OZNACZANIE BIAŁKA METODĄ LOWRY`EGO

Transkrypt

Chemia Biologiczna- pracownia specjalizacyjna
2016/17
Instrukcja do Ćwiczenia
Analiza strukturalna makrocząsteczki
Na ćwiczenia należy przynieść okulary i fartuchy ochronne !!!
CEL ĆWICZENIA:
Zanim dla kryształu białka zostanie wykonany pomiar dyfraktometryczny, należy ocenić jego jakość,
przygotować roztwór krioprotektanta (w przypadku pomiarów niskotemperaturowych) i umieścić na
goniometrze. Po wykonaniu pomiaru i przetworzeniu danych strukturę białka rozwiązuje, udokładnia się
wykorzystując dedykowane programy komputerowe.
Część I
Wykonanie rzutu stereograficznego oraz wyznaczenie grupy punktowej kryształów lizozymu. Wybór
kryształu do badań strukturalnych.
Zagadnienia do powtórzenia:
 typy układów krystalograficznych,
 grupy punktowe,
 zasady konstrukcji rzutu stereograficznego,
 wskaźniki Millera płaszczyzn sieciowych.
1. Obserwacja otrzymanych kryształów lizozymu pod mikroskopem:
 określ liczbę i średnie wymiary kryształów w każdej kropli,
 przeanalizuj pod mikroskopem pokrój i symetrię kryształów,
 na podstawnie obserwacji wybierz i zaznacz kroplę z kryształami najlepszej jakości (będą one
później wykorzystane do badań strukturalnych),
 wykonaj rysunek typowego kryształu i jego rzut stereograficzny,
 ustal układ krystalograficzny i klasę symetrii punktowej kryształu lizozymu.
2. Modelowanie pokroju kryształu lizozymu z wykorzystaniem programu Shape:





przypisz wskaźniki Millera każdej ze ścian kryształu na rzucie stereograficznym,
zmierz kąt pomiędzy odpowiednimi ścianami dla otrzymanych kryształów lizozymu,
wymodeluj kryształy lizozymu za pomocą programu Shape,
określ stosunek długości periodów a/c w krysztale lizozymu,
wybierz najlepszy układ współrzędnych do opisu geometrii kryształu lizozymu.
Część II
Wyznaczenie parametrów sieciowych kryształów lizozymu
 pomiary dyfraktometryczne białek: sposoby ich wykonywania w temperaturze pokojowej i w
temperaturze ciekłego azotu,
 znaczenie krioprotektanta w pomiarach niskotemperaturowych, typy substancji używanych jako
krioprotektanty, cechy dobrego krioprotektanta,
 długości fali promieniowania MoK i CuK,
 prawo Bragga, konstrukcja Ewalda, rozdzielczość w rentgenografii i jej interpretacja,
 zasady bezpiecznej pracy w Pracowni Rentgenowskiej
1.
Dobór krioprotektanta najlepszego do niskotemperaturowych badań strukturalnych lizozymu:
Prowadząca: dr K. Kurpiewska tel. 12 663 29 21, pokój 109
1


2016/17
obserwacja obrazów dyfrakcyjnych wykonanych dla różnych roztworów krioprotektantów i
roztworów,
wybór krioprotektanta optymalnego dla dalszej pracy z kryształami lizozymu.
2. Wyznaczenie parametrów sieciowych kryształów lizozymu:

przy użyciu pętelki wykonanej z celulozy przenieś wybrany kryształ lizozymu z kropli do roztworu
krioprotektanta, a następnie szybko wyłów kryształ i zamontuj pętelkę z kryształem na główce
goniometrycznej,

wycentruj kryształ na dyfraktometrze
→ zarejestrowanie kilku obrazów dyfrakcyjnych dla kryształu lizozymu w celu wyznaczenia jego
parametrów sieciowych,

porównaj typ sieci Bravais’ego z wyznaczoną wcześniej grupą punktową oraz parametry sieciowe
kryształu lizozymu z określoną wcześniej na podstawie modelowania symetrią kryształu i
stosunkiem długości periodów a i c
Część III
Udokładnienie struktury białka
 baza PDB i jej zawartość, plik *.pdb i jego zawartość,
 metody rozwiązywania i udokładniania struktur białek,
 wskaźniki udokładniania R i Rfree (wzory),
 mapy Fouriera (mapy gęstości elektronowej, 2Fo-Fc i Fo-Fc) i ich interpretacja,
 diagram Ramachandrana
1. Wstęp
Protein Data Bank (PDB) jest to baza danych gromadząca struktury makromolekuł wyznaczone przy pomocy
różnych metod, m. in. dyfrakcji promieni X i NMR. Znaczną część struktur zdeponowanych w bazie stanowią
struktury białek. PBD można znaleźć w Internecie pod adresem: www.pdb.org. Struktury zdeponowane w PDB
można wykorzystać, np. jako modele do rozwiązania struktur innych białek metodą podstawienia
molekularnego.
Struktura rybonukleazy, którą będziemy się zajmować w dalszej części ćwiczenia została już rozwiązana, a
naszym zadaniem będzie jej udokładnienie. Na udokładnienie będą się składały:
 przebudowa modelu białka przy użyciu programu Coot
Zmiana pozycji atomów/dodawanie
brakujących atomów

Obliczenie nowej mapy gęstości
elektronowej
udokładnianie metodą maximum likelihood przy użyciu programu Refmac5 z pakietu CCP4.
2. Działanie Programu Coot
Współrzędne atomów białka znajdują się w pliku .pdb a dane doświadczalne w pliku z rozszerzeniem .mtz.
1. Wczytywanie plików do programu Coot. Uruchom program Coot. Wczytaj współrzędne cząsteczki
rybonukleazy zawarte w pliku rnasa_0.pdb (w pliku znajdują się współrzędne dwóch łańcuchów A i B
rybonukleazy):
 wybierz FILE z menu głównego,
 wybierz OPEN COORDINATES,
 wskaż na wybrany plik (rnasa_0.pdb) i naciśnij OK.
2
2016/17
Wczytaj mapy gęstości elektronowej:
 wybierz FILE z menu głównego,
 wybierz AUTO OPEN MTZ,
 wskaż na wybrany plik (rnasa_0.mtz) i naciśnij OK.
Wypróbuj działanie poszczególnych klawiszy myszki i ich kombinacje z klawiszami klawiatury CTRL i
SHIFT. Obejrzyj cząsteczkę powiększając i pomniejszając widok.
LEWY
obrót cząsteczki
Ctrl
Shift
2.
przesunięcie
cząsteczki
podpisanie atomu
KÓŁKO
zmiana
poziomu
konturowania mapy
-
ŚRODKOWY
centrowanie
-
-
-
PRAWY
powiększenie/pomniejszenie
zmiana głębi obrazu
-
Wyszukiwanie atomu:
 wybierz DRAW z menu głównego,
 wybierz GO TO ATOM,
 rozwiń drzewko dla łańcucha A,
 wskaż na atom reszty ASP1,
 naciśnij APPLY w oknie GO TO ATOM,
 skorzystaj z możliwości poruszania się wzdłuż łańcucha aminokwasowego (SPACJA do przodu,
SPACJA+SHIFT do tyłu lub NEXT RESIDUE/PREVIOUS RESIDUE),
 naciśnij lewy przycisk myszy i przesuń, żeby obrócić cząsteczkę i obejrzeć wybrany aminokwas,
PYTANIE 1: Podaj wartość czynnika przemieszczenia (bf) dla atomu Cα ASP1.
3.
Mierzenie odległości. Skorzystaj z możliwości mierzenia odległości międzyatomowych:
 przejdź używając klawisza spacji (lub w inny sposób) do reszty aminokwasowej numer 4,
 wybierz MEASURES z menu głównego,
 wybierz DISTANCES,
 odszukaj atom tlenu O/4GLY/A i atom azotu N/91LEU/A
 zmierz odległość pomiędzy tymi atomami, czy możliwe jest występowanie pomiędzy nimi wiązania
wodorowego?
4.
Zmiana poziomu głębi obrazu: ustaw poziom głębi na odpowiadający Twoim potrzebom. Możesz to
wykonać przyciskając CTRL i prawy przycisk myszy i przesuwając mysz w prawo/lewo.
5.
Zmiana poziomu konturowania i koloru map. Aby zmienić poziom konturowania mapy trzeba przesunąć
kółko myszki do przodu/tyłu (poziom konturowania zmieni się dla aktywnej mapy). Aby zmienić aktywność
z jednaj na drugą mapę można, np.:
 wejść do menu CALCULATE potem do MODEL/FIT/REFINE,
 zaznaczyć SELECT MAP,
 wskaż mapę ... FWT PHWT.
Aby zmienić kolor mapy można skorzystać z opcji w okienku DISPLAY MANAGER lub:
 wybierz EDIT z menu głównego,
 wybierz MAP COLOUR,
 wskaż mapę ... FWT PHWT,
 wybierz nowy kolor mapy,
 naciśnij OK.
3. Przebudowa modelu (Coot) i udokładnianie struktury (Refmac5)
3
1.
2016/17
Przebudowa modelu. Jest kilka sposobów, żeby sprawdzić czy nasz model pasuje do obliczonej gęstości
elektronowej. Jedną z nich jest automatyczna analiza wypełnienia gęstości elektronowej atomami. Aby tego
dokonać:
 wybierz VALIDATE z menu głównego,
 wybierz DENSITY FIT ANALYSIS,
 wskaż cząsteczkę rnasa_0.pdb,
 przeanalizuj wykres - wyższe i bardziej czerwone kolumny oznaczają, że w tym miejscu łańcucha
aminokwasowego występuje jakiś problem.
W naszym przypadku są to m. in. miejsce w łańcuchu A w pozycji 41A. Przyjrzyjmy się jednak na początek
sytuacji aminokwasu 89A (wskaż na wykresie odpowiednią kolumnę, a program automatycznie pokaże Ci
otoczenie tego aminokwasu).
2.
Korzystanie z biblioteki rotamerów. Przeanalizuj zgodność struktury z mapą Fouriera w obszarze
aminokwasu 89A. Łańcuch boczny tej reszty nie pasuje do mapy, naprawmy to:
 wejdź do menu CALCULATE potem do MODEL/FIT/REFINE,
 wybierz ROTAMERS,
 wskaż dowolny atom aminokwasu 89A,
 w okienku dozwolonych rotamerów wybierz ten pasujący i zaakceptuj,
 skorzystaj z opcji REAL SPACE REFINE ZONE w menu MODEL/FIT/REFINE,
 ponownie wskaż dowolny atom aminokwasu 89A,
 jeśli uznasz, że zaproponowana poprawka jest do przyjęcia kliknij ACCEPT.
Taką sama naprawę można przeprowadzić korzystając tylko z funkcji REAL SPACE REFINE ZONE:
 kliknij UNDO w menu MODEL/FIT/REFINE,
 wybierz opcję REAL SPACE REFINE ZONE,
 wskaż dowolny atom aminokwasu 89A,
 używając lewego przycisku myszy złap za jeden z atomów 89A i pociągnij by znalazł się w obszarze
gęstości elektronowej,
 jeśli uznasz, że zaproponowana poprawka jest do przyjęcia kliknij ACCEPT
PYTANIE 2: Ile rotamerów znajduje się w bibliotece programu Coot dla reszty Phe89?
3.
Zaawansowane opcje funkcji REAL SPACE REFINE ZONE. Przeanalizuj zgodność struktury z mapą
Fouriera na obszarze od 40A do 42A. W okienku DENSITY FIT ANALYSIS wskaż kolumnę dla 41A
(program automatycznie przeniesie Cię w to miejsce struktury, tutaj także trzeba coś naprawić). A teraz
poprawmy model:
 wybierz opcję REAL SPACE REFINE ZONE,
 wskaż dowolny atom aminokwasu 41A dwukrotnie lub atom 40A i 42A,
 używając lewego przycisku myszy złap za jeden z atomów 40-42A i pociągnij by znalazły się w
obszarze gęstości elektronowej,
 aby przesunąć jeden atom zrób to samo trzymając wciśnięty klawisz CTRL,
 jeśli uznasz, że zaproponowana poprawka jest do przyjęcia kliknij ACCEPT.
4.
UNMODELLED BLOBS (blob z ang. kleks). Wyszukiwanie miejsc, w których potencjalnie mogą
znajdować się ligandy lub większe jony etc. Z menu VALIDATE wybierz UNMODELLED BLOBS. Kliknij
FIND BLOBS, program wyświetli większe miejsca gęstości elektronowej niewypełnione atomami.
BLOB 3
Wybierz BLOB 3, program przeniesie Cię w odpowiednie miejsce. Wiedząc, że roztwór krystalizacyjny
zawierał: octan sodu, chlorek sodu, siarczan amonu i ligand 3’GMP zaproponuj jaka cząsteczka może
znajdować się w tym miejscu i dodaj ją do modelu:
 kliknij PLACE ATOM AT POINTER w menu MODEL/FIT/REFINE,
 wybierz odpowiednią cząsteczkę/jon,
 zmień w opcjach do wyboru NEW MOLECULE na swój model rnasa.pdb,
 kliknij OK,
4



2016/17
skorzystaj z funkcji REAL SPACE REFINE ZONE do dopasowania ułożenia cząsteczki w gęstości
elektronowej,
jeśli uznasz, że zaproponowana poprawka jest do przyjęcia kliknij ACCEPT,
w jaki sposób cząsteczka ta oddziałuje z białkiem? Które z jej atomów mogą tworzyć wiązania
wodorowe z cząsteczką białka? Zmierz odpowiednie odległości międzyatomowe.
PYTANIE 3: Zmierz i podaj odległość pomiędzy atomem NH2/63 ARG z łańcucha A oraz najbliższym atomem
O z dodanej cząsteczki.
 Czy BLOB4 wygląda jak BLOB3? Wypełnij go odpowiednią cząsteczką.
Następnie, po wypełnieniu BLOB 3 i BLOB4 odpowiednimi cząsteczkami, dopisz je do pliku z białkiem,
klikając MERGE MOLECULES z menu CALCULATE, zaznacz ligand i cząsteczkę białka i kliknij MERGE.
Następnie zapisz otrzymaną cząsteczkę (FILE  SAVE COORDINATES) i nadaj jej nazwę rnasa_1.pdb. Nie
zamykaj programu Coot dopóki nie masz pewności, że zapisałeś plik rnasa_1.pdb !!!
Następnie uruchom program CCP4 (wg wskazówek prowadzącego). Wybierz zakładkę Refinement i kliknij
Refmac5. Pojawi się okno programu do udokładniania struktury. W odpowiednie pola wstaw pliki rnasa_0.mtz
i rnasa_1.pdb. Nowym plikom, które powstaną po udokładnianiu, nadaj nazwy: rnasa_2.mtz i rnasa_2.pdb:
MTZ in: rnasa_0.mtz
MTZ out: rnasa_2.mtz
PDB in: rnasa_1.pdb
PDB out: rnasa_2.pdb
i kliknij: Run  Run now (obserwuj co dzieje się w graficznym oknie programu CCP4).
Do otwierania plików .pdb w formie tekstu służy opcja „VIEW ENY FILE” w menu głównym CCP4i na liście
po prawej stronie.
Kiedy udokładnianie się zakończy, otwórz plik rnasa_2.pdb i odczytaj wartości wskaźników R i Rfree i
porównaj je z wartościami z pliku rnasa_0.pdb (uzupełniaj poniższą tabelę systematycznie przez całe zajęcia
dla kolejnych plików):
cykl udokładniania
0
1
2
3
4
5.
plik pdb
rnasa_0.pdb
rnasa_2.pdb
rnasa_4.pdb
rnasa_6.pdb
rnasa_8.pdb
R
Rfree
Ponownie otwórz program Coot i oglądnij efekty udokładniania (rnasa_2.pdb i rnasa_2.mtz). Wyszukaj też
jeszcze raz UNMODELLED BLOBS. Wybierz BLOB 2 a program przeniesie Cię w odpowiednie miejsce.
Wiedząc, że roztwór krystalizacyjny zawierał: octan sodu, chlorek sodu, siarczan amonu i ligand 3’GMP
zaproponuj jaka cząsteczka może znajdować się w tym miejscu i dodaj ją do modelu:



jeśli cząsteczki pasującej do gęstości elektronowej nie ma w menu PLACE ATOM AT POINTER,
wykorzystaj opcję GET MONOMER z menu FILE. W okienku wpisz kod monomeru 3GP- program
automatycznie wczyta współrzędne atomów cząsteczki i ją wyświetli.
łatwiej jest pracować z cząsteczką pozbawioną atomów wodoru, usuniemy je:
→ kilknij DELETE w menu MODEL/FIT/REFINE,
→ wybierz HYDROGENS IN RESIDUE i kliknij na cząsteczkę liganda,
skorzystaj z funkcji ROTATE/TRANSLATE ZONE, aby dopasować ułożenie cząsteczki w gęstości
elektronowej, kliknij dwukrotnie w dowolny atom liganda i przesuń go w odpowiednie miejsce i
naciśnij OK,
5


2016/17
skorzystaj z funkcji REAL SPACE REFINE ZONE do dopasowania ułożenia cząsteczki w gęstości
elektronowej,
jeśli uznasz, że zaproponowana poprawka jest do przyjęcia kliknij ACCEPT,
PYTANIE 4: Podaj nazwy i numery pięciu aminokwasów otaczających wbudowany ligand.
Następnie, po wypełnieniu BLOB 2 odpowiednią cząsteczką, dopisz ją do pliku z białkiem, klikając MERGE
MOLECULES z menu CALCULATE, zaznacz ligand i cząsteczkę białka i kliknij MERGE. Następnie zapisz
otrzymaną cząsteczkę (FILE  SAVE COORDINATES) i nadaj jej nazwę rnasa_3.pdb. Nie zamykaj
programu Coot dopóki nie masz pewności, że zapisałeś plik rnasa_3.pdb !!!
Przeprowadź kolejny cykl udokładniania programem Refmac5. Wprowadź następujące dane:
MTZ in: rnasa_2.mtz
PDB in: rnasa_3.pdb
Zanotuj wartości R i Rfree z pliku rnasa_4.pdb.
6.
Sprawdź efekty udokładniania (rnasa_4.pdb i rnasa_4.mtz). Kolejnym etapem udokładniania jest dodawanie
cząsteczek rozpuszczalnika. Ponownie uruchom Coot. W oparciu o mapy gęstości elektronowych program
Coot automatycznie dodaje cząsteczki rozpuszczalnika (cząsteczki wody). Aby wyszukać wody:
 kliknij FIND WATERS w menu MODEL/FIT/REFINE zaakceptuj automatyczne ustawienia i naciśnij
OK,
PYTANIE 6: Ile cząsteczek rozpuszczalnika program dodał automatycznie?






wybierz z głównego menu MEASURES,
skorzystaj z funkcji ENVIRONMENT DISTANCE,
zaznacz SHOW RESIDUE ENVIRONMENT,
ustaw odległość atomów od 0.0 do 3.5 Å,
wykorzystaj opcje GO TO ATOM żeby przejść do pierwszej cząsteczki wody,
wykorzystaj SPACJE do przeanalizowania położenia kilku dodanych cząsteczek wody.
Następnie (jeśli to konieczne), po dodaniu cząsteczek wody, dopisz je do pliku z białkiem, klikając MERGE
MOLECULES z menu CALCULATE, zaznacz listę z wodami i cząsteczkę białka i kliknij MERGE. Zapisz
otrzymaną cząsteczkę (FILE  SAVE COORDINATES) i nadaj jej nazwę rnasa_5.pdb. Nie zamykaj
programu Coot dopóki nie masz pewności, że zapisałeś plik rnasa_7.pdb !!!
MTZ in: rnasa_4.mtz
PDB in: rnasa_5.pdb
Zanotuj wartości R i Rfree z pliku rnasa_6.pdb
6
7.
2016/17
Oglądnij końcowy efekt udokładniania, sprawdź też geometryczną poprawność struktury. Wczytaj do
programu Coot pliki rnasa_6.pdb i rnasa_6.mtz. A następnie utwórz diagram Ramachandrana dla
otrzymanej cząsteczki:
 wybierz VALIDATE z menu głównego,
 wybierz Ramachandran Plot i plik rnasa_6.pdb i kliknji,
 jak wygląda otrzymany diagram?
PYTANIE 7: Czy diagram Ramachandrana jest dobrym indykatorem jakości struktury?
ZADANIE DODATKOWE
Korzystając z wczytanych do programu Coot plików rnasa_6.pdb i rnasa_6.mtz. ponownie wyszukaj
UNMODELLED BLOBS. Przejdź do BLOB1. Znając sekwencję aminokwasową białka, sprawdź jakich
aminokwasów brakuje i dodaj je do modelu:
10
20
30
40
DVSGTVCLSA LPPEATDTLN LIASDGPFPY SQDGVVFQNR ESVLPTQSYG
60
70
80
90
YYHEYTVITP GARTRGTRRI ICGEATQEDY YTGDHYATFS LIDQTC







50
w menu CALCULATE wybierz FIT LOOP,
wpisz numery brakujących aminokwasów,
wpisz jednoliterowe symbole tych aminokwasów,
upewnij się, że widzisz odpowiedni fragment struktury i naciśnij FIT LOOP,
sprawdź czy wszystko pasuje, prawdopodobnie brakuje końcowego atomu tlenu O,
w menu CALCULATE wybierz OTHER MODELLING TOOLS,
dodaj OXT do odpowiedniej reszty aminokwasowej.
PYTANIE 5: Podaj pełne nazwy i numery aminokwasów dodanych do modelu.
Następnie, po wypełnieniu BLOB 1 zapisz plik z białkiem (FILE  SAVE COORDINATES) i nadaj mu nazwę
rnasa_7.pdb. Nie zamykaj programu Coot dopóki nie masz pewności, że zapisałeś plik rnasa_7.pdb !!!
MTZ in: rnasa_6.mtz
PDB in: rnasa_7.pdb
Zanotuj wartości R i Rfree z pliku rnasa_8.pdb.
LITERATURA:
1. Sanderson M.R. & Skelly J.V., Macromolecular Crystallography, conventional and high-throughput
methods, Oxford University Press 2007.
2. Rupp B., Biomolecular crystallography, principles, practice and application to structural biology,
Garland Science 2010.
7

OZNACZANIE BIAŁKA METODĄ LOWRY`EGO

Transkrypt

Podobne dokumenty

Format PDB (Protein Data Bank)

Wyszukiwanie rozpraw doktorskich w Repozytorium Naukowym PP:

1. Wrzuć interesujący Cię produkt do koszyka – „DODAJ DO

część 2

instrukcja jak wlaczyc ciasteczka w przegladarce.