Dializa kazeiny i glicyny

BADANIE WŁAŚCIWOŚCI FIZYKOCHEMICZNYCH AMINOKWASÓW
IDENTYFIKACJA AMINOKWASÓW
BIAŁKA, JAK I WOLNE AMINOKWASY REAGUJĄ ZA POŚREDNICTWEM GRUP: -NH2 I –COOH Z NINHYDRYNĄ,
DINITROFLUOROBENZENEM I KWASEM AZOTOWYM (III). WYSTĘPOWANIE W STRUKTURZE AMINOKWASÓW
INNYCH GRUP FUNKCYJNYCH, OPRÓCZ AMINOWEJ I KARBOKSYLOWEJ, UMOŻLIWIA IDENTYFIKACJĘ TYCH
AMINOKWASÓW NA PODSTAWIE CZUŁYCH REAKCJI BARWNYCH.
Reakcja biuretowa
Nazwa pochodzi od biuretu, związku powstającego przy ogrzewaniu mocznika do 180OC. Reakcję
biuretową dają wszystkie połączenia zawierające w cząsteczce co najmniej 2 grupy -CO-NH- połączone ze sobą
bezpośrednio (np. w diamidzie kwasu szczawiowego NH2-CO-CO-NH2), poprzez azot (w biurecie) lub poprzez
atom węgla (w diamidzie kwasu malonowego, bursztynowego, w produktach hydrolizy białek). W wyniku
utworzenia połączenia koordynacyjnego Cu2+ z dwoma przyległymi wiązaniami –CO-NH- powstaje barwny
produkt. Dodatniego odczynu reakcji biuretowej nie dają wolne aminokwasy i dipeptydy.
Wykonanie:
Do 1 ml danej próby dodać 1 ml NaOH i kilka kropli 0,5% CuSO4 W obecności białka powstaje fioletowe
zabarwienie. Uwaga: ponieważ niebieska barwa odczynnika może maskować właściwy odczyn należy
unikać nadmiaru CuSO4.
Reakcja ninhydrynowa
Aminokwasy pod wpływem ninhydryny ulegają utlenieniu poprzez iminokwasy do amoniaku, dwutlenku
węgla i aldehydu uboższego o 1 atom węgla. W wyniku kondensacji cząsteczki zredukowanej i utlenionej
ninhydryny z amoniakiem powstaje niebiesko-fioletowe zabarwienie, którego natężenie jest proporcjonalne do
zawartości azotu aminowego aminokwasów.
1
O
H
R
C
O
C
COOH
+
C
OH
C
OH
C
NH2
R
CH + CO2 + H2O
+
H
C
C
NH
O
OH
O
ninhydryna
zredukowana
ninhydryna
H
R
CH + H2O
R
O
OH
C
C
H
+
+ NH3
O
NH
C
C
2NH3
OH
O
+
C
HO
O
O
O
C
C
C
C
N
C
C
C
C
O
O
O
barwny kompleks
+ 3H2O + NH4
Wykonanie:
Do 1 ml próby badanej dodać 3-4 krople 0,1% roztworu ninhydryny w 50% etanolu. Po wymieszaniu próbę
ogrzać do wrzenia. Wszystkie aminokwasy (oprócz proliny) reagują z ninhydryną tworząc niebieskie
zabarwienie.
Reakcja ksantoproteinowa
Aminokwasy aromatyczne oraz fenole ulegają reakcji nitrowania w czasie ogrzewania ze stężonym HNO 3,
dając żółto zabarwione pochodne nitrowe (fenyloalanina wymaga do nitrowania dodatku H2SO4).
COOH
H2C
COOH
NH3
H2C
2H2O
NH3
+ 2HNO3
O2N
OH
OH
Wykonanie:
Do 1 ml próby badanej dodać 0,5 ml stężonego HNO3 i ogrzewać na wrzącej łaźni wodnej przez 2 min.
Wytrąca się żółty osad.
Reakcja Adamkiewicza
Jest to reakcja charakterystyczna dla tryptofanu zawierającego pierścień indolowy. W obecności kwasu
siarkowego i formaldehydu (kwas glioksalowy) dwie grupy indolowe ulegają kondensacji z wydzieleniem
cząsteczki wody i dają barwny fioletowy związek. Schemat przebiegu reakcji:
2
Wykonanie:
Do 1 ml próby badanej dodać kilka kropli formaldehydu. Po wymieszaniu roztwór podwarstwić (po
ściance) stężonym H2SO4. Na granicy cieczy powstaje fioletowy pierścień.
Reakcja Millona
Reakcja na wykrywanie tyrozyny jest mało specyficzna, ponieważ dodatni wynik dają również związki
zawierające reszty fenolowe.
Wykonanie:
Do 1 ml próby badanej dodać kilka kropli odczynnika Millona. Mieszaninę ogrzewać w łaźni wodnej przez
kilka minut. W przypadku obecności tyrozyny pojawia się biały osad, który zabarwia się na żółto, a później na
czerwono (lub powstaje czerwone zabarwienie roztworu).
Wykrywanie cysteiny i cystyny
Zawarta w cysteinie i cystynie siarka w silnie zasadowym środowisku ulega uwolnieniu w postaci jonów
siarczkowych, które z jonami Pb2+ dają czarny osad PbS. Metionina nie daje dodatniego wyniku w tej reakcji.
Schemat przebiegu reakcji:
COOH
HC
NH2
H2C
SH
CH3
+ 2OH
C
O
+ S
2
+ NH3 + H2O
COOH
2
Pb
+ S
2
PbS
Wykonanie:
Do 1 ml próby badanej dodać 1 ml roztworu octanu ołowiu i 3 ml 10% roztworu NaOH (roztwór powinien
być klarowny). Próbkę ogrzewać na łaźni wodnej, po kilku minutach pojawia się czarny osad.
3
Wykrywanie glutaminy
Próba na obecność glutaminy wykorzystuje obecność w jej cząsteczce ugrupowania amidowego, z którego
w warunkach hydrolizy zasadowej uwalnia się gazowy amoniak. Dodatni wynik tej reakcji dają też asparagina
i sole amonowe.
Wykonanie:
Do 3 ml próby badanej dodać 3 ml 10% NaOH (roztwór dodać do probówki pipetą, tak aby nie dotknąć jej
wylotu). Całość umieścić we wrzącej łaźni wodnej a do wylotu probówki zbliżyć zwilżony uniwersalny papierek
lakmusowy. W przypadku obecności glutaminy papierek zmienia zabarwienie na niebieski Uwaga: należy
uważać, aby nie dotknąć papierkiem brzegu probówki. wówczas zmiana zabarwienia papierka następuje
na skutek obecności NaOH a nie amoniaku.
4