduje wzrost stężenia jonów Ca2+, podobnie jak w
przypadku stymulacji włókien równoległych, zarówno w dendrytach jak i kolcach
dendrytycznych. Analiza otrzymanych wyników wykazała znaczne różnice parametrów
charakteryzujących wahania [Ca2+]i. U myszy mutantów amplituda wahań stężenia jonów
Ca2+ była o około 80% większa niż w przypadku myszy kontrolnych, natomiast stała
czasowa była niższa o ponad 50%. Uzyskane dane pokazują wyraźnie, iż brak
kalbindyny w komórkach Purkinjego prowadzi do zaburzenia postsynaptycznej
sygnalizacji wapniowej, w efekcie czego wahania stężenia jonów Ca2+ przyjmują
bardziej gwałtowny charakter.
Przedstawione powyżej eksperymenty dotyczyły postsynaptycznej sygnalizacji
wapniowej w komórkach Purkinjego, będącej wynikiem stymulacji pojedynczym
impulsem, aplikowanym poprzez włókna równoległe lub włókna pnące. Stosując
powtarzającą się stymulację włókien równoległych można wywołać inny rodzaj
sygnalizacji wapniowej. Objawia się on wahaniami stężenia jonów Ca2+ pojawiającymi
się dopiero po upływie około 200 ms po zastosowaniu bodźca, osiągającymi maksimum
w ciągu 500 ms (ryc 44d). Na podstawie przedstawionej charakterystyki czasowej ten
rodzaj sygnalizacji wapniowej określa się jako późne synaptyczne oscylacje wapniowe –
DSCT (ang. delayed synaptic calcium transients). Definiowane w ten sposób wahania
stężenia jonów Ca2+ powstają w wyniku uwalniania jonów wapniowych ze zbiorników
wewnątrzkomórkowych regulowanych poprzez receptory inozytolo-1,4,5-trifosforanowe
– IP3. Uruchamianie tych rezerwuarów wapniowych następuje w wyniku aktywacji
metabotropowych receptorów glutaminergicznych – mGluRs. Celem następnego
eksperymentu było sprawdzenie, czy brak kalbindyny w komórkach Purkinjego wpływa
74
na wahania [Ca2+] towarzyszące DSCT. Aby umożliwić selektywną rejestrację późnych
synaptycznych oscylacji stężenia jonów wapniowych, oscylacje wczesne zostały
wyłączone poprzez zablokowanie receptorów AMPA przy pomocy CNQX (ang. 6cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione). Analiza DSCT prowadzona była z zastosowaniem
konwencjonalnej mikroskopii konfokalnej połączonej z metodą „patch clamping”.
Uzyskane
tą
drogą
dane
pokazały,
iż
DSCT
występujące
u
zwierząt
ze
zrekombinowanym genem kalbindyny (EXP) nie różnią się znamiennie od DSCT
obserwowanych w grupie kontrolnej (K).
75
Dyskusja
5. Dyskusja
Przeprowadzony przeze mnie cykl eksperymentów pozwolił na tkankowo
specyficzne wyłączenie ekspresji kalbindyny D-28k w komórkach Purkinjego kory
móżdżku myszy przy pomocy systemu rekombinacji genetycznej Cre/loxP. W pierwszej
fazie prowadzonych doświadczeń stworzyłem dwie wyjściowe linie myszy: Calbtm.2 i
L7Cre-2.
W pierwszej z nich - Calbtm.2 - zmodyfikowałem gen kalbindyny poprzez
wprowadzenie sekwencji loxP. Zgodnie z oczekiwaniami, modyfikacja ta wprowadzona
do sekwencji intronowych genu kalbindyny D-28k nie spowodowała zaburzenia
ekspresji tego białka, podobnie jak to miało miejsce w przypadku wielu innych
przeprowadzonych wcześniej mutacji genetycznych wykorzystujących system Cre/loxP
[111]. Zwierzęta te poddałem również testom behawioralnym i sprawnościowym, celem
wykluczenia ewentualnych zaburzeń w tym zakresie, spowodowanych modyfikacją genu
kodującego kalbindynę. Porównanie wyników testu otwartego pola pochodzących od
osobników dzikich (+/+) oraz homozygot (Calbtm.2/ Calbtm.2) nie wykazało żadnych
znamiennych
różnic,
co
świadczy
wyraźnie
o
niezaburzonym
zachowaniu
eksploracyjnym osobników ze zmodyfikowanym genem kalbindyny. Podobnie nie
zaobserwowałem żadnych zaburzeń koordynacji ruchowej badanej przy pomocy testu na
równoważni. Test ten pozwala nie tylko na sprawdzenie koordynacji ruchowej per se,
lecz informuje nas również o ewentualnym wzroście sprawności ruchowej podczas
kolejnych dni testu, który odzwierciedla proces uczenia motorycznego. Otrzymane
wyniki świadczyły o przydatności linii Calbtm.2 do dalszych etapów eksperymentalnych.
Modyfikacja wprowadzona w drugiej linii myszy (L7Cre-2) polegała na
wprowadzeniu egzogennej ekspresji rekombinazy Cre do komórek Purkinjego kory
móżdżku. Eksperyment ten wykonałem wykorzystując przypadkową integrację
sekwencji transgenicznej, zawierającej cDNA kodujące rekombinazę Cre pod kontrolą
sekwencji regulatorowych białka pcp-2. Zakres ekspresji rekombinazy Cre oraz
zachodzącej w jej wyniku rekombinacji w pełni odpowiadał wymaganiom planowanego
przeze mnie eksperymentu i był zasadniczo zgodny z obserwacjami opisanymi w innych
eksperymentach [19, 25, 60, 128, 150, 182, 198, 151]. Poza obszarem kory móżdżku
zaobserwowałem tylko nieznaczną niespecyficzną rekombinację, nie przekraczającą 5%.
Ponadto niebiesko zabarwione komórki były rozmieszczone przypadkowo, co
76
wykluczało rekombinację w zdefiniowanej populacji neuronalnej. Delikatne niebieskie
zabarwienie niektórych dendrytów komórek Purkinjego związane było z transportem
produktu reakcji barwnej, podobnie jak to obserwowano w innych eksperymentach [55].
Chcąc wykluczyć możliwość toksycznego wpływu rekombinazy Cre [177] na
fizjologiczne
funkcje
komórek
Purkinjego,
przeprowadziłem
barwienie
immunohistochemiczne tych neuronów przy pomocy przeciwciał skierowanych
przeciwko kalbindynie D-28k, PEP19, PKC-γ oraz GAD. Dwa pierwsze markery są
białkami rozmieszczonymi równomiernie w cytozolu, tak więc ich wybarwienie pozwala
na analizę morfologii komórek Purkinjego. Dwa ostatnie markery związane są ze stanem
funkcjonalnym tych neuronów. PKC- γ w postaci aktywnej jest związana z błoną
komórkową [107], natomiast GAD jest kluczowym enzymem koniecznym do syntezy
GABA, który jest neurotransmiterem komórek Purkinjego [36]. Porównanie reakcji
immunohistochemicznej w komórkach pochodzących od zwierząt dzikich +/+ i zwierząt
homozygotycznych pod względem transgenu L7Cre-2 nie wykazało żadnych zmian
sugerujących zaburzenia morfologiczne lub fizjologiczne komórek Purkinjego.
Zwierzęta z linii transgenicznej L7Cre-2 poddałem tym samym testom jak w przypadku
linii Calbtm.2, a na podstawie ich wyników mogłem dodatkowo potwierdzić
wcześniejsze obserwacje, iż ekspresja rekombinazy Cre w komórkach Purkinjego nie
spowodowała żadnych widocznych zaburzeń ich funkcji.
Skrzyżowanie opisanych powyżej linii myszy doprowadziło do rekombinacji genu
kalbindyny D-28k i w jej wyniku do wyłączenia jej ekspresji w komórkach Purkinjego
móżdżku. Zakres rekombinacji w komórkach Purkinjego zwierząt homozygotycznych po
względem allelu Calbtm.2, określiłem na podstawie immunohistologicznej oceny ekspresji
kalbindyny w tych neuronach. Analiza ilościowa otrzymanych wyników wykazała, iż
>98% komórek Purkinjego zostało pozbawionych kalbindyny. Porównanie ilości
zrekombinowanych komórek Purkinjego u zwierząt Calbtm.2/Calbtm.2 posiadających
jednocześnie jeden lub dwa allele L7Cre-2 nie wykazało żadnych widocznych różnic.
Świadczy to, iż poziom ekspresji rekombinazy Cre, będący efektem ekspresji jednego
tylko allelu L7Cre-2, jest wystarczający do zrekombinowania wszystkich dostępnych
alleli Calbtm.2. Obserwacja ta jest zgodna z wcześniejszymi doświadczeniami nad
stechiometrią systemu Cre/loxP, które wykazały, iż do zrekombinowania jednej
sekwencji loxP potrzebne są jedynie dwie cząsteczki rekombinazy Cre [126]. Należy w
77
Dyskusja
tym miejscu zaznaczyć, że przy pomocy sekwencji regulatorowych białka pcp-2 możemy
uzyskać jedynie ograniczony poziom ekspresji. Fakt ten ogranicza możliwość stosowania
tych sekwencji do eksperymentów nie wymagających wysokiego, komórkowego stężenia
transgenicznego białka. Jest to szczególnie ważne przy planowaniu eksperymentów
polegających na tkankowo specyficznym odtworzeniu ekspresji białka endogennego.
Przykładem takiego eksperymentu zakończonego sukcesem może być przywrócenie
pierwotnego fenotypu u myszy pozbawionych glutaminergicznego metabotropowego
receptora typu 1 (mGluR1), które charakteryzują się brakiem LTD. Ekspresja tego
receptora w komórkach Purkinjego pod kontrolą elementów regulatorowych pcp-2
doprowadziła do zupełnego przywrócenia hamowania długoterminowego, pomimo iż
poziom ekspresji był o około 80% niższy niż u myszy dzikich [84]. Podczas
eksperymentów własnych podjąłem również próbę przywrócenia ekspresji kalbindyny w
komórkach Purkinjego u mutantów mysich pozbawionych całkowicie tego białka i
charakteryzujących się ataksją typu móżdżkowego [2]. Eksperyment ten zakończył się
jednak niepowodzeniem, gdyż mimo specyficznej ekspresji transgenicznej kalbindyny
nie udało mi się odtworzyć wysokiego stężenia tego białka (około 300 µM) koniecznego
do prawidłowego funkcjonowania komórek Purkinjego (nieopublikowane obserwacje
własne).
Analiza morfologiczna myszy pozbawionych kalbindyny D-28k w komórkach
Purkinjego nie wykazała żadnych widocznych zmian w anatomii móżdżku, podobnie jak
to miało miejsce w przypadku ogólnej mutacji dla tego genu [2]. Barwienie
immunohistochemiczne
komórek
Purkinjego
ujawniające
ekspresję
markerów
morfologicznych i funcjonalnych tych neuronów nie ujawniło żadnych widocznych
nieprawidłowości. Wyniki wcześniejszych eksperymentów polegających na wyłączeniu
ekspresji genów aktywnych w komórkach Purkinjego pokazały jednak, iż funkcje
mózgowia i móżdżku mogą być upośledzone pomimo braku jakichkolwiek widocznych
zmian morfologicznych w tych strukturach [42, 48, 94, 96]. Nie wydaje się jednak
możliwym, aby brak dramatycznych zaburzeń rozwojowych i widocznych gołym okiem
dysfunkcji wynikał z kompensacji braku kalbindyny poprzez inne białkowe bufory
wapnia.
Przeprowadzona
przeze
mnie
analiza
immunohistologiczna
ekspresji
parwalbuminy i kalretyniny oraz wyniki wcześniejszych eksperymentów [2] nie
wykazały żadnych oznak podwyższonego poziomu ekspresji obu tych białek. Ponadto,
78
odmienne parametry fizykochemiczne w przypadku parwalbuminy [82, 113, 117, 188], a
w przypadku kalretyniny inna lokalizacja na terenie kory móżdżku wykluczają w
zasadzie taką ewentualność [167, 176]. Wstępne eksperymenty przeprowadzone na
myszach pozbawionych jednocześnie kalbindyny i parwalbuminy również nie wskazują
na możliwość substytucji funkcji kalbindyny przez parwalbuminę. Myszy pozbawione
obu
tych
buforów
białkowych
nie
różnią
się
pod
względem
parametrów
sprawnościowych i behawioralnych od mutantów pozbawionych jedynie kalbindyny
(ryc.45).
Ryc.45 Porównanie wyników uzyskanych podczas testu na bieżni z przeszkodami przez zwierzęta
całkowicie pozbawione kalbindyny D-28k (Cb-/-, n=6) oraz zwierzęta pozbawione jednocześnie kalbindyny
D-28 i parwalbuminy (Cb-/-Pv-/-, n=12). Wykres przedstawia wartości średnie +/- S.D.
Myszy pozbawione ekspresji kalbindyny jedynie w komórkach Purkinjego nie
wykazują zaburzeń motorycznych lub behawioralnych, które byłyby widoczne podczas
obserwacji zwierząt przebywających w klatkach, podobnie jak to miało miejsce w
przypadku ogólnych mutantów dla tego białka [2]. Również szczegółowa analiza
zachowania przeprowadzona podczas testu otwartego pola nie wykazała różnic pomiędzy
zachowaniem eksploracyjnym osobników grupy kontrolnej, a mutantami z linii
L7xCalbtm.2. Do testowanych zwierząt dołączyłem również myszy pozbawione
kalbindyny w całym organizmie, gdyż zachowanie ich nie było nigdy wcześniej
analizowane przy pomocy stosowanej przeze mnie aparatury badawczej. Bezpośrednie
porównanie zachowania tych zwierząt z mutantami tkankowo specyficznymi wykazało
79
Dyskusja
statystycznie znamienną różnicę w jednym z dwóch analizowanych parametrów, jakim
była liczba podnoszeń na tylnych kończynach. Podczas 30 minut testu zwierzęta z linii
mutantów ogólnych wykonywały mniej podnoszeń niż mutanty z linii L7xCalbtm.2,
które uzyskały wynik nie różniący się od wyniku grupy kontrolnej. Różnica ta jest
niewątpliwie wynikiem wyłączenia ekspresji kalbindyny poza obrębem kory móżdżku.
Jednak dość rozpowszechniona ekspresja tego białka na terenie ośrodkowego układu
nerwowego nie pozwala na dokładne wskazanie struktury odpowiedzialnej za mniejszą
aktywność pionową mutantów ogólnych. Można jedynie spekulować, iż ograniczenie
aktywności eksploracyjnej mutantów ogólnych może być związane ze zwiększonym
odczuwaniem lęku przez te zwierzęta. Do struktur zaangażowanych w reakcje lękowe
należą hipokamp oraz ciało migdałowate [155, 191], które zawierają populacje
neuronalne charakteryzujące się ekspresją kalbindyny D-28k [35, 40]. Można więc
wysunąć hipotezę, iż brak kalbindyny w tych regionach może prowadzić do zmniejszonej
aktywności eksploracyjnej. Analiza drugiego parametru, jakim był całkowity dystans
pokonywany przez zwierzęta, nie wykazała różnic pomiędzy grupami zwierząt
uczestniczącymi w teście.
Wyłączenie ekspresji kalbindyny w komórkach Purkinjego spowodowało typowe
objawy zaburzenia funkcji móżdżku, jakimi są tremor kinetyczny i ataksja [195].
Możemy je obserwować jednak dopiero podczas wykonywania przez zwierzęta testów
wymuszających adaptację koordynacji ruchowej do nowych nieznanych wcześniej
wymagań [123, 165, 193]. Do wymienionych testów należy analiza koordynacji
ruchowej myszy na bieżni z przeszkodami i równoważni. Zwierzęta, u których doszło do
wyłączenia ekspresji kalbindyny w komórkach Purkinjego, przez cały czas trwania testu
popełniały znacznie więcej błędów (ześlizgnięć) niż zwierzęta z grupy kontrolnej. Liczba
popełnianych błędów zmniejszała się podczas kolejnych dni testu, była jednak zawsze
około trzykrotnie większa niż w grupie kontrolnej. Włączenie do testu na bieżni
ogólnych mutantów pozbawionych kalbindyny pozwoliło mi na ich porównanie z
mutantami tkankowo specyficznymi. Otrzymany wynik ujawnił większy deficyt
koordynacji ruchowej u mutantów ogólnych, który został niewątpliwie spowodowany
dodatkowym brakiem kalbindyny poza korą móżdżku. Ze względu na rozpowszechnienie
ekspresji kalbindyny w ośrodkowym układzie nerwowym [12, 35] wiele struktur może
być odpowiedzialnych za obserwowane nasilenie ataksji, jednak jej specyficzny
80
charakter sugeruje przede wszystkim udział oliwki dolnej. Jądra wchodzące w jej skład
zawierają kalbindynę, a ich wypustki - włókna pnące - należą do podstawowych
elementów regulujących funkcje komórek Purkinjego. Nie można oczywiście wykluczyć
udziału innych obszarów zawierających kalbindynę, takich jak kora mózgu czy
prążkowie.
Celem sprawdzenia czy brak kalbindyny w komórkach Purkinjego spowodował
zaburzenie procesu uczenia motorycznego zwiększyłem stopień trudności testu na bieżni
poprzez zmniejszenie jej szerokości do 1 cm oraz przedłużyłem test do 10 dni.
Spowodowało to dwukrotny wzrost ilości ześlizgnięć w pierwszym dniu testu zarówno w
grupie eksperymentalnej, jak i kontrolnej. Po pięciu dniach testu u zwierząt z grupy
kontrolnej ilość popełnianych błędów zmniejszyła się do poziomu uzyskanego podczas
testu na bieżni standardowej, natomiast ilość błędów w grupie eksperymentalnej
pozostała dwukrotnie wyższa przez cały czas trwania testu. Wydłużony test na bieżni z
przeszkodami wykazał, że defekt spowodowany usunięciem kalbindyny z komórek
Purkinjego ma charakter trwały i nie może być zrekompensowany poprzez długotrwały
trening. Jednocześnie test ten potwierdził poprzednią obserwację, iż uczenie motoryczne
per se nie zostało całkowicie wygaszone w wyniku usunięcia kalbindyny z komórek
Purkinjego, gdyż u zwierząt pozbawionych tego białka następuje poprawa wyników
podczas trwania testu. Aspekt uczenia motorycznego przeanalizowałem dodatkowo
przeprowadzając dwukrotnie test na bieżni z przeszkodami z udziałem tych samych
zwierząt, przy czym pierwszy i drugi test dzieliła dwutygodniowa przerwa. Otrzymany
wynik pokazał, iż w pierwszym dniu drugiego testu zwierzęta pozbawione kalbindyny w
komórkach Purkinjego wykonywały mniej błędów niż w pierwszym dniu testu
pierwszego i tendencja ta utrzymywała się do trzeciego dnia. Widać więc wyraźnie, iż
pomimo braku kalbindyny zwierzęta zapamiętują raz nabyte umiejętności, choć w
mniejszym stopniu niż zwierzęta z grupy kontrolnej.
Zaburzenia koordynacji ruchowej potwierdził również następny przeprowadzony
przeze mnie test sprawnościowy – test na równoważni. Podobnie jak w przypadku testu
na bieżni wymaga on od zwierząt przystosowania motoryki do nowych nieznanych
warunków, przy czym zwierzęta pozostają w spoczynku starając się zachować
równowagę na belce o gładkiej powierzchni. Maksymalny przewidziany w
eksperymencie czas utrzymywania się na belce wynosił 120 s i osiągany był przez
81
Dyskusja
zwierzęta z grupy kontrolnej od trzeciego dnia testu. Zwierzęta pozbawione kalbindyny
w komórkach Purkinjego nigdy nie osiągały tak długiego czasu, a średni maksymalny
wynik (około 60 s) osiągany w trzecim dniu testu nie uległ poprawie do końca jego
trwania.
W celu dokładniejszego zdefiniowania przyczyny obserwowanej dyskoordynacji
ruchowej
przeprowadzony
został
test
badający
odruchy
wzrokowe.
Odruch
optokinetyczny (OKR) i przedsionkowo wzrokowy (VOR) wykorzystują dokładnie
poznane pętle neuronalne, co ułatwia definiowanie przyczyn ich zaburzenia [49, 102]. W
przypadku mutantów pozbawionych kalbindyny w komórkach Purkinjego stwierdziłem
nieprawidłowości polegające na zmniejszeniu amplitudy OKR oraz VOR badanego przy
oświetleniu (VOR-L). Amplituda odruchu przedsionkowo-komorowego badanego w
ciemności (VOR-D) była bez zmian. OKR oraz VOR-L zależą od informacji
pochodzącej z narządu wzroku i otrzymane wyniki były wyraźną wskazówką, iż
przyczyną zakłócenia koordynacji ruchowej jest niewłaściwe przetwarzanie impulsacji
wizualnej. Podobne zaburzenie można obserwować u mutantów mysich „Lurcher”
posiadających zdegenerowane komórki Purkinjego [49]. W tym przypadku jednak
obserwuje się dodatkowo zmiany w przesunięciu fazowym obu odruchów wzrokowych,
polegające na opóźnieniu ruchów gałek ocznych w stosunku do przemieszczającego się
obrazu. Różnica ta może świadczyć o innym mechanizmie regulacji przesunięcia
fazowego, niezależnym od kalbindyny. Ponadto amplituda VOR-D jest u myszy
„Lurcher” podwyższona, co może być efektem dodatkowej, wtórnej adaptacji jąder
przedsionkowych, spowodowanej zanikiem komórek Purkinjego. Brak zmian VOR-D u
mutantów pozbawionych kalbindyny sugeruje, iż brak tego białka nie jest wystarczający
aby spowodować dodatkowe wtórne zmiany, a obserwowane zaburzenia obu odruchów
wzrokowych spowodowane są jedynie zaburzeniem funkcji komórek Purkinjego.
Specyficzny wpływ braku kalbindyny w komórkach Purkinjego odnoszący się jedynie do
komponenty
wizualnej
odmiennych
struktur
może
być
również
pozamóżdżkowych,
nie
odzwierciedleniem
zaangażowanych
zaangażowania
w
sygnalizację
przedsionkową. Przykładem takiej sytuacji może być koordynacja kończyn oparta na
informacji wzrokowej, która zależna jest od sygnałów przesyłanych do kory
przedruchowej mózgowia poprzez jądra głębokie móżdżku [143, 157]. W takiej sytuacji
efekt genetycznych manipulacji w komórkach Purkinjego byłby zależny od stopnia
82
wrażliwości struktury docelowej leżącej poza móżdżkiem, na zmienioną sygnalizację
przesyłaną za pośrednictwem głębokich jąder móżdżku.
Dalszym krokiem do poznania komórkowych mechanizmów odpowiedzialnych za
obserwowane zmiany fenotypowe wywołane brakiem kalbindyny była analiza
hamowania długotrwałego (LTD). Zjawisko to jest odpowiedzialne za plastyczność
neuronalną manifestującą się przeważnie w postaci zmian behawioralnych. Metoda
indukowania LTD stosowana w opisywanych przeze mnie eksperymentach była
wcześniej z powodzeniem stosowana podczas analizy innych mutantów mysich [1, 42,
48, 96]. Kalbindyna obecna w znacznych ilościach w komórkach Purkinjego jest wysoce
wydajnym buforem jonów Ca2+ [2, 61, 127], które jednocześnie są podstawowym
elementem sygnalizacji prowadzącej do powstania LTD [105, 175]. Jednak, pomimo
tych dwóch wyjściowych przesłanek, brak kalbindyny w komórkach Purkinjego nie
wpływa na proces LTD w tych neuronach. Przyczyny takiego stanu rzeczy można
upatrywać w fakcie, iż LTD jest wynikiem sygnalizacji wapniowej zależnej od aktywacji
metabotropowych receptorów glutaminergicznych mGluR [45, 85, 206, 88], a ta wydaje
się być nie zmieniona u opisywanych przez mnie mutantów. Można więc założyć, iż
ingerencja w sygnalizację wapniową wynikającą z aktywacji receptorów AMPA, nie ma
wpływu na indukcję procesu LTD. Nie można oczywiście całkowicie wykluczyć
możliwości, iż przy zastosowaniu innego sposobu wywoływania LTD można by
zaobserwować jego wzrost spowodowany brakiem kalbindyny. Możliwy jest również
wpływ wyłączenia ekspresji kalbindyny na inne formy plastyczności neruonalnej w
móżdżku. Prowadzone ostatnio badania nad wzmocnieniem długotrwałym (LTP)
wskazały na możliwość istnienia nowej jego formy zależnej od tlenku azotu (NO), a
występującej w połączeniach synaptycznych włókien równoległych i komórek
Purkinjego
[116].
Opisana
forma
LTP
ulega
wzmocnieniu
w
obecności
postsynaptycznych chelatorów wapniowych posiadających właściwości zbliżone do
kalbindyny. Istnieje więc możliwość, iż tego rodzaju LTP mogłoby podlegać redukcji w
przypadku braku kalbindyny w komórkach Purkinjego.
Stymulacja komórek Purkinjego poprzez ich połączenia synaptyczne z włóknami
równoległymi lub włóknami pnącymi prowadzi do postsynaptycznych wahań stężenia
jonów wapniowych [53, 54]. W celu sprawdzenia, czy brak kalbindyny w komórkach
Purkinjego wpływa na kinetykę stężenia jonów wapniowych, przeprowadzona została
83
Dyskusja
analiza zmian stężenia jonów Ca2+ u zwierząt ze zrekombinowanym genem kalbindyny.
Przeprowadzone pomiary wykazały, iż stała czasowa ustalona dla spadku stężenia jonów
wapniowych po wczesnej fazie ich wzrostu (ESCT) waha się u mutantów w granicach
80-100 ms, natomiast u zwierząt z grupy kontrolnej jest dłuższa o 200-300 ms. Wynik
ten wyjaśnia również, dlaczego brak kalbindyny pozostaje bez widocznego wpływu na
kinetykę stężenia jonów wapniowych podczas późnej fazy – DSCT [63, 189].
Sygnalizacja wapniowa podczas DSCT zależna jest od aktywacji receptorów mGluR i
posiada znacznie wolniejszą kinetykę. Wartość szczytowa [Ca2+]i osiągana jest w tej
fazie dopiero po ponad 500 ms, a stała czasowa spadku stężenia waha się w granicach
200-300 ms. Z powyższych powodów wydaje się mało prawdopodobne, aby kalbindyna
mogła w istotnym stopniu uczestniczyć w regulacji DSCT, a co za tym idzie, w regulacji
sygnalizacji wapniowej zależnej do mGluR. Ponieważ kalbindyna jest szybkim buforem
jonów wapniowych [2, 127, 169], można przypuszczać, iż jej brak oddziałuje na co
najmniej cztery rodzaje sygnalizacji wapniowej.
Po pierwsze, zaburzeniu ulega dynamika zmian stężenia jonów Ca2+ związanych z
aktywacją receptorów AMPA, do której dochodzi w wyniku stymulacji włókien
równoległych. W dendrytach i należących do nich kolcach dendrytycznych brak
kalbindyny powoduje podwyższenie amplitudy ESCT oraz szybszy spadek stężenia
jonów Ca2+. Jest to zjawisko jakiego można oczekiwać w przypadku braku szybkiego
buforu jonów wapniowych [203].
Po
drugie,
podobnej
modyfikacji
jak
w
poprzednim
wypadku
ulega
postsynaptyczna sygnalizacja wapniowa będąca efektem stymulacji włókien pnących.
Podobnie jak w poprzednim wypadku, brak kalbindyny wydaje się nie mieć wpływu na
odpowiedź elektryczną komórek Purkinjego. Interesującym spostrzeżeniem jest w tym
przypadku fakt, iż modyfikacja dynamiki stężeń jonów Ca2+ jest obserwowana nie tylko
w dendrytach, ale również w kolcach dendrytycznych. Wyniki te są podobne do
przedstawionych poprzednio przez Airaksinena i współpr. [2], który opisywał wzrost
amplitudy w podobnym zakresie. Należy jednak zauważyć, iż w poprzednich badaniach
spadek stężenia jonów wapniowych przedstawiony został przy pomocy dwóch funkcji
wykładniczych, natomiast w przypadku prowadzonych przeze mnie eksperymentów
odpowiadał on najlepiej przebiegowi pojedynczej funkcji wykładniczej. Możliwe jest
jednak, iż ze względu na nieco inne warunki pomiaru (niskie stężenie indykatora, pomiar
84
w mniejszej przestrzeni komórkowej), a co za tym idzie wyższy poziom tła, mogło dojść
do zamaskowania dodatkowej, szybkiej stałej czasowej. Ponadto trzeba zwrócić uwagę
na fakt, iż choć amplituda mierzona w pracy Airaksinena i współpr. [2] była
podwyższona, to stała czasowa pozostała jednak niezmieniona. Jeżeli dane otrzymane
przez Airaksinena i współpr. [2] przedstawimy przy pomocy jednej funkcji wykładniczej,
to okaże się, iż wynik jest identyczny z otrzymanym na podstawie prowadzonych przeze
mnie badań. Pomiary prowadzone u myszy pozbawionych kalbindyny w komórkach
Purkinjego były również dokładniejsze, ponieważ wahania stężenia jonów Ca2+
rejestrowano w miejscu ich powstawania, a nie jak w poprzedniej pracy w grubych
dendrytach, w pobliżu ciała komórki.
Trzecim rodzajem sygnalizacji wapniowej, który może ulec zaburzeniu w wyniku
braku kalbindyny, są wahania stężenia jonów wapniowych związane z potencjałami
czynnościowymi powstającymi w ciele komórki [122], dendrytach [121], aksonach [31]
oraz w zakończeniach nerwowych. W ten sposób zależne od potencjałów
czynnościowych wahania [Ca2+]i w denrytach i kolcach dendrytycznych również będą
miały podwyższoną amplitudę i przyspieszony spadek stężenia. W efekcie może to
prowadzić do zakłócenia sygnalizacji poprzez jej gorszą koordynację [205].
Czwartym i ostatnim rodzajem sygnalizacji, który może zostać zaburzony brakiem
kalbindyny, jest uwalnianie neurotransmitera z zakończeń aksonalnych komórek
Purkinjego zlokalizowanych w jądrach głębokich móżdżku. Wcześniejsze eksperymenty
wykazały, iż parwalbumina posiada zdolność do modulowania sekrecji neurotransmitera
GABA [30]. Badania wzmocnienia synaptycznego w komórkach hipokampa pokazały
jego modyfikację zależną od obecności lub nadekspresji kalbindyny w tych neuronach
[38, 100]. Efekt ten był prawdopodobnie spowodowany zmianą stężenia jonów
wapniowych w zakończeniach presynaptycznych, która jest konieczna do wzmocnienia
uwalniania neurotransmitera.
Tak więc pomimo zablokowania ekspresji kalbindyny w jednej tylko populacji
neuronalnej, obserwowane zaburzenia behawioralne mogą wynikać z zachwiania wielu
różnorakich wapniozależnych procesów komórkowych.
Przeprowadzone przeze mnie badania przedstawiają nowy model dysfunkcji
móżdżku, która jest niezależna od LTD. Interesującym jest, iż choć zaburzenia funkcji
móżdżku utrzymują się nawet po długotrwałym treningu, poprawa sprawności w
85
Dyskusja
początkowej fazie testu jest podobna zarówno u mutantów, jak i zwierząt kontrolnych.
Sugeruje to wyraźnie, iż u zwierząt nie posiadających kalbindyny w komórkach
Purkinjego ciągle występuje jakaś forma uczenia motorycznego. Niestety niemożliwe
było dokładniejsze zbadanie tego aspektu, gdyż zaburzenie podstawowej koordynacji
gałek ocznych uniemożliwiło przeprowadzenie testu sprawdzającego adaptację
odruchów wzrokowych. Obecność długoterminowej adaptacji motorycznej postulowali
również naukowcy badający myszy-mutanty, u których dokonano w komórkach
Purkinjego genetycznej blokady kinazy proteinowej C (PKC) [48, 71]. U zwierząt tych
stwierdzono normalną podstawową koordynację gałek ocznych przy zaburzonym LTD.
Badania adaptacji koordynacji wzrokowej tych zwierząt wykazały silne upośledzenie
adaptacji krótkotrwałej przy zachowanej w znacznym stopniu adaptacji długotrwałej. Na
tej podstawie wysunięto hipotezę, że LTD może mieć większe znaczenie dla
krótkotrwałego uczenia motorycznego [197]. Postawiona teza jest komplementarna do
sytuacji występującej u mutantów pozbawionych kalbindyny w komórkach Purkinjego.
Niezaburzone LTD występuje tu w połączeniu ze wzrostem sprawności w pierwszej
fazie testu oraz silnym upośledzeniem długotrwałym. Stąd też nasuwa się wniosek, iż
szybka sygnalizacja wapniowa regulowana przy pomocy bufora białkowego, jakim jest
kalbindyna, zaangażowana jest w uczenie długotrwałe wykorzystujące nieznane dotąd
procesy komórkowe.
Na podkreślenie zasługuje fakt, iż sygnalizacja wykorzystująca jony Ca2+ w
połączeniu z potencjałami czynnościowymi jest powszechną właściwością wszystkich
neuronów ośrodkowych, a przebieg tego procesu jest kontrolowany przez cała gamę
białkowych buforów wapniowych. Można więc rozciągnąć znaczenie zaprezentowanych
przeze mnie wyników na inne, występujące poza móżdżkiem populacje neuronalne,
wykorzystujące szybką sygnalizację wapniową w integracji ośrodkowego układu
nerwowego.
Jako kontynuacja podjętych przeze mnie badań nasuwa się niewątpliwie próba
bliższego przyjrzenia się ataksjom pochodzenia móżdżkowego występującym u ludzi
poprzez pryzmat zaburzonej gospodarki jonami wapniowymi w komórkach Purkinjego.
Bufory wapniowe z grupy protein „EF-hand” wzbudzają już od dawna zainteresowanie
jako czynniki zapobiegające nadmiernemu wzrostowi stężenia jonów Ca2+ w komórkach
nerwowych, a co za tym idzie zapobiegające degeneracji tych komórek. Jednakże wyniki
86
badań prowadzonych w tym zakresie nie pozwalają na sformułowanie jednoznacznej
hipotezy. W zależności od badanej populacji neuronalnej i metody badań, otrzymane
wyniki potwierdzają lub zaprzeczają hipotezie o antyapoptotycznej funkcji białek z
grupy „EF-hand” [3, 69, 80, 100, 208]. Niewątpliwym pozostaje jednak fakt, iż w
przypadku wielu eksperymentów obserwowano spadek immunoreaktywności kalbindyny
lub parwalbuminy w grupach neuronów podlegających degeneracji. Przykładem takich
zmian dotyczących komórek Purkinjego, występujących u ludzi, może być dziedziczna
ataksja rdzeniowo-móżdżkowa typu 1-szego [201]. Spadek immunoreaktywności obu
tych białek obserwowano również u myszy transgenicznych będących modelem
zwierzęcym tego schorzenia [202]. Niejasnym ciągle pozostaje, czy obserwowany
spadek immunoreaktywności jest przyczyną czy następstwem procesów prowadzących
do śmierci komórki. Szczególnie interesującą grupą dysfunkcji móżdżku są ataksje
związane z mutacjami w obrębie genów kodujących kanały jonowe [4]. Należą tutaj:
epizodyczna ataksja typu 1-szego, której przyczyną jest mutacja jednej z podjednostek
wchodzących w skład kanału potasowego Kv1.1 [134], oraz ataksje związane z
mutacjami w obrębie genów kodujących jony wapniowe. W skład drugiej grupy
wchodzą: ataksja rdzeniowo-móżdżkowa typu 6-tego oraz epizodyczna ataksja typu 2ego. Oba te schorzenia są spowodowane mutacjami sekwencji kodujących kanały
wapniowe P/Q, przy czym ataksja typu 6-tego jest efektem powtarzających się sekwencji
CAG, natomiast ataksja typu 2-ego jest wynikiem mutacji punktowych [4, 160, 168].
Oba rodzaje zmian genetycznych powodują modyfikację podjednostki α1 kanału
wapniowego typu P/Q co prowadzi w efekcie do wzmożonego napływu jonów
wapniowych do wnętrza komórki. Przypuszcza się, że dwa mniej dotąd zbadane rodzaje
ataksji epizodycznych typu 3-go i 4-tego mogą być również spowodowane zaburzoną
równowagą jonową w obrębie móżdżku [44, 186].
Podsumowując wszystkie dane eksperymentalne omówione w przedstawionej
przeze mnie pracy widać wyraźnie, iż mimo prowadzonych od wielu lat badań dalecy
jesteśmy jeszcze od zrozumienia wszystkich procesów fizjologicznych zachodzących w
móżdżku z udziałem jonów wapniowych. Dynamiczny rozwój technik badawczych nie
tylko pozwala na wciąż dokładniejsze wnikanie do wnętrza komórek nerwowych, ale
prowadzi też do odkrywania nowych nie znanych dotąd aspektów przemian
zachodzących w neuronach. Ich szczegółowa analiza może stać się w przyszłości
87
Dyskusja
punktem
wyjścia
do
znalezienia
nowych,
lepszych
strategii
terapeutycznych
pozwalających na skuteczniejsze leczenie zaburzeń koordynacji ruchowej.
88
6. Wnioski
W wyniku prowadzonych przeze mnie eksperymentów stworzyłem dwie linie
mutantów mysich: L7Cre-2 oraz Calbtm.2. W następstwie skrzyżowania tych linii doszło
do tkankowo specyficznego wyłączenia ekspresji kalbindyny D-28k w komórkach
Purkinjego móżdżku. Analiza otrzymanych mutantów pozwoliła mi na sformułowanie
następujących wniosków:

zastosowanie elementów regulacyjnych genu kodującego białko pcp-2 (linia
L7Cre-2) pozwala na bardzo specyficzną ekspresję rekombinazy Cre w
komórkach Purkinjego móżdżku,

modyfikacja genu kodującego kalbindynę D-28k poprzez wprowadzenie
sekwencji loxP (linia Calbtm.2) nie zaburza ekspresji tego białka w korze
móżdżku,

poziom ekspresji rekombinazy Cre w komórkach Purkinjego pozwala na
skuteczną i specyficzną rekombinację allelu Calbtm.2 oraz zablokowanie
ekspresji kalbindyny D-28k w tych neuronach,

brak kalbindyny D-28k w komórkach Purkinjego powoduje bardzo specyficzne
zaburzenie koordynacji ruchowej widoczne podczas testów wymagających
przystosowania motoryki do nowych warunków,

brak kalbindyny D-28k powoduje nieprawidłowe przetwarzanie impulsacji
wizualnej docierającej do komórek Purkinjego, co potwierdza analiza odruchów
wzrokowych,

zwierzęta pozbawione kalbindyny D-28k w komórkach Purkinjego zachowują,
przynajmniej częściowo, zdolność uczenia motorycznego,

brak kalbindyny D-28k w komórkach Purkinjego nie ma wpływu na zjawisko
hamowania długotrwałego (LTD) w tych neuronach,

kalbindyna D-28k uczestniczy w sygnalizacji wapniowej wywołanej aktywacją
receptorów AMAPA, a jej nieobecność w komórkach Purkinjego zmienia
kinetykę wczesnych synaptycznych wahań stężenia jonów Ca2+ (ESCT),

ze względu na swoje właściwości fizykochemiczne kalbindyna D-28k nie bierze
udziału w późnych synaptycznych wahaniach stężenia jonów Ca2+ (DSCT),
związanych z aktywacją metabotropowych receptorów glutaminergicznych.
89
Streszczenie
7. Streszczenie
Białka wiążące jony wapniowe są obecne w wielu populacjach komórkowych na
obszarze ośrodkowego układu nerwowego. Prowadzone od wielu lat badania ujawniły
ich istotną funkcję jako modulatorów funkcji komórkowych, która realizowana jest
między innymi poprzez buforowanie jonów wapniowych na terenie cytoplazmy. Jednym
z białek należących do tej grupy jest kalbindyna D-28k. Występuje ona w wielu rejonach
mózgowia myszy, przy czym najwyższy poziom ekspresji osiąga w korze móżdżku,
gdzie zlokalizowana jest wyłącznie w komórkach Purkinjego. W neuronach tych jony
Ca2+ pełnią kluczową rolę uczestnicząc w procesach związanych z pobudliwością i
modyfikacją połączeń synaptycznych, prowadzącą między innymi do powstawania
zjawiska hamowania długotrwałego - LTD. Zjawisko to jest procesem powodującym
zahamowanie przewodzenia w połączeniach synaptycznych komórek Purkinjego i
komórek ziarnistych, co stanowi podstawę procesu uczenia motorycznego. Poprzez
uczenie motoryczne realizowana jest zasadnicza funkcja móżdżku, jaką jest koordynacja
ruchowa. Do wywołania LTD konieczna jest aktywacja metabotropowych receptorów
glutaminergicznych mGluR, prowadząca w następstwie do kaskady sygnalizacyjnej z
udziałem jonów wapniowych. Eksperymenty polegające na zaburzeniu różnych etapów
tej kaskady prowadziły do zakłócenia LTD, a myszy pozbawione receptora mGluR1
charakteryzowały
się
ataksją.
Nieprawidłowości
w
koordynacji
ruchowej
zaobserwowano również u myszy, u których zaburzono dynamikę wahań stężenia jonów
Ca2+ poprzez genetyczne wyłączenie ekspresji kalbindyny D-28k. Ze względu jednak na
ogólny charakter mutacji i brak kalbindyny w całym organizmie, nie można było
jednoznacznie odpowiedzieć na pytanie, czy obserwowany fenotyp jest efektem braku
kalbindyny w komórkach Purkinjego.
Celem dokładniejszego zdefiniowania roli kalbindyny D-28k w komórkach
Purkinjego móżdżku przeprowadziłem eksperyment polegający na wyłączeniu ekspresji
kalbindyny jedynie w tych neuronach. Do tkankowo specyficznej mutacji genu
kodującego kalbindynę wykorzystałem system rekombinacji Cre/loxP. W tym celu
stworzyłem dwie linie mutantów mysich: Calbtm.2 oraz L7Cre-2. W pierwszej z linii Calbtm.2 - zmodyfikowałem gen kalbindyny D-28k poprzez wprowadzenie sekwencji
loxP powyżej (5’) i poniżej (3’) piewszego eksonu kodującego to białko. Sekwencje te
90
stanowiły sygnał dla rekombinazy Cre, który to enzym miał wyciąć fragment DNA
zawarty między nimi. Modyfikacja genetyczna drugiej linii myszy - L7Cre-2 - polegała
wprowadzeniu
do
genomu
transgenicznego
DNA,
umożliwiającego
ekspresję
rekombinazy Cre wyłącznie w komórkach Purkinjego móżdżku. W tym celu
wykorzystałem sekwencje regulacyjne należące do genu kodującego białko pcp-2. Obie
linie myszy poddałem szczegółowej analizie morfologicznej i behawioralnej chcąc
wykluczyć wpływ wprowadzonych mutacji na wyniki dalszych badań.
Skrzyżowanie obu linii myszy doprowadziło to specyficznej mutacji genu
kalbindyny i wyłączenia ekspresji tego białka w 95% komórek Purkinjego. Otrzymane
mutanty poddałem wszechstronnej analizie w celu znalezienia zmian fenotypowych
spowodowanych brakiem kalbindyny w korze móżdżku.
Zwierzęta ze zrekombinowanym genem kalbindyny nie różniły się od zwierząt
kontrolnych podczas obserwacji w standardowych warunkach hodowlanych. Dalsza
analiza z zastosowaniem testu otwartego pola również nie wykazała zmian zachowania
myszy spowodowanych wyłączeniem ekspresji kalbindyny w komórkach Purkinjego. W
trakcie następnego etapu badań analizowałem koordynację ruchową zwierząt podczas
testu na bieżni z przeszkodami oraz testu na równoważni. Oba testy wymagają
przystosowania motoryki do nowych, nieznanych warunków. Otrzymane wyniki
pokazały wyraźne upośledzenie sprawności ruchowej spowodowane brakiem kalbindyny
w komórkach Purkinjego. Jednak poprawa wyników podczas kolejnych dni testu
wskazywała na zachowaną zdolność do uczenia się. Zmiany spowodowane zakłóceniem
funkcji komórek Purkinjego widoczne były również w przypadku odruchów
wzrokowych. Odruchy optokinetyczny i przedsionkowo-wzrokowy charakteryzowały się
obniżoną amplitudą, przy czym odruch przedsionkowo-wzrokowy badany w ciemności
nie wykazywał żadnych odchyleń od normy. Sugeruje to zaburzenie percepcji bodźców
wizualnych docierających do kory móżdżku.
Przeprowadzona została również analiza hamowania długotrwałego w skrawkach
pochodzących od zwierząt ze zmutowanym genem kalbindyny. Otrzymane wyniki
wykazały normalne LTD utrzymujące się przez co najmniej 50 min po jego wywołaniu.
Ostatni etap badań zwierząt-mutantów obejmował analizę wahań stężenia jonów
2+
Ca
w komórkach Purkinjego po ich stymulacji poprzez włókna równoległe lub pnące.
Stymulacja pojedynczym impulsem aplikowana poprzez włókna równoległe prowadzi do
91
Streszczenie
szybkiego wzrostu stężenia jonów Ca2+ w komórkach Purkinjego. Zjawisko to związane
jest z aktywacją receptorów AMPA i definiowane jest jako wczesne synaptyczne
wahania stężenia jonów Ca2+ - ESCT. Można je analizować poprzez pomiar amplitudy i
stałej czasowej. Analiza tych wartości w komórkach Purkinjego pozbawionych
kalbindyny wykazała, iż amplituda wahań [Ca2+]i w tych neuronach była 2- do 3-krotnie
wyższa niż to miało miejsce w przypadku neuronów zwierząt kontrolnych, natomiast
stała czasowa była 3- do 4-krotnie mniejsza.
Zjawisko ESCT można również wywołać poprzez stymulację włókien pnących.
Ocena amplitudy
w tym przypadku wykazała jej 80% wzrost w komórkach
pozbawionych kalbindyny. Eksperyment ten wykazał również 50% redukcję stałej
czasowej.
Analiza zmian stężenia jonów Ca2+ obejmowała również inny rodzaj wahań, będący
efektem powtarzającej się stymulacji włókien równoległych. Wzrost stężenia jonów
wapniowych widoczny jest w tym przypadku dopiero po upływie 200 ms od
zastosowania bodźca i określany jest jako późne synaptyczne wahania stężenia jonów
Ca2+ - DSCT. Porównanie stałych czasowych obliczonych dla komórek Purkinjego
pozbawionych kalbindyny i komórek pochodzących od zwierząt kontrolnych wykazało
brak zaburzeń DSCT spowodowanych brakiem kalbindyny D-28k.
Na podstawie otrzymanych wyników mogłem stwierdzić, iż brak kalbindyny w
komórkach Purkinjego myszy powoduje bardzo specyficzne zaburzenie sygnalizacji
wapniowej zależnej od aktywacji receptorów AMPA przy jednoczesnym zachowaniu
niezmienionego procesu hamowania długotrwałego – LTD. Prowadzi to w efekcie do
dysfunkcji koordynacji ruchowej przy jednoczesnym, przynajmniej częściowym,
zachowaniu zdolności do uczenia motorycznego.
92
8. Summary
Calbindin-D28k (calbindin) is a member of the 'EF-hand' family of intracellular
calcium-binding proteins [159]. It is expressed in many neurons throughout the central nervous
system without general preference for functionally or morphologically defined subpopulations
[12, 35]. Calbindin and related calcium-binding proteins can modulate intracellular calcium
signaling by acting as calcium buffer [80, 136]. General calbindin mutants display a distinct and
permanent motor discoordination which is revealed only when adaptation of movement to novel
environmental conditions is required [2]. In the cerebellum, a brain region regarded a key player
in central aspects of motor coordination, calbindin is abundantly expressed exclusively in
Purkinje cells.
Here, I applied the Cre/loxP recombination system to selectively delete calbindin
expression in cerebellar Purkinje cells. Obtained mutant mice display marked permanent deficits
of motor coordination and sensory processing. This occurs in the absence of alterations in a form
of LTD implicated in the control of behavior. Analysis of synaptically-evoked calcium transients
in spines and dendrites of Purkinje cells demonstrated an alteration of time-course and amplitude
of fast calcium transients after parallel or climbing fiber stimulation. By contrast, the delayed
mGluR-mediated calcium transients were normal. Presented results reveal a unique role of
Purkinje cell calbindin in a specific form of motor control, and suggest that rapid calcium
buffering may directly control behaviorally relevant neuronal signal integration.
93
Bibliografia
8. Bibliografia
1. Aiba,A.,
Kano,M.,
Chen,C.,
Stanton,M.E.,
Fox,G.D.,
Herrup,K.,
Zwingman,T.A., and Tonegawa,S. (1994). Deficient cerebellar long-term
depression and impaired motor learning in mGluR1 mutant mice. Cell 79, 377388.
2. Airaksinen,M.S., Eilers,J., Garaschuk,O., Thoenen,H., Konnerth,A., and
Meyer,M. (1997). Ataxia and altered dendritic calcium signaling in mice
carrying a targeted null mutation of the calbindin d28k gene. PNAS 94, 14881493.
3. Airaksinen,M.S., Thoenen,H., and Meyer,M. (1997). Vulnerability of midbrain
dopaminergic-neurons in calbindin-d- 28k-deficient mice - lack of evidence for
a neuroprotective role of endogenous calbindin in mptp-treated and weaver
mice. Eur. J. Neurosci. 9, 120-127.
4. Albin,R.L. (2003). Dominant ataxias and Friedreich ataxia: an update. Curr.
Opin. Neurol. 16, 507-514.
5. Albus,J. (1971). A theory of cerebellar functions. Math. Biosci. 10, 25-61.
6. Allbritton,N.L., Meyer,T., and Stryer,L. (1992). Range of messenger action of
calcium ion and inositol 1,4,5-trisphosphate. Science 258, 1812-1815.
7. Andressen,C., Blumcke,I., and Celio,M.R. (1993). Calcium-binding proteins:
selective markers of nerve cells. Cell Tissue Res. 271, 181-208.
8. Armengol,J.A., Sotelo,C., Angaut,P., and Alvarado-Mallart,R.M. (1989).
Organization of Host Afferents to Cerebellar Grafts Implanted into Kainate
Lesioned Cerebellum in Adult Rats. Eur. J. Neurosci. 1, 75-93.
9. Athanasiou,M.C., Yunis,W., Coleman,N., Ehlenfeldt,R., Clark,H.B., Orr,H.T.,
and Feddersen,R.M. (1998). The transcription factor E2F-1 in SV40 T antigeninduced cerebellar Purkinje cell degeneration. Mol. Cell. Neurosci 12, 16-28.
10. Baba-Aissa,F.,
Raeymaekers,L.,
Wuytack,F.,
Callewaert,G.,
Dode,L.,
Missiaen,L., and Casteels,R. (1996). Purkinje neurons express the SERCA3
isoform of the organellar type Ca(2+)-transport ATPase. Brain Res. Mol. Brain
Res. 41, 169-174.
11. Baimbridge,K.G., Miller,J.J., and Parkes,C.O. (1982). Calcium-binding protein
distribution in the rat brain. Brain Res. 239, 519-525.
94
Jaroslaw-Jerzy Barski
12. Baimbridge,K.G., Celio,M.R., and Rogers,J.H. (1992). Calcium-binding
proteins in the nervous system. [Review]. Trends Neurosci. 15, 303-308.
13. Barski,J.J., Dethleffsen,K., and Meyer,M. (2000). Cre recombinase expression
in cerebellar Purkinje cells. Genesis 28, 93-98.
14. Barski,J.J., Lauth,M., and Meyer,M. (2002). Genetic targeting of cerebellar
Purkinje cells: History, current status and novel strategies [Review]. The
Cerebellum 1, 111-118.
15. Barski,J.J., Morl,K., and Meyer,M. (2002). Conditional inactivation of the
calbindin D-28k (Calb1) gene by Cre/loxP-mediated recombination. Genesis 32,
165-168.
16. Barski,J.J., Hartmann,J., Rose,C.R., Hoebeek,F., Morl,K., Noll-Hussong,M., De
Zeeuw,C.I., Konnerth,A., and Meyer,M. (2003). Calbindin in cerebellar Purkinje
cells is a critical determinant of the precision of motor coordination. J. Neurosci.
23, 3469-3477.
17. Berggard,T., Szczepankiewicz,O., Thulin,E., and Linse,S. (2002). Myo-inositol
monophosphatase is an activated target of calbindin D28k. J. Biol. Chem. 277,
41954-41959.
18. Berggard,T., Miron,S., Onnerfjord,P., Thulin,E., Akerfeldt,K.S., Enghild,J.J.,
Akke,M., and Linse,S. (2002). Calbindin D28k exhibits properties characteristic
of a Ca2+ sensor. J. Biol. Chem. 277, 16662-16672.
19. Berrebi,A.S., Oberdick,J., Sangameswaran,L., Christakos,S., Morgan,J.I., and
Mugnaini,E. (1991). Cerebellar Purkinje cell markers are expressed in retinal
bipolar neurons. J. Comp. Neurol. 308, 630-649.
20. Berridge,M.J., Lipp,P., and Bootman,M.D. (2000). The versatility and
universality of calcium signalling. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1, 11-21.
21. Blaustein,M.P. and Lederer,W.J. (1999). Sodium/calcium exchange: its
physiological implications. Physiol Rev. 79, 763-854.
22. Bloedel,J.R. and Bracha,V. (1997). Duality of cerebellar motor and cognitive
functions. Int. Rev. Neurobiol. 41, 613-634.
23. Bouslama-Oueghlani,L., Wehrle,R., Sotelo,C., and Dusart,I. (2003). The
developmental loss of the ability of Purkinje cells to regenerate their axons
occurs in the absence of myelin: an in vitro model to prevent myelination. J.
Neurosci. 23, 8318-8329.
95
Bibliografia
24. Braitenberg,V., Heck,D., and Sultan,F. (1997). The detection and generation of
sequences as a key to cerebellar function: experiments and theory. Behav. Brain
Sci. 20, 229-245.
25. Braz,J.M., Rico,B., and Basbaum,A.I. (2002). Transneuronal tracing of diverse
CNS circuits by Cre-mediated induction of wheat germ agglutinin in transgenic
mice. PNAS 99, 15148-15153.
26. Buffo,A.,
Holtmaat,A.J.D.G.,
Savio,T.,
Verbeek,J.S.,
Oberdick,J.,
Oestreicher,A.B., Gispen,W.H., Verhaagen,J., Rossi,F., and Strata,P. (1997).
Targeted overexpression of the neurite growth-associated protein b-50/gap-43 in
cerebellar purkinje-cells induces sprouting after axotomy but not axon
regeneration into growth- permissive transplants. J. Neurosci. 17, 8778-8791.
27. Burright,E.N.,
Clark,H.B.,
Servadio,A.,
Matilla,T.,
Feddersen,R.M.,
Yunis,W.S., Duvick,L.A., Zoghbi,H.Y., and Orr,H.T. (1995). Sca1 transgenic
mice - a model for neurodegeneration caused by an expanded cag trinucleotide
repeat. Cell 82, 937-948.
28. Burright,E.N.,
Clark,H.B.,
Servadio,A.,
Matilla,T.,
Feddersen,R.M.,
Yunis,W.S., Duvick,L.A., Zoghbi,H.Y., and Orr,H.T. (1995). Sca1 transgenic
mice - a model for neurodegeneration caused by cag trinucleotide expansion.
Am. J. Hum. Genet. 57, 8.
29. Cabeza,R. and Nyberg,L. (2000). Imaging cognition II: An empirical review of
275 PET and fMRI studies. J. Cogn. Neurosci. 12, 1-47.
30. Caillard,O., Moreno,H., Schwaller,B., Llano,I., Celio,M.R., and Marty,A.
(2000). Role of the calcium-binding protein parvalbumin in short-term synaptic
plasticity. PNAS 97, 13372-13377.
31. Callewaert,G., Eilers,J., and Konnerth,A. (1996). Axonal calcium entry during
fast 'sodium' action potentials in rat cerebellar Purkinje neurones. J. Physiol. 495
( Pt 3), 641-647.
32. Candland,D.K. and Nagy,Z.M. (1969). The open field: some comparative data.
Ann. N. Y. Acad. Sci. 159, 831-851.
33. Casaccia-Bonnefil,P., Kascsak,R.J., Fersko,R., Callahan,S., and Carp,R.I.
(1993). Brain regional distribution of prion protein PrP27-30 in mice
stereotaxically microinjected with different strains of scrapie. J. Infect. Dis. 167,
7-12.
96
34. Ceci,J.D. (1994). Mouse chromosome 8. Mamm. Genome 5, S124-S138.
35. Celio,M.R. (1990). Calbindin D-28k and parvalbumin in the rat nervous system.
Neuroscience 35, 375-475.
36. Chan-Palay,V. (1983). Immunocytochemical and autoradiographic methods to
demonstrate the coexistence of neuroactive substance: cerebellar Purkinje cells
have glutamic acid decarboxylase, cysteine sulfinic acid decarboxylase, and
motilin immunoreactivity. Acta Morphol. Hung. 31, 193-212.
37. Chard,P.S., Bleakman,D., Christakos,S., Fullmer,C.S., and Miller,R.J. (1993).
Calcium buffering properties of calbindin D28k and parvalbumin in rat sensory
neurones. J. Physiol 472, 341-357.
38. Chard,P.S., Jordan,J., Marcuccilli,C.J., Miller,R.J., Leiden,J.M., Roos,R.P., and
Ghadge,G.D. (1995). Regulation of excitatory transmission at hippocampal
synapses by calbindin D28k. PNAS 92 , 5144-5148.
39. Cheung,W.T., Richards,D.E., and Rogers,J.H. (1993). Calcium binding by chick
calretinin and rat calbindin D28k synthesised in bacteria. Eur. J. Biochem. 215,
401-410.
40. Christakos,S., Gabrielides,C., and Rhoten,W.B. (1989). Vitamin D-dependent
calcium binding proteins: chemistry, distribution, functional considerations, and
molecular biology. [Review] [251 refs]. Endocr. Rev. 10, 3-26.
41. Clark,H.B., Burright,E.N., Yunis,W.S., Larson,S., Wilcox,C., Hartman,B.,
Matilla,A., Zoghbi,H.Y., and Orr,H.T. (1997). Purkinje-cell expression of a
mutant allele of sca1 in transgenic mice leads to disparate effects on motor
behaviors, followed by a progressive cerebellar dysfunction and histological
alterations. J. Neurosci. 17, 7385-7395.
42. Conquet,F., Bashir,Z.I., Davies,C.H., Daniel,H., Ferraguti,F., Bordi,F., FranzBacon,K., Reggiani,A., Matarese,V., Conde,F., and . (1994). Motor deficit and
impairment of synaptic plasticity in mice lacking mGluR1. Nature 372, 237-243.
43. Courchesne,E. and Allen,G. (1997). Prediction and preparation, fundamental
functions of the cerebellum. Learn. Mem. 4, 1-35.
44. Damji,K.F., Allingham,R.R., Pollock,S.C., Small,K., Lewis,K.E., Stajich,J.M.,
Yamaoka,L.H.,
Vance,J.M.,
and
Pericak-Vance,M.A.
(1996).
Periodic
vestibulocerebellar ataxia, an autosomal dominant ataxia with defective smooth
97
Bibliografia
pursuit, is genetically distinct from other autosomal dominant ataxias. Arch.
Neurol. 53, 338-344.
45. Daniel,H., Levenes,C., and Crepel,F. (1998). Cellular mechanisms of cerebellar
LTD. Trends Neurosci. 21, 401-407.
46. De Schutter,E. and Maex,R. (1996). The cerebellum: cortical processing and
theory. Curr. Opin. Neurobiol. 6, 759-764.
47. de Talamoni,N., Smith,C.A., Wasserman,R.H., Beltramino,C., Fullmer,C.S., and
Penniston,J.T. (1993). Immunocytochemical localization of the plasma
membrane calcium pump, calbindin-D28k, and parvalbumin in Purkinje cells of
avian and mammalian cerebellum. PNAS 90, 11949-11953.
48. De Zeeuw,C.I., Hansel,C., Bian,F., Koekkoek,S.K., van Alphen,A.M.,
Linden,D.J., and Oberdick,J. (1998). Expression of a protein kinase C inhibitor
in Purkinje cells blocks cerebellar LTD and adaptation of the vestibulo-ocular
reflex. Neuron 20, 495-508.
49. De Zeeuw,C.I., van Alphen,A.M., Koekkoek,S.K., Buharin,E., Coesmans,M.P.,
Morpurgo,M.M., and van den Burg,J. (1998). Recording eye movements in
mice: a new approach to investigate the molecular basis of cerebellar control of
motor learning and motor timing. Otolaryngol. Head. Neck. Surg 119, 193-203.
50. Dieudonne,S. and Dumoulin,A. (2000). Serotonin-driven long-range inhibitory
connections in the cerebellar cortex. J. Neurosci. 20, 1837-1848.
51. Dino,M.R., Willard,F.H., and Mugnaini,E. (1999). Distribution of unipolar
brush cells and other calretinin immunoreactive components in the mammalian
cerebellar cortex. J. Neurocytol. 28, 99-123.
52. Dino,M.R., Nunzi,M.G., Anelli,R., and Mugnaini,E. (2000). Unipolar brush
cells of the vestibulocerebellum: afferents and targets. Prog. Brain Res. 124,
123-137.
53. Eilers,J., Augustine,G.J., and Konnerth,A. (1995). Subthreshold synaptic Ca2+
signalling in fine dendrites and spines of cerebellar Purkinje neurons. Nature
373, 155-158.
54. Eilers,J., Plant,T., and Konnerth,A. (1996). Localized calcium signalling and
neuronal integration in cerebellar Purkinje neurones. Cell Calcium 20, 215-226.
55. Fässler,R. and Meyer,M. (1995). Consequences of lack of beta 1 integrin gene
expression in mice. Genes Dev. 9, 1896-1908.
98
56. Feddersen,R.M., Ehlenfeldt,R., Yunis,W.S., Clark,H.B., and Orr,H.T. (1992).
Disrupted cerebellar cortical development and progressive degeneration of
Purkinje cells in SV40 T antigen transgenic mice. Neuron 9, 955-966.
57. Feddersen,R.M., Clark,H.B., Yunis,W.S., and Orr,H.T. (1995). In vivo viability
of postmitotic Purkinje neurons requires pRb family member function. Mol.
Cell. Neurosci. 6, 153-167.
58. Feddersen,R.M., Yunis,W.S., O'Donnell,M.A., Ebner,T.J., Shen,L., Iadecola,C.,
Orr,H.T., and Clark,H.B. (1997). Susceptibility to cell death induced by mutant
SV40 T-antigen correlates with Purkinje neuron functional development. Mol.
Cell. Neurosci. 9, 42-62.
59. Feher,J.J., Fullmer,C.S., and Wasserman,R.H. (1992). Role of facilitated
diffusion of calcium by calbindin in intestinal calcium absorption. Am. J.
Physiol. 262, C517-C526.
60. Feil,R., Hartmann,J., Luo,C., Wolfsgruber,W., Schilling,K., Feil,S., Barski,J.J.,
Meyer,M., Konnerth,A., De Zeeuw,C.I., and Hofmann,F. (2003). Impairment of
LTD and cerebellar learning by Purkinje cell-specific ablation of cGMPdependent protein kinase I. J. Cell Biol.
61. Fierro,L. and Llano,I. (1996). High endogenous calcium buffering in Purkinje
cells from rat cerebellar slices. J. Physiol. 496 ( Pt 3), 617-625.
62. Fierro,L., DiPolo,R., and Llano,I. (1998). Intracellular calcium clearance in
Purkinje cell somata from rat cerebellar slices. J. Physiol. 510 ( Pt 2), 499-512.
63. Finch,E.A. and Augustine,G.J. (1998). Local calcium signalling by inositol1,4,5-trisphosphate in Purkinje cell dendrites. Nature 396, 753-756.
64. Fletcher,C., Norman,D.J., Germond,E., and Heintz,N. (1991). A multilocus
linkage map of mouse chromosome 8. Genomics 9, 737-741.
65. Floris,A., Dino,M., Jacobowitz,D.M., and Mugnaini,E. (1994). The unipolar
brush cells of the rat cerebellar cortex and cochlear nucleus are calretininpositive: a study by light and electron microscopic immunocytochemistry. Anat.
Embryol. (Berl) 189, 495-520.
66. Forsberg,E.,
Hirsch,E.,
Frohlich,L.,
Meyer,M.,
Ekblom,P.,
Aszodi,A.,
Werner,S., and Fassler,R. (1996). Skin wounds and severed nerves heal
normally in mice lacking tenascin-C. PNAS 93, 6594-6599.
99
Bibliografia
67. Frantz,G.D. and Tobin,A.J. (1994). Cellular distribution of calbindin D28K
mRNAs in the adult mouse brain. J. Neurosci. Res. 37, 287-302.
68. Garcia,M.L. and Strehler,E.E. (1999). Plasma membrane calcium ATPases as
critical regulators of calcium homeostasis during neuronal cell function. Front.
Biosci. 4, D869-D882.
69. Geula,C., Nagykery,N., Wu,C.K., and Bu,J. (2003). Loss of calbindin-D28K
from aging human cholinergic basal forebrain: relation to plaques and tangles. J.
Neuropathol. Exp. Neurol. 62, 605-616.
70. Gillessen,T., Grasshoff,C., and Szinicz,L. (2002). Mitochondrial permeability
transition can be directly monitored in living neurons. Biomed. Pharmacother.
56, 186-193.
71. Goossens,J., Daniel,H., Rancillac,A., van der,S.J., Oberdick,J., Crepel,F., De
Zeeuw,C.I., and Frens,M.A. (2001). Expression of protein kinase C inhibitor
blocks cerebellar long-term depression without affecting Purkinje cell
excitability in alert mice. J. Neurosci. 21, 5813-5823.
72. Gorcs,T.J.,
Penke,B.,
Boti,Z.,
Katarova,Z.,
and
Hamori,J.
(1993).
Immunohistochemical visualization of a metabotropic glutamate receptor.
NeuroReport 4, 283-286.
73. Grusser-Cornehls,U. and Baurle,J. (2001). Mutant mice as a model for
cerebellar ataxia. Prog. Neurobiol. 63, 489-540.
74. Gu,H.,
Zou,Y.-R.,
and
Rajewsky,K.
(1993).
Independent
control
of
immonoglobulin switch recombination at individual switch regions evidenced
through Cre-loxP-mediated gene targeting. Cell 73, 1155-1164.
75. Guerini,D., Garcia-Martin,E., Zecca,A., Guidi,F., and Carafoli,E. (1998). The
calcium pump of the plasma membrane: membrane targeting, calcium binding
sites, tissue-specific isoform expression. Acta Physiol. Scand. Suppl. 643, 265273.
76. Haiech,J., Derancourt,J., Pechere,J.F., and Demaille,J.G. (1979). Magnesium
and calcium binding to parvalbumins: evidence for differences between
parvalbumins and an explanation of their relaxing function. Biochemistry 18,
2752-2758.
100
77. Hamada,T., Lesauter,J., Lokshin,M., Romero,M.T., Yan,L., Venuti,J.M., and
Silver,R.
(2003).
Calbindin
influences
response
to
photic
input
in
suprachiasmatic nucleus. J. Neurosci. 23, 8820-8826.
78. Hartell,N.A. (2002). Parallel fiber plasticity. The Cerebellum 1, 3-18.
79. Hatton,G.I. (1990). Emerging concepts of structure-function dynamics in adult
brain: the hypothalamo-neurohypophysial system. [Review]. Prog. Neurobiol.
34, 437-504.
80. Heizmann,C.W. and Braun,K. (1992). Changes in Ca(2+)-binding proteins in
human neurodegenerative disorders. Trends Neurosci. 15, 259-264.
81. Holmes,G. (1939). The cerebellum of man. Brain 62.
82. Hou,T.T., Johnson,J.D., and Rall,J.A. (1991). Parvalbumin content and Ca2+
and Mg2+ dissociation rates correlated with changes in relaxation rate of frog
muscle fibres. J. Physiol. 441, 285-304.
83. Houk,J.C. (1997). On the role of the cerebellum and basal ganglia in cognitive
signal processing. Prog. Brain Res. 114, 543-552.
84. Ichise,T., Kano,M., Hashimoto,K., Yanagihara,D., Nakao,K., Shigemoto,R.,
Katsuki,M., and Aiba,A. (2000). mGluR1 in cerebellar purkinje cells essential
for long-term depression, synapse elimination, and motor coordination [In
Process Citation]. Science 288, 1832-1835.
85. Inoue,T., Kato,K., Kohda,K., and Mikoshiba,K. (1998). Type 1 inositol 1,4,5trisphosphate receptor is required for induction of long-term depression in
cerebellar Purkinje neurons. J. Neurosci. 18, 5366-5373.
86. Inoue,T., Lin,X., Kohlmeier,K.A., Orr,H.T., Zoghbi,H.Y., and Ross,W.N.
(2001). Calcium dynamics and electrophysiological properties of cerebellar
purkinje cells in sca1 transgenic mice. J. Neurophysiol. 85, 1750-1760.
87. Ito,M. (2000). Mechanisms of motor learning in the cerebellum. Brain Res. 886,
237-245.
88. Ito,M. (2001). Cerebellar long-term depression: characterization, signal
transduction, and functional roles. Physiol. Rev. 81, 1143-1195.
89. Ito,M. (2002). The molecular organization of cerebellar long-term depression.
Nat. Rev. Neurosci. 3, 896-902.
90. Jande,S.S., Maler,L., and Lawson,D.E. (1981). Immunohistochemical mapping
of vitamin D-dependent calcium-binding protein in brain. Nature 294, 765-767.
101
Bibliografia
91. Jobst,E.E. and Allen,C.N. (2002). Calbindin neurons in the hamster
suprachiasmatic nucleus do not exhibit a circadian variation in spontaneous
firing rate. Eur. J. Neurosci. 16, 2469-2474.
92. Jones,B.J. and Roberts,D.J. (1968). The quantiative measurement of motor incoordination in naive mice using an acelerating rotarod. J. Pharm. Pharmacol. 20,
302-304.
93. Jouvenceau,A., Potier,B., Battini,R., Ferrari,S., Dutar,P., and Billard,J.M.
(1999). Glutamatergic synaptic responses and long-term potentiation are
impaired in the CA1 hippocampal area of calbindin D(28k)-deficient mice.
Synapse 33, 172-180.
94. Kano,M., Hashimoto,K., Chen,C., Abeliovich,A., Aiba,A., Kurihara,H.,
Watanabe,M., Inoue,Y., and Tonegawa,S. (1995). Impaired synapse elimination
during cerebellar development in PKC gamma mutant mice. Cell 83, 1223-1231.
95. Kano,M., Hashimoto,K., Watanabe,M., Kurihara,H., Offermanns,S., Jiang,H.,
Wu,Y., Jun,K., Shin,H.S., Inoue,Y., Simon,M.I., and Wu,D. (1998).
Phospholipase cbeta4 is specifically involved in climbing fiber synapse
elimination in the developing cerebellum. PNAS 95, 15724-15729.
96. Kashiwabuchi,N., Ikeda,K., Araki,K., Hirano,T., Shibuki,K., Takayama,C.,
Inoue,Y., Kutsuwada,T., Yagi,T., and Kang,Y. (1995). Impairment of motor
coordination, Purkinje cell synapse formation, and cerebellar long-term
depression in GluR delta 2 mutant mice. Cell 81, 245-252.
97. Kawasaki,H., Nakayama,S., and Kretsinger,R.H. (1998). Classification and
evolution of EF-hand proteins. Biometals 11, 277-295.
98. Kellendonk,C., Troche,F., Casanova,E., Anlag,K., Opherk,C., and Schutz,G.
(1999). Inducible site-specific recombination in the brain. J. Mol. Biol. 285,
175-182.
99. Kim,Y.S., Carp,R.I., Callahan,S.M., and Wisniewski,H.M. (1990). Pathogenesis
and pathology of scrapie after stereotactic injection of strain 22L in intact and
bisected cerebella. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 49, 114-121.
100. Klapstein,G.J.,
Vietla,S.,
Lieberman,D.N.,
Gray,P.A.,
Airaksinen,M.S.,
Thoenen,H., Meyer,M., and Mody,I. (1998). Calbindin-D28k fails to protect
hippocampal neurons against ischemia in spite of its cytoplasmic calcium
102
buffering
properties:
evidence
from
calbindin-D28k
knockout
mice.
Neuroscience 85, 361-373.
101. Klement,I.A., Skinner,P.J., Kaytor,M.D., Yi,H., Hersch,S.M., Clark,H.B.,
Zoghbi,H.Y.,
and
Orr,H.T.
(1998).
Ataxin-1
nuclear-localization
and
aggregation - role in polyglutamine-induced disease in sca1 transgenic mice.
Cell 95, 41-53.
102. Koekkoek,S.K., Alphen,A.M., vd,B.J., Grosveld,F., Galjart,N., and De
Zeeuw,C.I. (1997). Gain adaptation and phase dynamics of compensatory eye
movements in mice. Genes Funct. 1, 175-190.
103. Kohda,K., Inoue,T., and Mikoshiba,K. (1995). Ca2+ release from Ca2+ stores,
particularly from ryanodine-sensitive Ca2+ stores, is required for the induction
of LTD in cultured cerebellar Purkinje cells. J. Neurophysiol. 74, 2184-2188.
104. Konnerth,A., Llano,I., and Armstrong,C.M. (1990). Synaptic currents in
cerebellar Purkinje cells. PNAS 87, 2662-2665.
105. Konnerth,A., Dreessen,J., and Augustine,G.J. (1992). Brief dendritic calcium
signals initiate long-lasting synaptic depression in cerebellar Purkinje cells.
PNAS 89, 7051-7055.
106. Kosaka,T., Kosaka,K., Nakayama,T., Hunziker,W., and Heizmann,C.W. (1993).
Axons and axon terminals of cerebellar Purkinje cells and basket cells have
higher levels of parvalbumin immunoreactivity than somata and dendrites:
quantitative analysis by immunogold labeling. Exp. Brain Res. 93, 483-491.
107. Kose,A., Saito,N., Ito,H., Kikkawa,U., Nishizuka,Y., and Tanaka,C. (1988).
Electron microscopic localization of type I protein kinase C in rat Purkinje cells.
J. Neurosci. 8, 4262-4268.
108. Kretsinger,R.H. and Nockolds,C.E. (1973). Carp muscle calcium-binding
protein. II. Structure determination and general description. J. Biol. Chem. 248,
3313-3326.
109. Kuhn,R. and Torres,R.M. (2002). Cre/loxP recombination system and gene
targeting. Methods Mol. Biol. 180, 175-204.
110. Kuwajima,G., Futatsugi,A., Niinobe,M., Nakanishi,S., and Mikoshiba,K.
(1992). Two types of ryanodine receptors in mouse brain: skeletal muscle type
exclusively in Purkinje cells and cardiac muscle type in various neurons. Neuron
9, 1133-1142.
103
Bibliografia
111. Le,Y. and Sauer,B. (2000). Conditional gene knockout using cre recombinase.
Methods Mol. Biol. 136, 477-485.
112. Lederer,W.J., He,S., Luo,S., duBell,W., Kofuji,P., Kieval,R., Neubauer,C.F.,
Ruknudin,A., Cheng,H., Cannell,M.B., Rogers,T.B., and Schulze,D.H. (1996).
The molecular biology of the Na(+)-Ca2+ exchanger and its functional roles in
heart, smooth muscle cells, neurons, glia, lymphocytes, and nonexcitable cells.
Ann. N. Y. Acad. Sci. 779, 7-17.
113. Lee,S.H., Schwaller,B., and Neher,E. (2000). Kinetics of Ca2+ binding to
parvalbumin in bovine chromaffin cells: implications for [Ca2+] transients of
neuronal dendrites. J. Physiol. 525 Pt 2, 419-432.
114. Lesauter,J., Stevens,P., Jansen,H., Lehman,M.N., and Silver,R. (1999).
Calbindin expression in the hamster SCN is influenced by circadian genotype
and by photic conditions. NeuroReport 10, 3159-3163.
115. Lesauter,J., Kriegsfeld,L.J., Hon,J., and Silver,R. (2002). Calbindin-D(28K)
cells selectively contact intra-SCN neurons. Neuroscience 111, 575-585.
116. Lev-Ram,V., Wong,S.T., Storm,D.R., and Tsien,R.Y. (2002). A new form of
cerebellar long-term potentiation is postsynaptic and depends on nitric oxide but
not cAMP. PNAS 99, 8389-8393.
117. Li-Smerin,Y., Levitan,E.S., and Johnson,J.W. (2001). Free intracellular Mg(2+)
concentration and inhibition of NMDA responses in cultured rat neurons. J.
Physiol. 533, 729-743.
118. Li,Z.H., Decavel,C., and Hatton,G.I. (1995). Calbindin-d-28k - role in
determining intrinsically generated firing patterns in rat supraoptic neurons. J.
Physiol. 488, 601-608.
119. Llano,I., DiPolo,R., and Marty,A. (1994). Calcium-induced calcium release in
cerebellar Purkinje cells. Neuron 12, 663-673.
120. Lledo,P.M., Somasundaram,B., Morton,A.J., Emson,P.C., and Mason,W.T.
(1992). Stable transfection of calbindin-D28k into the GH3 cell line alters
calcium currents and intracellular calcium homeostasis. Neuron 9, 943-954.
121. Llinas,R. and Sugimori,M. (1980). Electrophysiological properties of in vitro
Purkinje cell dendrites in mammalian cerebellar slices. J. Physiol. 305, 197-213.
122. Llinas,R. and Sugimori,M. (1980). Electrophysiological properties of in vitro
Purkinje cell somata in mammalian cerebellar slices. J. Physiol. 305, 171-195.
104
123. Llinas,R. and Welsh,J.P. (1993). On the cerebellum and motor learning. Curr.
Opin. Neurobiol. 3, 958-965.
124. Llinas,R., Lang,E.J., and Welsh,J.P. (1997). The cerebellum, LTD, and memory:
alternative views. Learn. Mem. 3, 445-455.
125. Luo,Y. and Denker,B.M. (1999). Interaction of heterotrimeric G protein galphao
with purkinje cell protein-2. Evidence for a novel nucleotide exchange factor. J.
Biol. Chem. 274, 10685-10688.
126. Mack,A., Sauer,B., Abremski,K., and Hoess,R. (1992). Stoichiometry of the Cre
recombinase bound to the lox recombining site. Nucleic Acids Res. 20, 44514455.
127. Maeda,H., Ellis-Davies,G.C., Ito,K., Miyashita,Y., and Kasai,H. (1999).
Supralinear Ca2+ signaling by cooperative and mobile Ca2+ buffering in
Purkinje neurons. Neuron 24, 989-1002.
128. Marino,S., Krimpenfort,P., Leung,C., van der Korput,H.A.G.M., Trapman,J.,
Camenisch,I., Berns,A., and Brandner,S. (2002). PTEN is essential for cell
migration but not for fate determination and tumourigenesis in the cerebellum.
Development 129, 3513-3522.
129. Marr,D. (1969). A theory of cerebellar cortex. J. Physiol. 202, 437-470.
130. Martin,L.J., Blackstone,C.D., Huganir,R.L., and Price,D.L. (1992). Cellular
localization of a metabotropic glutamate receptor in rat brain. Neuron 9, 259270.
131. Matsuda,S., Launey,T., Mikawa,S., Hirai,H., Ampa,r., Cluster, Glur, Ltd, and
Purkinje,c. (2000). Disruption of AMPA receptor GluR2 clusters following
long-term depression induction in cerebellar Purkinje neurons. EMBO J. 19,
2765-2774.
132. Matsumoto,M., Nakagawa,T., Inoue,T., Nagata,E., Tanaka,K., Takano,H.,
Minowa,O., Kuno,J., Sakakibara,S., Yamada,M., Yoneshima,H., Miyawaki,A.,
Fukuuchi,Y., Furuichi,T., Okano,H., Mikoshiba,K., and Noda,T. (1996). Ataxia
and epileptic seizures in mice lacking type 1 inositol 1,4,5-trisphosphate
receptor. Nature 379, 168-171.
133. Mauk,M.D., Medina,J.F., Nores,W.L., and Ohyama,T. (2000). Cerebellar
function: Coordination, learning or timing? Curr. Biol. 10, R522-R525.
105
Bibliografia
134. Maylie,B., Bissonnette,E., Virk,M., Adelman,J.P., and Maylie,J.G. (2002).
Episodic ataxia type 1 mutations in the human Kv1.1 potassium channel alter
hKvbeta 1-induced N-type inactivation. J Neurosci. 22, 4786-4793.
135. Mikoshiba,K., Furuichi,T., and Miyawaki,A. (1994). Structure and function of
IP3 receptors. Semin. Cell Biol. 5, 273-281.
136. Miller,R.J. (1991). The control of neuronal Ca2+ homeostasis. Prog. Neurobiol.
37, 255-285.
137. Miyata,M., Finch,E.A., Khiroug,L., Hashimoto,K., Hayasaka,S., Oda,S.I.,
Inouye,M., Takagishi,Y., Augustine,G.J., and Kano,M. (2000). Local calcium
release in dendritic spines required for long-term synaptic depression. Neuron
28, 233-244.
138. Mohn,A.R., Feddersen,R.M., Nguyen,M.S., and Koller,B.H. (1997). Phenotypic
analysis of mice lacking the highly abundant Purkinje cell- and bipolar neuronspecific PCP2 protein. Mol. Cell. Neurosci. 9, 63-76.
139. Molinari,S., Battini,R., Ferrari,S., Pozzi,L., Killcross,A.S., Robbins,T.W.,
Jouvenceau,A., Billard,J.M., Dutar,P., Lamour,Y., Baker,W.A., Cox,H., and
Emson,P.C. (1996). Deficits in memory and hippocampal long-term potentiation
in mice with reduced calbindin D28K expression. PNAS 93, 8028-8033.
140. Morel,M.P., Dusart,I., and Sotelo,C. (2002). Sprouting of adult Purkinje cell
axons in lesioned mouse cerebellum: "Non-permissive" versus "permissive"
environment. J. Neurocytol. 31, 633-647.
141. Morris,R.G., Garrud,P., Rawlins,J.N., and O'Keefe,J. (1982). Place navigation
impaired in rats with hippocampal lesions. Nature 297, 681-683.
142. Murchison,D. and Griffith,W.H. (2000). Mitochondria buffer non-toxic calcium
loads and release calcium through the mitochondrial permeability transition pore
and sodium/calcium exchanger in rat basal forebrain neurons. Brain Res. 854,
139-151.
143. Mushiake,H. and Strick,P.L. (1993). Preferential activity of dentate neurons
during limb movements guided by vision. J. Neurophysiol. 70, 2660-2664.
144. Nagerl,U.V., Novo,D., Mody,I., and Vergara,J.L. (2000). Binding kinetics of
calbindin-D-28k determined by flash photolysis of caged Ca2+. Biophys. J. 79,
3009-3018.
106
145. Nagy,A., Rossant,J., Nagy,R., Abramow-Newerly,W., and Roder,J.C. (1993).
Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage
embryonic stem cells. PNAS 90, 8424-8428.
146. Natochin,M., Gasimov,K.G., and Artemyev,N.O. (2001). Inhibition of
GDP/GTP exchange on G alpha subunits by proteins containing G-protein
regulatory motifs. Biochemistry 40, 5322-5328.
147. Nolan,M.F., Malleret,G., Lee,K.H., Gibbs,E., Dudman,J.T., Santoro,B., Yin,D.,
Thompson,R.F., Siegelbaum,S.A., Kandel,E.R., and Morozov,A. (2003). The
hyperpolarization-activated HCN1 channel is important for motor learning and
neuronal integration by cerebellar Purkinje cells. Cell 115, 551-564.
148. Nordquist,D.T., Kozak,C.A., and Orr,H.T. (1988). cDNA cloning and
characterization of three genes uniquely expressed in cerebellum by Purkinje
neurons. J. Neurosci. 8, 4780-4789.
149. Oberdick,J.,
Levinthal,F.,
and
Levinthal,C.
(1988).
A
Purkinje
cell
differentiation marker shows a partial DNA sequence homology to the cellular
sis/PDGF2 gene. Neuron 1, 367-376.
150. Oberdick,J., Smeyne,R.J., Mann,J.R., Zackson,S., and Morgan,J.I. (1990). A
promoter that drives transgene expression in cerebellar Purkinje and retinal
bipolar neurons. Science 248, 223-226.
151. Oberdick,J.,
Schilling,K.,
Smeyne,R.J.,
Corbin,J.G.,
Bocchiaro,C.,
and
Morgan,J.I. (1993). Control of segment-like patterns of gene expression in the
mouse cerebellum. Neuron 10, 1007-1018.
152. Offermanns,S.,
Hashimoto,K.,
Watanabe,M.,
Sun,W.,
Kurihara,H.,
Thompson,R.F., Inoue,Y., Kano,M., and Simon,M.I. (1997). Impaired motor
coordination and persistent multiple climbing fiber innervation of cerebellar
Purkinje cells in mice lacking Galphaq. PNAS 94, 14089-14094.
153. Ogden,D. and Khodakhah,K. (1996). Intracellular Ca2+ release by InsP3 in
cerebellar Purkinje neurones. Acta Physiol. Scand. 157, 381-394.
154. Olson,J.M.,
Greenamyre,J.T.,
Penney,J.B.,
and
Young,A.B.
(1987).
Autoradiographic localization of cerebellar excitatory amino acid binding sites
in the mouse. Neuroscience 22, 913-923.
155. Pape,H.C. and Stork,O. (2003). Genes and mechanisms in the amygdala
involved in the formation of fear memory. Ann. N. Y. Acad. Sci. 985, 92-105.
107
Bibliografia
156. Parkins,E.J. (1997). Cerebellum and cerebrum in adaptive control and cognition:
a review. Biol. Cybern. 77, 79-87.
157. Passingham,R.E., Myers,C., Rawlins,N., Lightfoot,V., and Fearn,S. (1988).
Premotor cortex in the rat. Behav. Neurosci. 102, 101-109.
158. Pavlou,O.,
Ehlenfeldt,R.,
Horn,S.,
and
Orr,H.T.
(1996).
Isolation,
characterization and in-vivo analysis of the murine calbindin-d-28k upstream
regulatory region. Mol. Brain Res. 36, 268-279.
159. Persechini,A., Moncrief,N.D., and Kretsinger,R.H. (1989). The EF-hand family
of calcium-modulated proteins. [Review] [40 refs]. Trends Neurosci. 12, 462467.
160. Piedras-Renteria,E.S., Watase,K., Harata,N., Zhuchenko,O., Zoghbi,H.Y.,
Lee,C.C., and Tsien,R.W. (2001). Increased expression of alpha 1A Ca2+
channel currents arising from expanded trinucleotide repeats in spinocerebellar
ataxia type 6. J Neurosci. 21, 9185-9193.
161. Plogmann,D. and Celio,M.R. (1993). Intracellular concentration of parvalbumin
in nerve cells. Brain Res. 600, 273-279.
162. Pluck,A. (1996). Conditional mutagenesis in mice: the Cre/loxP recombination
system. Int. J. Exp. Pathol. 77, 269-278.
163. Rambold,H., Churchland,A., Selig,Y., Jasmin,L., and Lisberger,S.G. (2002).
Partial ablations of the flocculus and ventral paraflocculus in monkeys cause
linked deficits in smooth pursuit eye movements and adaptive modification of
the VOR. J. Neurophysiol. 87, 912-924.
164. Ray,M.K., Fagan,S.P., and Brunicardi,F.C. (2000). The Cre-loxP system: a
versatile tool for targeting genes in a cell- and stage-specific manner. Cell
Transplant. 9, 805-815.
165. Raymond,J.L., Lisberger,S.G., and Mauk,M.D. (1996). The cerebellum: a
neuronal learning machine? Science 272, 1126-1131.
166. Reifegerste,R., Grimm,S., Albert,S., Lipski,N., Heimbeck,G., Hofbauer,A.,
Pflugfelder,G.O., Quack,D., Reichmuth,C., Schug,B., and . (1993). An
invertebrate calcium-binding protein of the calbindin subfamily: protein
structure, genomic organization, and expression pattern of the calbindin-32 gene
of Drosophila. J. Neurosci. 13, 2186-2198.
108
167. Resibois,A.
and
Rogers,J.H.
(1992).
Calretinin
in
rat
brain:
an
immunohistochemical study. Neuroscience 46, 101-134.
168. Restituito,S., Thompson,R.M., Eliet,J., Raike,R.S., Riedl,M., Charnet,P., and
Gomez,C.M. (2000). The polyglutamine expansion in spinocerebellar ataxia
type 6 causes a beta subunit-specific enhanced activation of P/Q-type calcium
channels in Xenopus oocytes. J Neurosci. 20, 6394-6403.
169. Roberts,W.M. (1993). Spatial calcium buffering in saccular hair cells. Nature
363, 74-76.
170. Rogers,J.H. (1989). Immunoreactivity for calretinin and other calcium-binding
proteins in cerebellum. Neuroscience 31, 711-721.
171. Rose,C.R. and Konnerth,A. (2001). Stores not just for storage. intracellular
calcium release and synaptic plasticity. Neuron 31, 519-522.
172. Rossi,F., Jankovski,A., and Sotelo,C. (1995). Differential regenerative response
of Purkinje cell and inferior olivary axons confronted with embryonic grafts:
environmental cues versus intrinsic neuronal determinants. J. Comp Neurol.
359, 663-677.
173. Rozov,A., Burnashev,N., Sakmann,B., and Neher,E. (2001). Transmitter release
modulation by intracellular Ca2+ buffers in facilitating and depressing nerve
terminals of pyramidal cells in layer 2/3 of the rat neocortex indicates a target
cell-specific difference in presynaptic calcium dynamics. J. Physiol. 531, 807826.
174. Ryo,Y., Miyawaki,A., Furuichi,T., and Mikoshiba,K. (1993). Expression of the
metabotropic glutamate receptor mGluR1 alpha and the ionotropic glutamate
receptor GluR1 in the brain during the postnatal development of normal mouse
and in the cerebellum from mutant mice. J. Neurosci. Res. 36, 19-32.
175. Sakurai,M. (1990). Calcium is an intracellular mediator of the climbing fiber in
induction of cerebellar long-term depression. PNAS 87, 3383-3385.
176. Schiffmann,S.N.,
Cheron,G.,
Lohof,A.,
d'Alcantara,P.,
Meyer,M.,
Parmentier,M., and Schurmans,S. (1999). Impaired motor coordination and
Purkinje cell excitability in mice lacking calretinin. PNAS 96, 5257-5262.
177. Schmidt,E.E., Taylor,D.S., Prigge,J.R., Barnett,S., and Capecchi,M.R. (2000).
Illegitimate Cre-dependent chromosome rearrangements in transgenic mouse
spermatids. PNAS 97, 13702-13707.
109
Bibliografia
178. Seguier,J.M., Hunziker,W., Andressen,C., and Celio,M.R. (1990). Calbindin D28k protein and mRNA localization in the rat brain. Eur. J. Neurosci. 2, 11181126.
179. Shull,G.E. (2000). Gene knockout studies of Ca2+-transporting ATPases. Eur. J.
Biochem. 267, 5284-5290.
180. Silver,R., Romero,M.T., Besmer,H.R., Leak,R., Nunez,J.M., and Lesauter,J.
(1996). Calbindin-D28K cells in the hamster SCN express light-induced Fos.
NeuroReport 7, 1224-1228.
181. Skinner,P.J., Koshy,B.T., Cummings,C.J., Klement,I.A., Helin,K., Servadio,A.,
Zoghbi,H.Y., and Orr,H.T. (1997). Ataxin-1 with an expanded glutamine tract
alters nuclear matrix-associated structures. Nature 389, 971-974.
182. Smeyne,R.J.,
Oberdick,J.,
Schilling,K.,
Berrebi,A.S.,
Mugnaini,E.,
and
MorganJI. (1991). Dynamic organization of developing Purkinje cells revealed
by transgene expression. Science 254, 719-721.
183. Smeyne,R.J., Chu,T., Lewin,A., Bian,F., Crisman,S., Kunsch,C., and Lira,S.A.
(1995). Local control of granule cell generation by cerebellar Purkinje cells.
Mol. Cell. Neurosci. 6, 230-251.
184. Soriano,P. (1999). Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter
strain [letter]. Nat. Genet 21, 70-71.
185. Stahl,J.S., van Alphen,A.M., and De Zeeuw,C.I. (2000). A comparison of video
and magnetic search coil recordings of mouse eye movements. J. Neurosci.
Methods 99, 101-110.
186. Steckley,J.L., Ebers,G.C., Cader,M.Z., and McLachlan,R.S. (2001). An
autosomal dominant disorder with episodic ataxia, vertigo, and tinnitus.
Neurology 57, 1499-1502.
187. Sternberg,N.
and
Hamilton,D.
(1981).
Bacteriophage
P1
site-specific
recombination. I. Recombination between loxP sites. J. Mol. Biol. 150, 467-486.
188. Stout,A.K., Li-Smerin,Y., Johnson,J.W., and Reynolds,I.J. (1996). Mechanisms
of glutamate-stimulated Mg2+ influx and subsequent Mg2+ efflux in rat
forebrain neurones in culture. J. Physiol. 492 ( Pt 3), 641-657.
189. Takechi,H., Eilers,J., and Konnerth,A. (1998). A new class of synaptic response
involving calcium release in dendritic spines. Nature 396, 757-760.
110
190. Takeda,T., Arakawa,M., and Kuwano,R. (1994). Organization and Expression
of the Mouse Spot35/Calbindin-D28k Gene: Identification of the Vitamin DResponsive Promoter Region. Biochem. Biophys. Res. Commun. 204, 889-897.
191. Tang,J., Wagner,S., Schachner,M., Dityatev,A., and Wotjak,C.T. (2003).
Potentiation of amygdaloid and hippocampal auditory-evoked potentials in a
discriminatory fear-conditioning task in mice as a function of tone pattern and
context. Eur. J. Neurosci. 18, 639-650.
192. Taylor,A.N. and Wasserman,R.H. (1965). A vitamin D3-dependent factor
influencing calcium binding by homogenates of chick intestinal mucosa. Nature
205, 248-250.
193. Thach,W.T., Goodkin,H.P., and Keating,J.G. (1992). The cerebellum and the
adaptive coordination of movement. Annu. Rev. Neurosci. 15, 403-442.
194. Thach,W.T. (1998). A Role for the Cerebellum in Learning Movement
Coordination. Neurobiol. Learn. Mem. 70, 177-188.
195. Thompson,P.D. and Day,B.L. (1993). The anatomy and physiology of cerebellar
disease. Adv. Neurol. 61, 15-31.
196. van Alphen,A.M., Stahl,J.S., and De Zeeuw,C.I. (2001). The dynamic
characteristics of the mouse horizontal vestibulo-ocular and optokinetic
response. Brain Res. 890, 296-305.
197. van Alphen,A.M. and De Zeeuw,C.I. (2002). Cerebellar LTD facilitates but is
not essential for long-term adaptation of the vestibulo-ocular reflex. Eur. J.
Neurosci. 16, 486-490.
198. Vandaele,S., Nordquist,D.T., Feddersen,R.M., Tretjakoff,I., Peterson,A.C., and
Orr,H.T. (1991). Purkinje cell protein-2 regulatory regions and transgene
expression in cerebellar compartments. Genes. Dev. 5, 1136-1148.
199. Vassileva,G., Smeyne,R.J., and Morgan,J.I. (1997). Absence of neuroanatomical
and behavioral deficits in L7/pcp-2- null mice. Brain Res. Mol. Brain Res. 46,
333-337.
200. Verkhratsky,A. and Shmigol,A. (1996). Calcium-induced calcium release in
neurones. Cell Calcium 19, 1-14.
201. Vig,P.J., Fratkin,J.D., Desaiah,D., Currier,R.D., and Subramony,S.H. (1996).
Decreased parvalbumin immunoreactivity in surviving Purkinje cells of patients
with spinocerebellar ataxia-1. Neurology 47, 249-253.
111
Bibliografia
202. Vig,P.J.,
Subramony,S.H.,
Burright,E.N.,
Fratkin,J.D.,
Mcdaniel,D.O.,
Desaiah,D., and Qin,Z. (1998). Reduced immunoreactivity to calcium-binding
proteins in Purkinje cells precedes onset of ataxia in spinocerebellar ataxia-1
transgenic mice. Neurology 50, 106-113.
203. Wagner,J. and Keizer,J. (1994). Effects of rapid buffers on Ca2+ diffusion and
Ca2+ oscillations. Biophys. J. 67, 447-456.
204. Walton,P.D., Airey,J.A., Sutko,J.L., Beck,C.F., Mignery,G.A., Sudhof,T.C.,
Deerinck,T.J., and Ellisman,M.H. (1991). Ryanodine and inositol trisphosphate
receptors coexist in avian cerebellar Purkinje neurons. J. Cell Biol. 113, 11451157.
205. Wang,S.S., Denk,W., and Hausser,M. (2000). Coincidence detection in single
dendritic spines mediated by calcium release. Nat. Neurosci. 3, 1266-1273.
206. Wang,Y.T. and Linden,D.J. (2000). Expression of cerebellar long-term
depression requires postsynaptic clathrin-mediated endocytosis. Neuron 25, 635647.
207. Wilson,T.J. and Kola,I. (2001). The LoxP/CRE system and genome
modification. Methods Mol. Biol. 158, 83-94.
208. Wu,C.K., Nagykery,N., Hersh,L.B., Scinto,L.F., and Geula,C. (2003). Selective
age-related loss of calbindin-D28k from basal forebrain cholinergic neurons in
the common marmoset (Callithrix jacchus). Neuroscience 120, 249-259.
209. Yamamoto,M.,
Wada,N.,
Kitabatake,Y.,
Watanabe,D.,
Anzai,M.,
Yokoyama,M., Teranishi,Y., and Nakanishi,S. (2003). Reversible suppression of
glutamatergic neurotransmission of cerebellar granule cells in vivo by
genetically manipulated expression of tetanus neurotoxin light chain. J.
Neurosci. 23, 6759-6767.
210. Yang,G., Feddersen,R.M., Zhang,F.Y., Clark,H.B., Beitz,A.J., and Iadecola,C.
(1998). Cerebellar vascular and synaptic responses in normal mice and in
transgenics with purkinje-cell dysfunction. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp.
Physiol. 43, R529-R540.
211. Yvert,G., Lindenberg,K.S., Picaud,S., Landwehrmeyer,G.B., Sahel,J.A., and
Mandel,J.L. (2000). Expanded polyglutamines induce neurodegeneration and
trans-neuronal alterations in cerebellum and retina of SCA7 transgenic mice.
Hum. Mol. Genet. 9, 2491-2506.
112
212. Ziai,M.R., Sangameswaran,L., Hempstead,J.L., Danho,W., and Morgan,J.I.
(1988). An immunochemical analysis of the distribution of a brain-specific
polypeptide, PEP-19. J. Neurochem. 51, 1771-1776.
113

monografia

Transkrypt

Podobne dokumenty

Dawna mapa źródłem wiedzy o świecie "Geographia historiae

Bond-1™ SF