Zalety i ograniczenia technik przesiewowych SSCP i DGGE w

Zalety i ograniczenia technik przesiewowych SSCP i DGGE w

&ARM0RZEGL.AUK†
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
:ALETYIOGRANICZENIATECHNIKPRZESIEWOWYCH33#0I$''%
WDIAGNOSTYCEMOLEKULARNEJ
!DVANTAGESANDLIMITATIONSOFSCREENINGTECHNIQUES33#0AND$''%
INMOLECULARDIAGNOSTICS
%WA-ORIC†*ANISZEWSKA,UDMIŒA7ÃGLARZ
+ATEDRAI:AKŒAD"IOCHEMIIgL’SKI5NIWERSYTET-EDYCZNYW+ATOWICACH
Streszczenie
Abstract
Analiza polimorfizmu konformacji jednoniciowych fragmentów DNA (ang. single stranded conformation polymorphism,
SSCP) jest łatwą, szybką i jedną z najczęściej stosowanych
technik elektroforetycznych umożliwiających wykrywanie
polimorfizmu genetycznego oraz innych niewielkich zmian
w materiale genetycznym, takich jak: mutacje punktowe, małe
delecje i insercje, czy też mikroinwersje. Technika ta wykorzystuje fakt, że podczas elektroforezy w warunkach niedenaturujących każda jednoniciowa cząsteczka DNA przyjmuje
właściwą sobie konformację zależną między innymi od jej
sekwencji, w związku z czym zamiana nawet pojedynczego
nukleotydu w kilkuset nukleotydowej nici spowoduje zmianę
struktury przestrzennej, co w konsekwencji prowadzi do różnic
w ruchliwości elektroforetycznej. Elektroforeza w gradiencie
czynnika denaturującego (ang. denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE) jest znaną od dawna metodą, powszechnie wykorzystywaną do przesiewowego wykrywania mutacji
w materiale genetycznym. Pozwala ona na zidentyfikowanie,
ale nie na dokładną charakterystykę mutacji punktowych oraz
niewielkich insercji i delecji. Technika DGGE wykorzystuje
fakt, że zmutowane cząsteczki DNA ulegają częściowej denaturacji w żelu w innym stężeniu czynnika denaturującego,
niż cząsteczki niezmutowane. W przedstawionej pracy opisano odmiany wyżej wymienionych technik molekularnych,
ich zalety i ograniczenia stosowania. Opisano również nową
technikę HRM przydatną do analizy polimorfizmów.
Single-stranded conformation polymorphism analysis of
DNA fragments (SSCP) is easy, fast and one of the most
commonly used electrophoretic techniques to detect genetic
polymorphisms and other minor changes in the genetic material, such as point mutations, small deletions, insertions
and microinversions. This technique exploits the fact that
during the electrophoresis under non-denaturing conditions
each single-stranded DNA molecule adopts a proper conformation dependent on its sequence, and therefore even
a single nucleotide substitution in several hundred nucleotide strands will change the spatial structure, which in turn
leads to differences in electrophoretic mobility. Electrophoresis in a gradient of denaturing factor (DGGE) is a well
known method commonly used for screening detection of
mutations in the genetic material. It allows identification,
but not an accurate characterization of point mutations,
small insertions and deletions. DGGE technique exploits
the fact that the mutant DNA molecules undergo partial denaturation in a gel at different concentration of denaturing
factor than non-mutated ones. In the paper, these two molecular techniques have been described including their advantages and limitations of use. Also desribes a new HRM
technique which useful for the analysis of polymorhisms.
Key words: SSCP analysis, DGGE analysis, HRM analysis, molecular diagnostics
Słowa kluczowe: analiza SSCP, analiza DGGE, analiza
HRM, diagnostyka molekularna
Technika SSCP
Analiza polimorfizmu konformacji jednoniciowych
fragmentów DNA (ang. single stranded conformation polymorphism, SSCP) jest łatwą, szybką i jedną z najczęściej
stosowanych technik elektroforetycznych umożliwiających
wykrywanie polimorfizmu genetycznego oraz innych niewielkich zmian w materiale genetycznym, takich jak: mutacje
punktowe, małe delecje i insercje, czy też mikroinwersje [1,
2]. Technika ta wykorzystuje fakt, że podczas elektroforezy
w warunkach niedenaturujących każda jednoniciowa cząsteczka DNA przyjmuje właściwą sobie konformację zależną
między innymi od jej sekwencji, w związku z czym zamiana
nawet pojedynczego nukleotydu w kilkuset nukleotydowej nici
spowoduje zmianę struktury przestrzennej, co w konsekwencji
prowadzi do różnic w ruchliwości elektroforetycznej [1, 2].
Materiał do analizy SSCP stanowią próbki DNA genomowego, bądź będącego produktem reakcji odwrotnej transkrypcji, komplementarnego DNA (cDNA, complementary
DNA). Docelowa sekwencja jest amplifikowana w reakcji
łańcuchowej polimerazy (ang. polymerase chain reaction,
PCR), której produkty są następnie wykorzystywane do właściwego badania polimorfizmu konformacji jednoniciowego
DNA (single-strand DNA, ssDNA) [1, 2].
&ARM0RZEGL.AUK
Pierwszy etap analizy SSCP obejmuje denaturację termiczną dwuniciowego DNA (double-strand DNA dsDNA,)
w buforze obciążającym z dodatkiem czynnika denaturującego (najczęściej formamid, rzadziej – mocznik lub wodorotlenek sodu) i mieszaniny barwników oraz szybkie schłodzenie
w celu zapobiegnięcia renaturacji rozdzielonych fragmentów
DNA [1]. W drugim etapie badania uzyskane jednoniciowe
cząsteczki poddawane są elektroforezie w niedenaturującym
żelu poliakrylamidowym. Ruchliwość elektroforetyczna
fragmentów ssDNA zależy od ich wielkości, ładunku oraz
struktury przestrzennej. W warunkach niedenaturujących
poszczególne jednoniciowe cząsteczki DNA przyjmują określoną konformację (strukturę drugo- i trzeciorzędową), uwarunkowaną wewnątrzcząsteczkowymi interakcjami. Przyjęta
struktura zależna jest od długości nici, sekwencji nukleotydów oraz umiejscowienia i liczby regionów, w obrębie których doszło do wewnętrznego sparowania zasad [3].
Technika SSCP umożliwia wykrywanie zarówno znanych mutacji i polimorfizmów, jak również nie opisanych
dotychczas zmian w materiale genetycznym. Nieznana mutacja może zostać dokładnie scharakteryzowana po zakończeniu analizy SSCP. W tym celu należy wypłukać z żelu
zmutowany fragment DNA, a następnie poddać go reamplifikacji i sekwencjonowaniu [3].
Czynniki wpływające na czułość metody SSCP
Na czułość opisanej metody wpływa wiele czynników,
takich jak: wielkość badanego fragmentu DNA i zawartość
w nim par GC, obecność specyficznych mutacji w analizowanym fragmencie, temperatura żelu podczas elektroforezy,
rodzaj żelu i stopień jego usieciowania, obecność glicerolu
w żelu, skład buforu (siła jonowa i pH) oraz stężenie DNA.
Optymalna długość fragmentów ssDNA do analizy SSCP
mieści się w zakresie 150-200 nukleotydów i zapewnia wykrywalność zmian w sekwencji na poziomie 80-90%. Dla
fragmentów o długości >300 par zasad (pz) obserwuje się
znaczny spadek czułości [2, 4, 5].
Uważa się, że za wyjątkiem transwersji G→T, typ mutacji w badanym fragmencie DNA nie wpływa znacząco
na czułość techniki [4]. Odkryto natomiast, że duża zawartość par GC w matrycowym DNA poprawia czułość
SSCP. Jest to prawdopodobnie spowodowane tworzeniem
większej liczby wiązań wodorowych, a zatem, bardziej
stabilnych konformerów [2, 5]. Z kolei stosunek cytozyny
do adenozyny w analizowanym fragmencie dodatnio koreluje z optymalną temperaturą elektroforezy (TS), która
może zostać oszacowana przy użyciu następującego wzoru:
TS = [80×C/(A+1)]/{2.71 + [C/(A+1)]} [6].
Temperatura żelu jest jednym z najważniejszych czynników wpływających na szybkość z jaką migrują cząsteczki ssDNA podczas elektroforezy i nie powinna przekraczać
20°C. W zbyt wysokiej temperaturze zmniejsza się wydajność tworzenia konformerów. Poza tym, często dochodzi
do powstawania dwóch niestabilnych struktur, które w trakcie rozdziału elektroforetycznego przechodzą z jednej formy
w drugą, czego efektem jest obecność smug i rozmytych prążków w elektroforegramie. Dane eksperymentalne wskazują, że
niewystarczająca kontrola temperatury podczas elektroforezy
może spowodować zmianę temperatury żelu nawet o 10°C.
Stąd też, aby zapewnić powtarzalność wyników oraz zapobiec
wynikom fałszywie ujemnym, bardzo ważne jest utrzymanie
jednolitej temperatury w trakcie elektroforezy [1, 7].
Najpowszechniej wykorzystywanym żelem do rozdziału
kwasów nukleinowych w przebiegu SSCP jest żel poliakrylamidowy o niskim stopniu usieciowania. W analizie SSCP
najczęściej wykorzystuje się żele o całkowitym stężeniu
akrylamidu w zakresie 4-12% oraz stopniu usieciowania
pomiędzy 2% a 3,4% [8]. Stopień usieciowania żelu wyrażany jest przy pomocy parametru %C, czyli stosunku masy
bisakrylamidu do sumy mas akrylamidu i bisakrylamidu
w przeliczeniu na 100 ml (%C = (bisakrylamid [g]/akrylamid+bisakrylamid [g]) × 100) [2, 8]. Stopień usieciowania
żelu można wyrażać też jako stosunek akrylamidu do bisakrylamidu (np. 19:1) [1].
Alternatywnymi podłożami używanymi w analizie SSCP
fragmentów znakowanych radioaktywnie są żele takie jak
Hydrolink, Hydrolink-D5000 oraz Hydrolink-MDE (MDE).
Udowodniono, iż żel Hydrolink cechuje się, w stosunku do
akrylamidu, większą jednolitością pod względem wielkości
porów oraz daje wyraźniejsze prążki, co wiąże się z jego
lepszą rozdzielczością [9].
Obecność w żelu dodatkowych składników może wpłynąć na poprawę jego zdolności rozdzielczej. Najczęściej dodawanym związkiem jest glicerol o stężeniu 5-10% [2, 3].
Przyjmuje się, że jego pozytywny wpływ na wykrywanie
mutacji w trakcie rozdziału elektroforetycznego jest związany z obniżeniem pH buforu Tris-boranowego ze względu na
reakcję glicerolu z jonami boranowymi bądź też wiąże się
z osłabieniem sił elektrostatycznego odpychania pomiędzy
ujemnie naładowanymi resztami fosforanowymi obecnymi
w szkielecie cząsteczki DNA, co prowadzi do większej stabilności konformerów [2, 10]. Glicerol opóźnia także migrację cząsteczek w żelu, szczególnie w temperaturze 4°C, co
prawdopodobnie ma związek z jego lepkością [2, 3].
Glavač i Dean [11] wykazali, że do żelu mogą zostać dodane inne związki o działaniu denaturującym, takie jak 5%
mocznik lub formamid, bądź też obojętne (10% dimetylosulfotlenek lub 10-15% sacharoza). Niemniej jednak, spośród
nich jedynie sacharoza wywiera podobny do glicerolu, wyraźnie korzystny wpływ na zdolność rozdzielczą badanego
żelu.
Dowiedziono również, że nałożenie do studzienki żelu
próbki o zbyt dużym stężeniu DNA spowoduje renaturację
jednoniciowych fragmentów kwasu nukleinowego, co z kolei przyczyni się do nieefektywnej analizy SSCP. Aby temu
zapobiec wystarczy bardziej rozcieńczyć próbkę buforem
obciążającym [1].
W niekorzystny sposób na skuteczność SSCP może również wpłynąć obecność w próbce starterów pozostałych po
reakcji PCR. Będą one łączyć się z komplementarnymi regionami w ssDNA, zmieniając ich konformację, a w związku z tym profil SSCP [12].
Wybrane odmiany techniki SSCP
Od momentu, gdy w 1989 roku opisano po raz pierwszy
technikę SSCP, dokonano wielu modyfikacji mających na
celu zwiększenie jej czułości, wydajności, a także bezpieczeństwa [1, 2].
Choć zasadniczo technika SSCP jest wykorzystywana do
badania DNA, to analiza polimorfizmu konformacji ssRNA
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
także jest możliwa. W porównaniu do metody DNA-SSCP,
w technice RNA-SSCP (rSSCP) wymagany jest dodatkowy
etap transkrypcji, w trakcie którego na bazie produktów PCR
generowane są cząsteczki ssRNA. Niemniej jednak, rSSCP
okazuje się być metodą skuteczniejszą w wykrywaniu mutacji, a ponadto umożliwia badanie fragmentów o długości
większej niż zazwyczaj stosowane odcinki DNA. Przyjmuje
się, że jest to wynikiem obecności w RNA dodatkowej grupy hydroksylowej, co sprzyja tworzeniu większego spektrum konformerów, które są dodatkowo bardziej stabilne
niż w przypadku DNA. Poza tym, badanie RNA zmniejsza
możliwość renaturacji jednoniciowych fragmentów kwasu
nukleinowego [13].
Inną próbą adaptacji metody do badania fragmentów
DNA dłuższych niż pozwala na to rutynowa analiza jest
użycie podczas elektroforezy buforu o niskim pH. Umożliwia to wykrywanie mutacji we fragmentach o długości
300-800 pz [10]. Kolejną możliwość niesie włączenie do
analizy SSCP trawienia zbyt długich produktów PCR enzymami restrykcyjnymi. Dzięki takiej modyfikacji możliwe
jest otrzymanie fragmentów DNA o optymalnej długości do
dalszego badania [14].
Jednym z problemów techniki SSCP jest reasocjacja
komplementarnych nici DNA. Metoda pozwalająca na eliminację tej przeszkody polega na użyciu biotynylowanych
primerów do reakcji PCR oraz perełek magnetycznych
opłaszczonych streptawidyną, co umożliwia izolację i wykorzystanie do dalszej analizy tylko jednej z dwóch komplementarnych nici [15].
Dowiedziono również, że jeśli badanego DNA nie podda
się działaniu wysokiej temperatury, to w elektroforegramie
ujawnią się, oprócz głównych, stabilnych konformerów,
także przejściowe, wolno migrujące prążki, które mogą
dostarczyć dodatkowych informacji o zmianach w badanej
sekwencji [16].
Maruya i wsp. [17] poddali produkty PCR denaturacji
termicznej w roztworze o niskiej sile jonowej (ang. low ionic strength, LIS), co okazało się być bardziej efektywnym
sposobem generowania ssDNA niż powszechnie stosowana
denaturacja termiczna w obecności formamidu. Co więcej,
powstające cząsteczki ssDNA były w roztworze LIS stabilne nawet w temperaturze pokojowej, w związku z czym nie
było konieczności chłodzenia próbek w lodzie po denaturacji termicznej. Odmiana ta została określona jako „low ionic
strenght single-stranded conformation polymorphism” (LIS
-SSCP), a jej dodatkową zaletą jest bardziej czytelny wzór
prążków w porównaniu do konwencjonalnego SSCP.
Dane eksperymentalne wskazują, że połączenie SSCP
z analizą heterodupleksów, a więc dwóch metod zdolnych
do wykrywania niewielkich zmian w sekwencji i wymagających podobnego wyposażenia, daje możliwość detekcji
większego odsetka mutacji, niż przy użyciu każdej z tych
metod oddzielnie [18, 19].
Kolejna odmiana SSCP, charakteryzująca się znacznie
wyższą czułością w porównaniu do klasycznej analizy, to
wielotemperaturowe SSCP (ang. multitemperature SSCP,
mSSCP). Technika mSSCP opiera się na obserwacji, że
wskutek kilkukrotnej zmiany temperatury żelu podczas natywnej elektroforezy SSCP zwiększa się wskaźnik wykrywalności punktowych zmian sekwencji, a także skraca czas
i całkowity koszt analizy. Dane eksperymentalne wykazały
ponadto, że wzór prążków powstały w wyniku zastosowania mSSCP charakteryzuje się lepszą zdolnością dyskryminacyjną niż profile uzyskane z badania tych samych próbek
w różnych, ale stałych temperaturach [7, 20].
Poprawę wydajności analizy SSCP można osiągnąć
przez połączenie jej z techniką multipleks-PCR, która polega na jednoczesnej amplifikacji kilku różnych fragmentów
DNA dzięki wprowadzeniu do mieszaniny reakcyjnej wielu par starterów. Produkty reakcji multipleks-PCR nakłada
się następnie do jednej studzienki w żelu, przez co możliwe
jest rozdzielenie nawet dziesięciu eksonów badanego genu
na jednej ścieżce żelu. Modyfikacja taka jest określana jako
multiplex-SSCP (MSSCP) [21].
Kolejną odmianą pozwalającą na analizę wielu fragmentów ssDNA na jednej linii żelu jest technika DOVAM
-S (ang. detection of virtually all mutations-SSCP), która
dodatkowo charakteryzuje się praktycznie 100% czułością
w wykrywaniu mutacji. W analizie DOVAM-S produkty
PCR zostają poddane elektroforezie w pięciu odmiennych,
niedenaturujących warunkach zgodnie z procedurą opisaną
przez Liu i wsp. [22]. Różnice dotyczą rodzaju żelu, buforu,
temperatury oraz dodatku glicerolu.
W celu wyeliminowania używanych w technice DOVAM-S znaczników radioizotopowych, a także zredukowania liczby żeli koniecznych do analizy, powstała kolejna
odmiana – fluorescent DOVAM-S (F-DOVAM-S) wykorzystująca barwniki fluorescencyjne. Technika F-DOVAM-S
jest połączeniem elektroforezy mSSCP (multitemperature
SSCP) w 2 zestawach warunków ze znakowaniem fluorescencyjnym. Pozwala to na wykrycie 97% mutacji, a ponadto przyczynia się do znacznego zwiększenia wydajności analizy. Użycie trzech barwników – 6FAM (niebieski),
VIC (zielony) oraz NED (żółty), daje możliwość rozdziału
w każdej linii żelu jednocześnie próbek pochodzących od
trzech pacjentów. Co więcej, stosowanie kilku różnokolorowych barwników stwarza możliwość włączenia do każdej
ścieżki żelu wewnętrznego wzorca, wskutek czego identyfikacja nawet niewielkich zmian położenia prążków stanie się
łatwiejsza [23].
Źródłem kolejnych modyfikacji w metodzie SSCP jest
sposób detekcji konformerów. Czułą, choć stwarzającą potencjalne niebezpieczeństwo dla wykonującego analizę, metodą jest użycie znakowanych radioaktywnie starterów lub
deoksynukleotydów do reakcji PCR [3]. Wśród najczęściej
stosowanych radioizotopów znajdują się 32P, 33P oraz 35S [3,
16, 24].
Jednym ze sposobów, które pozwalają na wykluczenie
znaczników izotopowych z analizy SSCP jest zastosowanie
w ich miejsce barwników fluorescencyjnych. Znakowanie
fluorescencyjne możliwe jest zarówno w trakcie reakcji PCR,
jak również po jej zakończeniu, a ponadto pozwala na wprowadzenie do analizy jednocześnie kilku barwników [23].
Innym rozwiązaniem dla nieizotopowej analizy SSCP
jest barwienie żelu solami srebra po zakończeniu elektroforezy. Metoda ta jest prawie tak czuła jak znakowanie
radioaktywne i daje możliwość trwałego zapisu wyników
i długotrwałego przechowywania żeli [1, 2]. Opisywano
przypadki barwienia żeli bromkiem etydyny, jednakże technika ta może być za mało czuła do wykrycia subtelnych
&ARM0RZEGL.AUK
zmian w profilu SSCP ze względu na rozkład barwnika [1, 3,
16]. Niemniej jednak, okazuje się być przydatna w analizie
rSSCP [13]. Istnieją także doniesienia o wybarwianiu żeli
barwnikami wykorzystywanymi w analizie sekwencyjnej,
takimi jak SYBR Green lub SYBR Gold [3].
Kolejnym sposobem detekcji prążków jest przeniesienie
rozdzielonych fragmentów ssDNA na nylonową membranę
w procesie Southern blotting oraz hybrydyzacja ze znakowanymi digoksygeniną produktami PCR, w połączeniu
z detekcją chemi-luminescencyjną [25].
Technika DGGE
Elektroforeza w gradiencie czynnika denaturującego
(ang. denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE) jest
znaną od dawna metodą, powszechnie wykorzystywaną do
przesiewowego wykrywania mutacji w materiale genetycznym. Pozwala ona na zidentyfikowanie, ale nie na dokładną
charakterystykę, mutacji punktowych oraz niewielkich insercji i delecji [26]. Technika DGGE wykorzystuje fakt, że
zmutowane cząsteczki DNA będą ulegały częściowej denaturacji w żelu w innym stężeniu czynnika denaturującego,
niż cząsteczki niezmutowane [26].
Etapem poprzedzającym elektroforezę w gradiencie
czynnika denaturującego jest amplifikacja badanego DNA
techniką PCR. W przypadku heterozygot produktami PCR
są dwa rodzaje homodupleksów i dwa typy heterodupleksów. Homodupleksy to struktury składające się z dwóch
prawidłowych lub dwóch zmutowanych nici DNA, natomiast
heterodupleksy powstają przez połączenie nici prawidłowej
ze zmutowaną, czego skutkiem jest obecność regionu z niepełnym sparowaniem zasad w miejscu mutacji. W przypadku
homozygot produktami PCR są jedynie homodupleksy, aby
więc otrzymać mieszaninę homo- i heteodupleksów, a tym samym zwiększyć prawdopodobieństwo wykrycia mutacji, należy zmieszać badany DNA z DNA osoby zdrowej [19, 26].
Następnie, produkty PCR są poddawane elektroforezie
w żelu poliakrylamidowym o wzrastającym stężeniu czynnika denaturującego (mocznik, formamid). Dodatkowo
elektroforezę przeprowadza się w podwyższonej, stałej temperaturze, zazwyczaj mieszczącej się w zakresie 50-65°C.
Elektroforeza może być wykonywana na żelach z prostopadłym lub równoległym, w stosunku do kierunku elektroforezy, gradientem związku denaturującego. W żelach z poziomym gradientem wykorzystuje się szeroki zakres stężeń
czynnika denaturującego, zazwyczaj 0-100% lub 20-70%,
natomiast w żelach z gradientem pionowym, zakres ten jest
mniejszy, co pozwala uzyskać lepsze rozdzielenie badanych fragmentów DNA [8]. W tym ostatnim przypadku, na
podstawie doniesień literaturowych, zaleca się, aby różnica
pomiędzy najwyższym i najniższym stężeniem związku denaturującego nie przekraczała 30% [26].
W trakcie rozdziału elektroforetycznego produkty PCR
migrują jako cząsteczki dwuniciowe, aż do miejsca, w którym stężenie związków denaturujących jest równe ich temperaturze meltingu (tm). W tym punkcie żelu zaczyna się denaturacja dsDNA, wskutek czego dochodzi do gwałtownego
zahamowania jego migracji [8].
Profil meltingu fragmentu DNA zależy od jego sekwencji (składu zasad i długości). Obecność niesparowanych
zasad w cząsteczkach heterodupleksów zmniejsza ich całkowitą stabilność, w związku z czym, w porównaniu do
homodupleksów, denaturują one w żelu przy mniejszym
stężeniu czynnika denaturującego, czyli charakteryzują się
niższą temperaturą meltingu. Stąd też, obecność mutacji
w badanym DNA jest widoczna w elektroforegramie jako
dodatkowe prążki [19, 26, 27].
Całkowitemu rozdzieleniu dsDNA zapobiega się wykorzystując jeden ze starterów w reakcji PCR, aby przyłączyć
do wybranego końca badanego fragmentu DNA sekwencję
bogatą w pary GC, tzw. GC clamp. Sekwencja taka, zazwyczaj o długości 40-60 nukleotydów, charakteryzuje się bardzo wysoką temperaturą denaturacji i pozostaje strukturą
dwuniciową, podczas gdy reszta cząsteczki ulega rozdzieleniu. Ponadto przyłączenie sekwencji GC clamp zmienia profil meltingu badanej cząsteczki i przyczynia się do znacznego wzrostu czułości techniki DGGE [26].
Istotne znaczenie dla prawidłowego przebiegu DGGE ma
określenie profilu meltingu badanego fragmentu DNA. Wykorzystywane w tym celu specjalne programy komputerowe
są także pomocne w wyborze odpowiednich starterów oraz
ustaleniu optymalnych warunków elektroforezy (zakresu
gradientu czynnika denaturującego). Warunki DGGE mogą
zostać również określone empirycznie, poprzez wykonanie
elektroforezy z poziomym gradientem czynnika denaturującego [26, 27]. W trakcie DGGE możliwe jest wykrycie
jedynie tych mutacji, które znajdują się w obrębie domeny
o najniższej temperaturze meltingu. Krzywa denaturacji takiej domeny powinna być jak najbardziej spłaszczona. Zazwyczaj taki obraz krzywej otrzymuje się po przyłączeniu
sekwencji GC clamp do jednego z końców badanego fragmentu DNA. W takim przypadku na wykresie powinna być
widoczna także dodatkowa domena, o wysokiej temperaturze meltingu, odpowiadająca sekwencji GC clamp [26, 27].
Optymalna długość produktów PCR do przeprowadzenia
DGGE mieści się w zakresie 200-400 pz, ponieważ dla fragmentów dłuższych trudno jest wyznaczyć krzywą meltingu
[26].
Odmiany techniki DGGE
TGGE (ang. temperature gradient gel electrophoresis)
oraz TTGE (ang. temporal temperature gradient gel electrophoresis) opierają się na takiej samej zasadzie jak DGGE,
z tą różnicą, że warunki denaturujące w trakcie elektroforezy uzyskuje się przez zastosowanie w miejsce wzrastającego stężenia chemicznego czynnika denaturującego, gradientu temperatury w połączeniu ze stałym stężeniem mocznika
w żelu. Analogicznie obecność mutacji jest wykrywana
dzięki temu, że heterodupleksy ulegają denaturacji w niższej
temperaturze niż homodupleksy [8, 28].
W metodzie TTGE temperatura wzrasta stopniowo i jednostajnie podczas całej elektroforezy, tak że w danym momencie jest jednakowa w każdym punkcie żelu, natomiast
w TGGE gradient temperaturowy jest stały, ustalony na
początku rozdziału elektroforetycznego [29]. W przypadku
obydwu wyżej wymienionych technik zastosowanie gradientu temperatury eliminuje konieczność przygotowywania żeli z gradientem związku chemicznego, co ułatwia wykonanie badania, a ponadto daje możliwość łatwej zmiany
zakresu gradientu [28, 29].
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
Na podstawie profilu meltingu badanego fragmentu
DNA, uzyskanego przy pomocy programu komputerowego, możliwe jest określenie zakresu temperatury odpowiedniego do wykrywania mutacji techniką TTGE. Biorąc pod
uwagę, że w metodzie tej wykorzystuje się żele denaturujące,
wyznaczoną najwyższą i najniższą temperaturę modyfikuje
się względem zawartości mocznika w żelu, ponieważ każdy
mol mocznika obniża temperaturę meltingu DNA o 2°C [8].
Technika TTGE umożliwia badanie cząsteczek DNA
o wielkości nawet do 1000 pz. Ponadto, według niektórych
autorów, może być przeprowadzana bez zastosowania sekwencji GC clamp. Upraszcza to dodatkowo procedurę badania oraz obniża jego koszty, a jednocześnie nie wpływa
negatywnie na czułość metody [29, 30].
Biyani i Nishigaki [31] opisali technikę μTGGE, która
opiera się na zasadzie analogicznej do TGGE z tym, że elektroforezę przeprowadza się na pięcio- lub dziesięciokrotnie
mniejszych żelach (2×2×0,5 cm). Dzięki temu do przeprowadzenia badania metodą μTGGE wystarcza kilkukrotnie
mniejsza objętość próbki (5 μl). Ponadto, w porównaniu
do konwencjonalnego TGGE, znacznie skraca się czas zarówno samej elektroforezy (6-12 min), jak i całej analizy
(< 1 h), co przekłada się na znaczne obniżenie kosztów badania. μTGGE zapewnia stukrotnie wyższą wydajność niż
TGGE, a przy tym dostarcza powtarzalnych wyników, które
w 99% są zgodne z wynikami uzyskanymi klasyczną metodą TGGE.
Kolejną odmianą DGGE jest technika CDGE (ang. constant denaturing gel electrophoresis), w której elektroforezę
przeprowadza się w stałym stężeniu związku denaturującego. CDGE nie wymaga przygotowywania żeli z gradientem
czynnika denaturującego, dzięki czemu może zostać wykorzystana do szybkiego i wydajnego poszukiwania w próbkach mutacji, uprzednio zidentyfikowanych przez DGGE
[8]. Optymalne stężenie czynnika denaturującego dla CDGE
określa się na podstawie żeli DGGE z poziomym lub pionowym gradientem związku denaturującego. Mianowicie,
wybiera się takie stężenie, przy którym odległość pomiędzy
prawidłowym, a zmutowanym DNA jest największa [8].
Niemniej jednak, aby uzyskać wiarygodne wyniki należy
zachować ostrożność przy dobieraniu stężenia związku denaturującego do CDGE, ponieważ okazuje się, że wykrycie
różnych mutacji, nawet w obrębie jednej domeny meltingu
może wymagać wykonania elektroforezy w różnych warunkach [32].
W celu detekcji badanego DNA w metodzie DGGE oraz
jej odmianach stosuje się barwienie żeli bromkiem etydyny
lub solami srebra [8].
Denaturacja DNA
z wysoką rozdzielczością (HRM)
Technika HRM umożliwia wykrywanie polimorfizmów
i identyfikację fragmentów DNA różniących się długością,
zawartością par GC lub sekwencją na podstawie krzywej denaturacji DNA bez stosowania specyficznych sond. Pozwala
na identyfikacje delecji, insercji i substytucji, a także na detekcję pojedynczych podstawień nukleotydowych (np. SNP).
Pierwszym etapem analizy jest amplifikacja badanego
fragmentu DNA, następnie denaturacja i powolna renatu-
racja w celu utworzenia heterodupleksu. W ostatnim etapie
mieszanina zostaje poddana precyzyjnej denaturacji w obecności barwika interkalującego. Podczas powolnego schładzania poszczególne nici DNA hybrydyzują losowo. Hybrydyzacja niekomplementarnych nici prowadzi do utworzenia
heterodupleksu. Niesparowane odcinki DNA posiadają
niższą stabilność konformacyjną i tym samym denaturują
w niższych temperaturach. Identyfikacja fragmentów DNA
polega, podobnie jak w przypadku standardowej denaturacji
DNA, na analizie krzywych topnienia. Delecje i insercje powyżej pięciu nukleotydów tworzą stabilne heterodupleksy
i można je identyfikować również poprzez standardową denaturację. W przypadku zmiany pojedynczych nukleotydów
niezbędny jest system gwarantujący precyzyjną akwizycję
sygnału fluorescencyjnego i niezwykle stabilną (co najmniej
±0.1°C) temperaturę [33, 34].
Metoda HRM jest prostsza i znacznie tańsza od genotypowania opartego na znakowanych sondach, a także od
czasochłonnych metod standardowych takich jak SSCP,
DHPLC, RFLP. Reakcje amplifikacji i denaturacji przeprowadzane są w jednej probówce, a wyniki otrzymywane
w ciągu około 40-60 min w zależności od protokołu amplifikacji.
Metoda wykorzystywana jest między innymi do:wykrywania mutacji punkowych/screening, genotypowania SNP/
dyskryminacji alleli, identyfikacji gatunkowej; identyfikacji
metylowanego DNA, analizy mikrosatelitów. Stosowanie
metody HRM znacznie ogranicza ilość fragmentów DNA
poddawanych sekwencjonowaniu dzięki wstępnej eliminacji tych, które nie wykazują różnic w sekwencji [33, 34].
Analiza SNP
Eco Real time PCR System może być wykorzystany do
wykrywania wszystkich czterech znanych klas polimorfizmów SNP: (1) C/T i G/A (2) C/A i G/T (3) C/G (4)
A/T. Najtrudniejsze do identyfikacji są polimorfizmy klasy
czwartej ze względu na najmniejsze różnice w temperaturze
topnienia (<0.2 °C). Identyfikacja fragmentów odbywa się
poprzez porównanie kształtów krzywych denaturacji oraz
precyzyjne wyznaczenie temperatury topnienia poszczególnych fragmentów DNA [33, 34].
Reakcja amplifikacji/analiza HRM
Analiza HRM powinna być poprzedzona wnikliwą analizą reakcji amplifikacji DNA. Zła wydajność amplifikacji
DNA z reguły prowadzi do błędnej analizy HRM. Przed
analizą HRM należy przeanalizować trzy podstawowe parametry amplifikacji: wartość Ct, końcową wartość fluorescencji oraz wydajność reakcji. Pierwszym etapem analizy
HRM jest normalizacja. Wymaga ona zdefiniowania linii
podstawowej przed- i po denaturacji tak, aby składała się
z możliwie dużej ilości punktów, lecz nie zachodziła na region przejścia.
Normalizacja pozwala na porównanie krzywych denaturacji między sobą i automatyczną identyfikację genotypów
na podstawie różnic w temperaturze topnienia (homozygoty)
i kształtów krzywej denaturacji (heterozygoty). Krzywe zaliczane są do tego samego genotypu na podstawie wartości
współczynnika procentowego. Oprogramowanie Systemu
Eco pozwala także na przedstawienie wyników w postaci
&ARM0RZEGL.AUK
różnicy krzywych denaturacji wyznaczonej w stosunku do
wybranej próby referencyjnej. Wykresy te dobrze ilustrują
różnice w badanych próbach [33, 34].
Podsumowanie
Czułość metody mSSCP została oceniona na 86%, a jej
powtarzalność na 99% w badaniach Bezak i wsp. [35], którzy wykorzystali tę technikę w analizie genu XI czynnika
krzepnięcia, a następnie otrzymane wyniki potwierdzili
przeprowadzając sekwencjonowanie z użyciem znaczników fluorescencyjnych. Biorąc pod uwagę mnogość czynników wpływających na efektywność analizy SSCP oraz
fakt, że mutacje powodujące zmianę ruchliwości w jednych
warunkach, mogą w innych okolicznościach takiej zmiany
nie spowodować, dany fragment DNA bada się zazwyczaj
w różnych warunkach, aby zwiększyć prawdopodobieństwo
ujawnienia zmian sekwencji. Odsetek mutacji wykrywanych metodą SSCP mieści się w zakresie od 70% do >95%
dla badań ze zmiennymi dwoma lub trzema parametrami [1,
2]. Jednym z najważniejszych czynników wpływających na
efektywność analizy SSCP jest wielkość badanego fragmentu DNA. Optymalna długość ssDNA powinna mieścić się
w zakresie 150-200 pz. Dla fragmentów dłuższych niż 300
pz czułość analizy znacznie spada [2]. Zaletą techniki SSCP
jest łatwa interpretacja wyników badania ze względu na
możliwość porównania położenia prążka w żelu względem
wzorca markera wielkości DNA. Wykorzystana w przeprowadzonych badaniach odmiana SSCP – mSSCP charakteryzuje się wyższą czułością w stosunku do klasycznej
analizy polimorfizmu konformacji jednoniciowych fragmentów DNA, z powodu zastosowania podczas elektroforezy gradientu temperatury zamiast przeprowadzania kilku
rozdziałów elektroforetycznych w stałych temperaturach
[7, 20].
Czułość techniki DGGE jest oceniana na 82-100%, kiedy do badanego fragmentu dołączona zostaje sekwencja GC
clamp [4, 19, 36]. Jednakże niektórzy autorzy uważają, że
na dzień dzisiejszy czułość DGGE jest za niska, aby metoda
ta mogła być rutynowo wykorzystywana w praktyce klinicznej [19]. Aby analiza DGGE była w pełni efektywna, należy
określić profil meltingu badanej sekwencji DNA oraz ustalić
zakres gradientu, w którym przewiduje się uzyskać najlepsze rozdzielenie badanych fragmentów. Wyboru warunków
dla elektroforezy z pionowym gradientem czynnika denaturującego można dokonać na dwa sposoby: albo wykorzystując specjalny program komputerowy (np. MacMelt™ firmy
Bio-Rad), albo empirycznie, przez wykonanie elektroforezy
poziomej w szerokim zakresie stężeń czynnika denaturującego (0-100%) [8, 27]. Użyteczność techniki DGGE jest
ograniczona ze względu na konieczność posiadania specjalnego aparatu, przygotowywania żeli z gradientem związków
denaturujących oraz syntezy primerów bogatych w pary GC
(GC clamp). Dodatkowo, w przypadku pewnych sekwencji
DNA (np. bogatych w pary GC lub zawierających więcej niż
jedną domenę meltingu), istnieje konieczność modyfikowania produktu PCR albo sekwencji primera przed dokonaniem
elektroforezy w gradiencie czynnika denaturującego, co wydłuża czas analizy i utrudnia jej wykonanie [8, 19, 26, 27].
Obecnie, metoda DGGE ustępuje miejsca swoim odmianom
(TGGE, TTGE, CDGE), których główną zaletą jest wyeliminowanie z użycia żeli z gradientem chemicznego czynnika denaturującego [8, 28, 29]. Również μTGGE wydaje się
być techniką potencjalnie użyteczną w praktyce klinicznej,
ze względu na znaczną redukcję kosztów i czasu analizy,
a także niewielką objętość próbki potrzebną do przeprowadzenia badania. Jednakże na dzień dzisiejszy metoda ta nie
jest powszechnie wykorzystywana, ponieważ dotychczas
nie przeprowadzono badań oceniających na szeroką skalę
jej czułość oraz swoistość [19, 31]. W przypadku analizy
DGGE wskazane jest określenie, przy pomocy programu
komputerowego, profilu meltingu dla każdego z badanych
amplimerów, ponieważ w trakcie elektroforezy w gradiencie
czynnika denaturującego istnieje możliwość wykrycia tylko
tych mutacji, które znajdują się w obrębie domeny o najniższej temperaturze meltingu. Ponadto analiza komputerowa
jest pomocna w wyborze optymalnych warunków analizy
(zakresu gradientu czynnika denaturującego) oraz dobraniu odpowiednich sekwencji starterów [27]. Nową opartą
na analizie PCR w czasie rzeczywistym techniką przydatną
w analizie polimorfizmów jest analiza HRM.
Piśmiennictwo
1. Napierała D i wsp. Wykrywanie mutacji punktowych
i polimorfizmu DNA metodą SSCP. [W:] Słomski R red.
Przykłady analiz DNA. Poznań: Wydawnictwo Akademii Rolniczej im. Augusta Cieszkowskiego w Poznaniu;
2004: 95-96.
2. Vorechovsky I. Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP) Analysis. [W:] Walker JM, Rapley R. red.
Medical Biomethods Handbook. Totowa, New Jersey:
Humana Press, Inc.; 2005: 73-77.
3. Gasser RB i wsp. Single-strand conformation polymorphism (SSCP) for the analysis of genetic variation. Nat
Protoc 2006; 1 (6): 3121-3128.
4. Kakavas VK i wsp. PCR-SSCP: a method for the molecular analysis of genetic diseases. Mol Biotechnol 2008;
38(2): 155-163.
5. Kakavas KV i wsp. Identification of the commonest
cystic fibrosis transmembrane regulator gene DeltaF508 mutation: evaluation of PCR--single-strand
conformational polymorphism and polyacrylamide gel
electrophoresis. Biomed Chromatogr 2006; 20(10):
1120-1125.
6. Li W i wsp. Estimation of the optimal electrophoretic
temperature of DNA single-strand conformation polymorphism by DNA base composition. Electrophoresis
2003; 24 (14): 2283-2289.
7. Constantinou M i wsp. Application of multiplex FISH,
CGH and MSSCP techniques for cytogenetic and molecular analysis of transitional cell carcinoma (TCC) cells
in voided urine specimens. J Appl Genet 2006; 47(3):
273-5.
8. The DCode™ Universal Mutation Detection System.
Bio-Rad 1996: 11-14, 27-28, 34-35. (http://www.bio-rad.
com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1709080C.pdf).
9. Børresen AL. Mismatch detection using heteroduplex
analysis. Curr Protoc Hum Genet 2002 Aug;Chapter
7:Unit 7.3.
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
10. Kozlowski P, Krzyzosiak WJ. Structural factors determining DNA length limitations in conformation-sensitive mutation detection methods. Electrophoresis 2005;
26(1): 71-81.
11. Krasteva ME, Garanina Z, Georgieva EI. Optimized
polymerase chain reaction-based single-strand conformation polymorphism analysis of p53 gene applied to
Bulgarian patients with invasive breast cancer Clin Exp
Med 2003; 3(3): 173-180.
12. van Oers JM. A simple and fast method for the simultaneous detection of nine fibroblast growth factor receptor 3 mutations in bladder cancer and voided urine Clin
Cancer Res 2005; 11(21): 7743-7748.
13. Wang QM i wsp. Rapid Differentiation of Phenotypically Similar Yeast Species by Single-Strand Conformation Polymorphism of Ribosomal DNA Appl Environ
Microb 2008; 74(9): 2604-2611.
14. Tsuji T, Niida Y. Development of a simple and highly sensitive mutation screening system by enzyme mismatch cleavage with optimized conditions for standard
laboratories Electrophoresis 2008; 29(7): 1473-1483.
15. Kakavas VK. PCR-SSCP: a method for the molecular analysis of genetic diseases. Mol Biotechnol 2008;
38(2): 155-163.
16. Kasuga T, Cheng J, Mitchelson KR. Metastable singlestrand DNA conformational polymorphism analysis
results in enhanced polymorphism detection. PCR Methods Appl 1995; 4(4): 227-233.
17. Abba MC, Gómez MA, Golijow CD. HLA-DQA1 allele typing by nonisotopic PCR-LIS-SSCP Braz J Med
Biol Res 2001; 34(7): 867-869.
18. Kozlowski P, Krzyzosiak WJ. Combined SSCP/duplex
analysis by capillary electrophoresis for more efficient mutation detection. Nucleic Acids Res 2001 15; 29(14): E71.
19. Hestekin CN, Barron AE. The potential of electrophoretic mobility shift assays for clinical mutation detection.
Electrophoresis 2006; 27 (19): 3805-3815.
20. I Konferencja Użytkowników DNA Pointer System.
Analiza zróżnicowania genetycznego metodą MSSCP.
Kucharczyk Techniki Elektroforetyczne; Warszawa
15.05.2003: 14-22, 25 (http://www.kucharczyk.com.pl/
konf2003/full.pdf).
21. Yip SP, Fung LF, Lo ST. Rapid detection of common southeast Asian beta-thalassemia mutations by nonisotopic multiplex PCR-SSCP analysis. Genet Test 2004; 8(2): 104-108.
22. Feng J i wsp. Candidate gene analyses by scanning or
brute force fluorescent sequencing: a comparison of
DOVAM-S with gel-based and capillary-based sequencing. Genet Test. 2007; 11(3): 235-240.
23. Mroske C i wsp. Toward a fluorescent SSCP technique
that detects all mutations: F-DOVAM-S. Anal Biochem
2007; 368 (2): 250-257.
24. Buzin CH i wsp. Scanning by DOVAM-S detects all
unique sequence changes in blinded analyses: evidence
that the scanning conditions are generic. Biotechniques
2000; 28 (4): 746-753.
25. Fregel R i wsp. Description of a simple multiplex PCRSSCP method for AB0 genotyping and its application
to the peopling of the Canary Islands. Immunogenetics
2005; 57(8): 572-578.
26. Roelfsema JH, Peters DJM. Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE). [W:] Walker JM, Rapley R red. Medical Biomethods Handbook. Totowa, New Jersey: Humana Press, Inc.; 2005: 79-86.
27. Wu Y i wsp. Improvement of fragment and primer selection for mutation detection by denaturing gradient
gel electrophoresis. Nucleic Acids Res. 1998; 26 (23):
5432-5440.
28. Buch JS. DNA mutation detection in a polymer microfluidic network using temperature gradient gel electrophoresis. Anal Chem 2004; 76(4): 874-81.
29. Shaji RV i wsp. Rapid detection of β-globin gene mutations
and polymorphisms by temporal temperature gradient gel
electrophoresis. Clin Chem 2003; 49 (5): 777-781.
30. Wong LJ i wsp. Improved detection of CFTR mutations
in Southern California Hispanic CF patients. Hum Mutat. 2001; 18 (4): 296-307.
31. Biyani M, Nishigaki K. Hundredfold productivity of genome analysis by introduction of microtemperature-gradient
gel electrophoresis. Electrophoresis 2001; 22 (1): 23-28.
32. Ridanpää M i wsp. Comparison of DGGE and CDGE in
detection of single base changes in the hamster hprt and
human N-ras genes. Mutat Res 1995; 334 (3): 357-364.
33. Wojdacz T i wsp. Limitations and advantages of MSHRM and bisulfite sequencing for single locus methylation studies. Expert Review of Molecular Diagnostics
2010, 10(5): 575-580.
34. Montgomery JL., Sanford LN., Wittwer CT. High-resolution DNA melting analysis in clinical research and
diagnostics. Expert Review of Molecular Diagnostics
2010, 10(2): 219-240.
35. Bezak A i wsp. Detection of single nucleotide polymorphisms in coagulation factor XI deficient patients by
multitemperature single-strand conformation polymorphism analysis. J Clin Lab Anal 2005; 19 (6): 233-240.
36. Balogh K i wsp. Genetic screening methods for the detection of mutations responsible for multiple endocrine neoplasia type 1. Mol Genet Metab 2004; 83 (1-2): 74-81.
data otrzymania pracy: 11.09.2010 r.
data akceptacji do druku: 02.11.2010 r.
Adres do korespondencji:
dr Ewa Moric-Janiszewska
Katedra i Zakład Biochemii Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach
ul. Narcyzów 1
41-200 Sosnowiec
Tel. +48 32 364 10 06
e -mail: [email protected]