SubDNA_instrukcja_obsługi_Kucharczyk_TE_[...]

*
SubDNA
Zestaw do elektroforezy horyzontalnej w żelu agarozowym
z chłodzeniem*
Instrukcja Obsługi
Numer katalogowy: 130-100
Numer katalogowy: 131-100*
Aby uzyskać pomoc techniczną (+48) 22 668 71 47
Spis treści
1. Informacje ogólne
1.1
1.2
1.3
1.4
Wprowadzenie
Skład Zestawu SubDNA
Specyfikacja techniczna
Zasady bezpiecznego użytkowania
2. Użytkowanie Zestawu SubDNA
2.1
Przygotowanie aparatu do pracy oraz przeprowadzenie elektroforezy
3
3
3
4
4
5
5
3. Konserwacja aparatu
8
4. Odczynniki i przygotowanie roztworów
9
5. Diagnozowanie i usuwanie problemów
10
6. Akcesoria i wyposażenie dodatkowe
11
7. Warunki gwarancji
13
7.1
Formularz naprawy gwarancyjnej
8. Wsparcie techniczne
13
13
1. Informacje ogólne
1.1 Wprowadzenie
Serdecznie dziękujemy za zakup Zestawu SubDNA do horyzontalnej elektroforezy
kwasów nukleinowych w żelach agarozowych. Duża pojemność zbiorników z buforem
elektrodowym pozwala na przeprowadzenie rozdziałów elektroforetycznych bez ryzyka
denaturacji DNA przez zakwaszony lub zalkalizowany bufor. Wersja aparatu z
wymiennikiem ciepła pozwala przeprowadzać rozdziały w kontrolowanej temperaturze.
Oferujemy dwa rodzaje stolików do aparatu: o wymiarach 16 cm x 16 cm (5 grzebieni)
lub 13 cm x 16 cm (3 grzebienie). W aparacie można jednocześnie wykonać analizę
maksymalnie 64 prób.
1.2 Skład Zestawu SubDNA
Aby optymalnie korzystać z Zestawu SubDNA, prosimy o zapoznanie się z elementami
Zestawu SubDNA przed pierwszym zastosowaniem.
1. Komora elektroforetyczna z elektrodami
2. Stolik do wylewania żeli
3. Grzebień 1,5 mm/18 studzienek
4. Pokrywa komory z kablami zasilającymi
5. Uchwyty do mocowania grzebienia
6. Wymiennik ciepła*
7. Węże połączeniowe do wymiennika ciepła*
8. Instrukcja obsługi
* w aparacie z chłodzeniem
Rysunek 1. Skład Zestawu SubDNA.
3
1 szt.
1 szt.
2 szt.
1 szt.
2 szt.
1 szt.
2 szt.
1 szt.
1.3 Specyfikacja techniczna
Korpus komory elektroforetycznej
Pokrywa komory
Stolik do wylewania żelu
Kable zasilające
Elektrody
Wymiennik ciepła*
Węże połączeniowe do wymiennika ciepła*
PERSPEX PMMA
PERSPEX PMMA
PERSPEX PMMA
plecionka miedzianka, izolacja
silikonowa
platyna
szkło ceramiczne
silikon
Wymiary aparatu (d x sz x w)
Maksymalne napięcie
Waga
300 x 220 x 70 (mm)
300 V
1,0 kg
* w aparacie z chłodzeniem
1.4 Zasady bezpiecznego użytkowania
Prosimy o uważne zapoznanie się z instrukcją obsługi oraz zasadami bezpiecznego
użytkowania aparatu.
1. Aparat SubDNA jest obsługiwany przez zewnętrzny zasilacz i może być potencjalnym
źródłem śmiertelnego napięcia.
2. Zasilacz aparatu (nie wchodzący w skład Zestawu SubDNA), powinien zostać
podłączony do uziemienia.
3. Zasilanie aparatu jest podłączone przez pokrywę z kablami zasilającymi. Przed każdym
zdjęciem pokrywy aparatu należy pamiętać o wyłączeniu zasilania zasilacza
elektroforetycznego. Nie podłączać aparatu bez pokrywy.
4. Aparat SubDNA powinien być obsługiwany wyłącznie przez przeszkolony personel.
5. Aparat SubDNA należy używać wyłącznie zgodnie z jego przeznaczeniem.
6. Należy używać wyłącznie dedykowanych akcesoriów. Stosowanie elementów z innych,
niekompatybilnych aparatów może spowodować jego uszkodzenie i utratę ochrony
gwarancyjnej.
7. Aparat SubDNA jest wykonany z tworzywa PERSPEX PMMA, który może ulec
uszkodzeniu pod wpływem działania rozpuszczalników organicznych. Do mycia aparatu
należy stosować wyłącznie łagodne detergenty i wodę dejonizowaną.
Urządzenie jest zgodne z ustawowymi wytycznymi bezpieczeństwa Unii
Europejskiej: 73/23/EEC Dyrektywa Niskonapięciowa
4
2. Użytkowanie Zestawu SubDNA
Elektroforeza DNA w żelu agarozowym lub poliakrylamidowym jest
standardową metodą pozwalającą rozdzielić, zidentyfikować lub oczyścić fragmenty
DNA. Do zalet metody należy zaliczyć jej prostotę a także możliwość bezpośredniej
lokalizacji fragmentów DNA w żelu przy pomocy barwnika interkalującego - bromku
etydyny.
Żele poliakrylamidowe stosuje się zazwyczaj do rozdziału małych fragmentów (5 - 500
par zasad) a ich zdolność rozdzielcza jest bardzo wysoka i pozwala rozdzielić fragmenty
różniące się między sobą o 1 parę zasad (np. w trakcie elektroforezy sekwencjonującej).
Rozdział w żelach poliakrylamidowych przeprowadza się w układzie pionowej
elektroforezy płytowej. Przystosowane do tego rodzaju pracy są aparaty typu
STANDARD 2 (101-100) i MINIPOL 2 (103-100).
Żele agarozowe o różnym stężeniu stosuje się do rozdziału fragmentów DNA od 200
6
pz do 50 000 pz (50 kb). Większe fragmenty DNA (do 1010 ) mogą być rozdzielane w
żelu agarozowym metodą elektroforezy pulsacyjnej.
I. Czynniki wpływające na tempo migracji DNA w żelu agarozowym
1. Masa cząsteczkowa kwasu nukleinowego
Większe cząsteczki DNA migrują wolniej niż cząsteczki małe ze względu na większe
opory ruchu oraz większe trudności w penetrowaniu porów żelu będącego rodzajem sita
molekularnego. Tempo migracji jest odwrotnie proporcjonalne do logarytmu
dziesiętnego ilości par zasad.
2. Stężenie agarozy
Zwiększając stężenie agarozy zwalnia się tempo migracji DNA w żelu. Na podstawie
prac doświadczalnych ustalono optymalne stężenie agarozy do rozdziałów fragmentów
DNA o określonej wielkości. Dane te przedstawiono w Tabeli I.
Tabela I. Optymalne stężenie agarozy w zależności od wielkości rozdzielanego DNA
Wielkość
cząsteczki DNA
(kb)
5 - 60
1 - 20
0,8 - 10
0,5 - 7
0,4 - 6
0,2 - 3
0,1 - 2
Stężenie agarozy
(% w/v)
0,3
0,6
0,7
0,9
1,2
1,5
2,0
3. Napięcie prądu podczas elektroforezy
Przy niskich napięciach tempo migracji liniowych cząsteczek kwasów nukleinowych jest
wprost proporcjonalne do napięcia. Zależność ta nie obowiązuje dla dużych cząsteczek
DNA rozdzielanych przy zastosowaniu wysokich napięć, dlatego też w czasie rozdziału
cząsteczek większych niż 2000 pz (2 kb) nie należy stosować napięcia większego niż 5
V/cm.
4. Temperatura rozdziału
Temperatura, w jakiej dokonuje się rozdziału w zakresie od 4C do temperatury
pokojowej nie wpływa w istotnym stopniu na elektroforetyczne właściwości DNA.
Jednakże przeprowadzanie rozdziału w temperaturze wyższej od pokojowej wpływa na
bierną dyfuzję kwasów nukleinowych w żelu, a tym samym na ostrość uzyskiwanych
prążków DNA. Obniżenie temperatury podczas rozdziału gwarantuje dobrą jakość
rozdziału i otrzymanie ostrych prążków. W celu przeprowadzenia elektroforezy w
obniżonej temperaturze należy zastosować aparat z wymiennikiem ciepła.
5
5. Bromek etydyny
Obecność bromku etydyny lub innych barwników interkalującyh w buforze elektrodowym
(lub w żelu) zmniejsza prędkość przemieszczania się cząsteczek kwasów nukleinowych
o około 15%.
6. Siła jonowa i skład buforu
W buforze o niskiej sile jonowej DNA przemieszcza się bardzo wolno. Z kolei
stosowanie buforu o dużej sile jonowej sprzyja wydzielaniu dużej ilość ciepła, które
może spowodować roztopienie agarozy i denaturację DNA. Najpowszechniej stosowany
jest bufor TAE. Wykaz stosowanych buforów oraz sposób ich przygotowania jest
zawarty w Rozdziale 4 (Odczynniki i przygotowanie roztworów).
2.1 Przygotowanie aparatu i przeprowadzenie elektroforezy
.
I. Przygotowanie żelu agarozowego
1. Złożyć poza aparatem stolik do wylewania żelu agarozowego. Dokręcić śruby tak aby
czarne uszczelki unieruchomiły wkład. Włożyć grzebienie w wycięcia wkładu tak aby
zęby grzebienia nie dotykały dna.
2. Przygotować odpowiednią ilość buforu elektrodowego (1TAE lub 0,5TBE)
wystarczającą do wypełnienia komory aparatu i rozpuszczenia agarozy. Do kolbki
odważyć odpowiednią do stężenia i objętości żelu ilość agarozy i uzupełnić buforem.
UWAGA!
Objętość mieszaniny nie powinna przekraczać ½ objętości kolbki.
3. Mieszaninę podgrzewać w kuchence mikrofalowej do momentu całkowitego
rozpuszczenia agarozy. Podczas ogrzewania co kilkadziesiąt sekund wyjąć kolbę i
wymieszać delikatnie zawartość. Kontrolować rozpuszczanie agarozy sprawdzając czy
nie pozostają opalizujące grudki.
4. Po rozpuszczeniu agarozy mieszaninę schłodzić do około 60C i dodać bromek
etydyny tak aby stężenie końcowe wynosiło 0,5 ug/ml.
UWAGA!
Bromek etydyny jest silnym mutagenem. Podczas pracy należy zachować
szczególną ostrożność zawsze używając środków ochrony osobistej. Wszelkie
pozostałości żeli lub roztworów zawierających bromek etydyny powinny być
poddawane utylizacji.
5. Schłodzoną agarozę wlać do stolika z grzebieniami tak aby grubość żelu wynosiło 3-5
mm.
6. Pozostawić żel do stężenia w temperaturze pokojowej lub w lodówce a następnie
przenieść wkład z żelem do aparatu.
7. Zalać żel przygotowanym buforem elektrodowym oraz wyciągnąć grzebień.
Sprawdzić czy studzienki nie zawierają pozostałości żelu agarozowego, który mógłby
utrudnić nałożenie próbki.
8. Zalać żel przygotowanym buforem elektrodowym oraz wyjąć delikatnie grzebień.
Sprawdzić czy studzienki nie zawierają pozostałości żelu agarozowego, który mógłby
utrudnić nałożenie próbki. Wyjmowanie grzebienia po zalaniu żelu buforem zapobiega
zapadaniu się studzienek.
6
II. Przeprowadzenie elektroforezy
1. Wlać do aparatu bufor elektrodowy w takiej ilości aby przykrył żel warstwą 2-3 mm
cieczy.
2. Próbkę DNA wymieszaną z buforem obciążającym w stosunku 5:1 nałożyć delikatnie
na żel. Szybkie naciśnięcie tłoka pipety może spowodować wypłynięcie próbki do buforu
elektrodowego.
3. Po nałożeniu próbek zamknąć pokrywę aparatu uważając na prawidłowe położenie
elektrod. Ułatwia to ujednolicony system oznaczania elektrod kolorami - elektroda "+"
oznaczona jest kolorem czerwonym, elektroda "-" kolorem niebieskim lub czarnym.
Oznaczenia dotyczą także zasilaczy elektroforetycznych oferowanych przez firmę
Kucharczyk TE).
UWAGA!
Kwasy nukleinowe posiadają wypadkowy ładunek ujemny i przemieszczają się w
kierunku elektrody dodatniej (czerwonej).
4. Jeżeli elektroforeza będzie prowadzona w aparacie SubDNA z chłodzeniem
podłączyć węże i uruchomić pompę z cyrkulacją cieczy.
5. Połączyć aparat z zasilaczem i rozpocząć elektroforezę. Najczęściej elektroforezę
przeprowadza się przy napięciu 120 V.
6. Gdy barwnik obciążający przemieści się na wymaganą odległość, wyłączyć aparat.
ew. pompę i skontrolować rozdział DNA na transluminatorze bezpośrednio po
zakończeniu. Pozostawienie żelu w aparacie na dłuższy czas może spowodować
rozdyfundowanie DNA i uzyskanie gorszego obrazu rozdziału kwasów nukleinowych.
7. Jeżeli żel agarozowy nie zawierał bromku etydyny, konieczne jest wybarwienie DNA
poprzez inkubację żelu w roztworze zawierającym bromek etydyny. Do barwienia żelu
służą dedykowane pojemniki szklane (nr kat. 100-140 i 100-141).
7
3. Konserwacja aparatu
Korpus aparatu, stolik do wylewania żelu oraz pokrywa są wykonane z materiału
PERSPEX PMMA. Materiał typu PERSPEX PMMA jest podatny na uszkodzenia pod
wpływem stężonych rozpuszczalników organicznych, w szczególności alkoholi. Do mycia
aparatu należy używać łagodnych detergentów i wody dejonizowanej.
Pozostałości żelu agarozowego lub buforu zawierającego bromek etydyny powinny być
poddane utylizacji.
8
4. Odczynniki i przygotowanie roztworów
UWAGA!!!
Wszystkie roztwory powinny być przygotowane z użyciem wysokiej czystości wody destylowanej lub dejonizowanej a następnie przefiltrowane.
1. Bufory elektroforetyczne
Stężenie robocze
Nazwa buforu
Stężenie roztworu
wyjściowego (składniki
na 1 litr)
50
242 g Tris base
57,1 ml lodowaty kwas
octowy
100 ml 0,5 M EDTA pH 8,0
Tris - octan (TAE)
1
0,04 M Tris - octan,
0,001 M EDTA
Tris - fosforan (TPE)
1
0,09 M Tris - fosforan,
0,002 M EDTA
10
108 g Tris base
15,5 ml 85% kwasu
fosforowego
Tris - boran (TBE)
0.5
0,045 M Tris - boran,
0,001 M EDTA
5
54 g Tris base
27,5 g kwas borny
20 ml 0,5M EDTA pH 8,0
Alkaliczny
1
50 mM NaOH
1 mM EDTA
10
5 ml 10 N NaOH
2 ml 0,5 M EDTA pH 8,0
2. Bufor obciążający 6x stężony
0,25% błekit bromofenolowy
0,25% xylene cyanol FF
40% (w/v) sacharoza w wodzie
Bufor przechowywać w temperaturze +4C.
9
5. Diagnozowanie i usuwanie problemów
Możliwa przyczyna
a. Nieodpowiedni
bufor
elektrodowy
Rozwiązanie
a. Sprawdź skład i
rozcieńczenie buforu
b. Zbyt niskie
nastawy
zasilacza
elektroforetyczne
-go
b. Ustaw napięcie na 100 V
2. Dyfuzja próbek do
buforu
a. Niewłaściwe
obciążenie próbki
a. Upewnij się, że próbka
jest obciążana 6x
stężonym buforem w
stosunku 5:1 (5 ul próbki i
1 ul buforu
obciążającego)
3. Grzanie się buforu
a. Za wysokie
napięcie
a. Sprawdź ustawienia
zasilacza.
b. Zbyt wysokie
stężenie buforu
elektrodowego
b. Rozcieńcz bufor elektrodowy
o połowę
a. Brak lub zbyt niskie
stężenie barwnika
interkalującego
a. Dobarwij żel kąpielą w
roztworze z bromkiem
etydyny
b. Zbyt długa migracja
próbek i ich
„ucieczka” do buforu
b. Kontroluj czas trwania
rozdziału. Wyłącz zasilacz
gdy niebieski barwnik
będzie blisko końca żelu.
Problem
1. Brak migracji prążków
w żelu
4. Brak prążków kwasu
nukleinowego
10
6. Akcesoria i wyposażenie dodatkowe
Numer katalogowy
Opis produktu
130-10MC
Grzebień SubDNA grubość: 1,0 mm/18 studzienek - kompatybilny z
pipetą 8 kanałową
130-15MC
Grzebień SubDNA grubość: 1,5 mm/18 studzienek - kompatybilny z
pipetą 8 kanałową
130-20MC
Grzebień SubDNA grubość: 2,0 mm/18 studzienek - kompatybilny z
pipetą 8 kanałową
130-120
Grzebień SubDNA grubość: 1,0 mm/10 studzienek
130-121
Grzebień SubDNA grubość: 1,5 mm/10 studzienek
130-122
Grzebień SubDNA grubość: 2,0 mm/10 studzienek
130-123
Grzebień SubDNA grubość: 1,0 mm/20 studzienek
130-124
Grzebień SubDNA grubość: 1,5 mm/20 studzienek
130-125
Grzebień SubDNA grubość: 2,0 mm/20 studzienek
130-126
Grzebień SubDNA grubość: 1,0 mm/30 studzienek
130-127
Grzebień SubDNA grubość: 1,5 mm/30 studzienek
130-128
Grzebień SubDNA grubość: 2,0 mm/30 studzienek
130-140
Uchwyt do grzebienia SubDNA
130-N165
Saneczki na żel SubDNA o wymiarach 13 x 16 cm
130-N166
Saneczki na żel SubDNA o wymiarach 16 x 16 cm
130-N167
Stolik do wylewania żeli (z uszczelkami i pokrętłami dociskowymi)
100-140
Pojemnik z pokrywą, szklany, przezroczysty (20 x 16 x 4 cm)
100-141
Pojemnik z pokrywą, szklany, przezroczysty (16 x 12 x 4 cm)
196-100
Transluminator TFM-20V (25 W), 302 nm, rozmiar pola 20 x 20 cm,
możliwość zmienności intensywności świecenia: wysoka, średnia, niska
196-101
Transluminator TFM-26V (25 W), 302 nm, rozmiar pola 21 x 26 cm,
możliwość zmienności intensywności świecenia: wysoka, średnia, niska
196-102
Transluminator TFM-30V (25 W), 302 nm, rozmiar pola 25 x 30 cm,
możliwość zmienności intensywności świecenia: wysoka, średnia, niska
196-103
Transluminator TFM-40V (25 W), 302 nm, rozmiar pola 20 x 40 cm,
możliwość zmienności intensywności świecenia: wysoka, średnia, niska
196-104
Transluminator TFML-20V (25 W), 302/365 nm, rozmiar pola 20 x 20
cm
196-105
Transluminator TFML-26V (25 W), 302/365 nm, rozmiar pola 21 x 26
cm
196-106
Transluminator TFML-30V (25 W), 302/365 nm, rozmiar pola 25 x 30
cm
196-107
Transluminator TFML-40V (25 W), 302/365 nm, rozmiar pola 20 x 40
cm
196-108
Transluminator TFL-40V (25 W), 365 nm, rozmiar pola 20 x 40 cm,
możliwość zmienności intensywności świecenia: wysoka, średnia, niska
196-109
Transluminator TFS-20V (25 W), 254 nm, rozmiar pola 20 x 20 cm,
możliwość zmienności intensywności świecenia: wysoka, średnia, niska
196-114
Transluminator M-15V (8 W), 302 nm, rozmiar pola 15 x 15 cm,
możliwość zmienności intensywności świecenia: wysoka, średnia, niska
11
196-115
Transiluminator M-20V (8 W), 302 nm, rozmiar pola 20 x 20 cm,
możliwość zmienności intensywności świecenia: wysoka, średnia,
niska
196-116
Transiluminator M-26V (8 W), 302nm, rozmiar pola 21 x 26 cm,
możliwość zmienności intensywności świecenia: wysoka, średnia,
niska
196-117
Transiluminator LM-20E (8 W), 365/302 nm, rozmiar pola 20 x 20 cm
196-118
Transiluminator LM-26E (8 W), 365/302 nm, rozmiar pola 21 x 26 cm
196-119
Transiluminator LMS-20E (8 W), 365/302/25 nm, rozmiar pola 20 x 20
cm
196-120
Transiluminator LMS-26E (8 W), 365/302/254 nm, rozmiar pola 21 x
26 cm
12
7. Warunki gwarancji
Krzysztof Kucharczyk Techniki Elektroforetyczne sp. z o.o. gwarantuje, że dostarczony
Państwu sprzęt został przetestowany i spełnia wszystkie warunki specyfikacji.
Niniejsza gwarancja jest ważna przez 24 miesiące tylko wtedy, gdy produkt i jego funkcje
zostały wykorzystane zgodnie z instrukcją obsługi i przeznaczeniem aparatu.
Producent nie ponosi odpowiedzialności za straty lub szkody wynikające z
nieprawidłowego użytkowania aparatu.
Gwarancji nie podlega sprzęt, który nosi znamiona naprawy przez osoby inne niż
wskazane przez firmę Krzysztof Kucharczyk Techniki Elektroforetyczne.
Odpowiedzialność producenta jest ograniczona do naprawy lub wymiany urządzenia, lub
zwrotu kosztów zakupu.
Firma Krzysztof Kucharczyk Techniki Elektroforetyczne zastrzega sobie prawo do zmiany
specyfikacji urządzenia bez wcześniejszego powiadomienia.
Urządzenie powinno być obsługiwane wyłącznie przez osoby przeszkolone.
7.1 Formularz naprawy gwarancyjnej
W przypadku wystąpienia awarii, uprzejmie prosimy o wypełnienie Formularza naprawy
gwarancyjnej dostępnego na kolejnej stronie i skontaktowanie się z firmą Krzysztof
Kucharczyk Techniki Elektroforetyczne.
Prosimy o zachowanie oryginalnych opakowań aparatu do czasu zakończenia okresu
gwarancyjnego.
8. Wsparcie techniczne
Jeżeli macie Państwo jakieś pytania dotyczące obsługi urządzenia lub dostępności
akcesoriów i sprzętu uzupełniającego prosimy o kontakt z naszą Firmą.
Kucharczyk Techniki Elektroforetyczne sp. z o.o.
ul. Pawińskiego 5a/ blok D
02-106 Warszawa
Tel. +48 22 668 71 47
Fax. +48 22 668 71 64
e-mail: info@kucharczyk
13
ZGŁOSZENIE SERWISOWE
Nazwa Instytucji
Adres Instytucji
Osoba zgłaszająca
Dane kontaktowe (tel., e-mail)
DANE URZĄDZENIA
Nazwa
Model/nr katalogowy
Numer seryjny
Opis problemu/uszkodzenia
Oświadczenie
Niniejszym potwierdzam, że przesłane do serwisu urządzenie nie
zawiera substancji chemicznych ani czynników infekcyjnych
szkodliwych dla zdrowia człowieka.
Data
Podpis osoby zgłaszającej
14