Ekspresja genów heksozoaminidazy w perlaku ucha srodkowego u

490
PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS
Ekspresja genów heksozoaminidazy w perlaku
ucha środkowego u dorosłych
Hexosoaminidase gene expression in cholesteatoma in adults
Justyna Rutkowska1, Ewa Olszewska1, Edyta Waniewska1, Sylwia Czechowska 2,
Oksana Kowalczuk 3, Maria Borawska 2, Marlena Żukowska1, Renata Markiewicz 2, Marek Rogowski1
Otolaryngol Pol 2009;
63 (6): 490-495
SUMMARY
Background: Middle ear cholesteatoma is a cyst like structure composed of
keratinizing squamous epithelium that contains keratin debris and subepithelial
connective tissue. Bone resorption may lead to destruction of ossicular chain
and temporal bone. The higher activity of N-acetyl-β-glucosaminidase (HEX)
was noted in cholesteatoma tissue, compared to the controls. It is supposed,
that HEX takes part in bone resorption in middle ear cholesteatoma. Using
of HEX inhibitors in cultured fi broblasts and evaluation HEX mRNA expression may contribute to showing new ways of understanding cholesteatoma
pathogenesis.
The aim of the study: was to elaborate cholesteatoma fibroblast cell culture
(CF) technique and evaluate in vitro inhibition potential of pyrimethamine.
Material and methods: Cholesteatoma and normal retroauricular skin
sample obtained during surgical treatment were used in the study. CF served
as a study group and fibroblast derived from skin specimens – as controls.
Pyrimethamine was used at the concentrations of 1.5, 3, 10 and 20 μg/ml.
The reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) was carried
out for the determination of HEX gene expression.
Results: RT-PCR established the elevated expression of HEXA and HEXB
mRNA in cholesteatoma. HEXA mRNA in CF was six times higher than in the
controls. HEX mRNA expression found to be regulated by pyrimethamine.
Inhibition of HEXA and HEXB mRNA expression was achieved when the highest concentration of PYR was used. Low concentrations of pyrimethamine
upregulated HEX gene in CF.
Conclusions: Pyrimethamine, depending on its concentration, contributes
to regulating the HEX gene expression in CF and controls. Pyrimethamine
may be regarded as a new future research direction on factors, that may limit
development of cholesteatoma.
Hasła indeksowe: perlak, HEXA, HEXB, hodowla fibroblastów, ekspresja genów.
Key words: Cholesteatoma, hexosaminidase A, hexosaminidase B , cultured fi broblasts, gene expression.
©by Polskie Towarzystwo Otorynolaryngologów
– Chirurgów Głowy i Szyi
Otrzymano/Received:
28.07.2009
Zaakceptowano do druku/Accepted:
10.11.2009
1
Klinika Otolaryngologii Uniwersytetu
Medycznego w Białymstoku,
Kierownik prof. dr hab. M. Rogowski
2
Klinika Bromatologii Uniwersytetu Medycznego
w Białymstoku,
Kierownik prof. dr hab. M. Borawska
3
Zakład Klinicznej Biologii Molekularnej
Uniwersytetu Medycznego w Białymstoku,
Kierownik prof. dr hab. L. Chyczewski
Wkład pracy autorów/Authors contribution:
Justyna Rutkowska – zbieranie materiału, tworzenie
bazy danych, analiza wyników, formułowanie
wniosków, przygotowanie manuskryptu do
druku; Ewa Olszewska – pobieranie operacyjne
materiału do badań, opracowanie koncepcji
pracy, analiza wyników, formułowanie wniosków;
Edyta Waniewska – zbieranie piśmiennictwa,
analiza wyników, przygotowanie manuskryptu do
druku; Sylwia Czechowska, Renata Markiewicz
– prowadzenie hodowli komórkowej; Maria
Borawska – prowadzenie hodowli komórkowej,
analiza wyników badań; Oksana Kowalczuk
– oznaczenia ekspresji genów HEX, analiza
wyników badań; Marlena Żukowska – zbieranie
piśmiennictwa, przygotowanie manuskryptu do
druku; Marek Rogowski – pobieranie opreacyjne
materiału do badań
Konflikt interesu/Conflicts of interest:
Autorzy pracy nie zgłaszają konfliktu interesów.
Adres do korespondencji/
Address for correspondence:
imię i nazwisko: Ewa Olszewska
adres pocztowy:
Klinika Otolaryngologii UM w Białymstoku
ul. Skłodowskiej 24 A
15-276 Białystok
tel. 085 74 68 269
fax 085 74 68 697
e-mail [email protected]
Grant MniSW 401 079 31/1821
Wstęp
Proces resorpcji kości występujący w perlaku prowadzi do stopniowego niszczenia kosteczek słuchowych
i kości skroniowej. Stanowi to nie tylko zagrożenie
utraty słuchu, ale również rozwojem potencjalnych
powikłań wewnątrzczaszkowych. Enzymy lizosomalne,
do których należy N-acetylo-β-D-heksozoaminidaza
(HEX), wykazują wyższą aktywność w tkankach perlaka w porównaniu ze zdrową skórą [8]. Przypuszcza
się, że enzym ten może brać czynny udział w procesie
niszczenia kości przez perlak. Zastosowanie inhibitorów
HEX na hodowli komórkowej fibroblastów z perlaka
ucha środkowego oraz zbadanie ekspresji genów tego
enzymu przed i po podaniu inhibitorów może przyczy-
nić się do ukazania nowych szlaków patogenetycznych
perlaka. W naszym badaniu przeprowadziliśmy hodowlę fibroblastów pozyskanych z perlaka (FPUŚ) i wycinka
zdrowej skóry okolicy zausznej (FSOZ).
Początki hodowli tkanek sięgają roku 1907, kiedy
R.G. Harrison badając tkankę nerwową zarodków
żaby wykazał, że funkcje fizjologiczne komórki mogą
być kontynuowane poza organizmem żywym, w warunkach in vitro. Badania te rozpoczęły erę hodowli
tkanek i komórek [1].
Hodowla komórkowa pozwala obserwować zależność
przyrostu liczby komórek od czasu trwania hodowli
oraz wpływ odpowiednich stymulatorów lub inhibitorów
O tolar yngologia Polska tom 63, nr 6 , lis topad – gr udzień 20 0 9
PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS
na procesy wzrostu komórek oraz ekspresję wybranych genów przy użyciu niewielkich ilości materiału
badanego. Warunki in vitro umożliwiają bezpośrednie
zastosowanie różnych substancji oraz ocenę funkcji
i reaktywności komórek.
Perlak postrzegany jest przez niektórych autorów
jako forma przewlekłego procesu gojenia rany. Istotnym ogniwem tego procesu wydaje się być, należący do rodziny polipeptydowych czynników wzrostu,
TGF-β (Transforming Growth Factor β), który pobudza
wydzielanie enzymów lizosomalnych, w tym N-acetyloβ-D-heksozoaminidazy [2]. Kluczową rolę w gojeniu
rany i formułowaniu blizny odgrywają fibroblasty.
Zmiany w ich fenotypie powodują powstawanie nieprawidłowej blizny. Wykryto, że fibroblasty uzyskane
z takiej blizny posiadają również dużą ekspresję mRNA
TGF-β 1 [3].
Fibroblasty są komórkami mezenchymalnymi, które
poprzez wydzielanie substancji biorących udział w reakcji zapalnej oraz wzroście komórek mogą przyczyniać
się do pobudzenia procesu hiperproliferacji komórek
i rogowacenia keratynocytów w perlaku ucha środkowego [5, 6]. Wykazano, że aktywność proliferacyjna
jest istotnie wyższa w przewlekłym zapaleniu ucha
środkowego z perlakiem w porównaniu z tkanką kontrolną [2, 7].
Heksozominidazy są wydzielane między innymi
w leukocytach, granulocytach obojętnochłonnych,
komórkach tucznych, chondrocytach oraz fibroblastach
i katalizują reakcję odłączania reszt N-acetyloglukozoaminy i N-acetylogalaktozoaminy od nieredukującego
końca łańcuchów oligosacharydowych glikolipidów, proteoglikanów i glikoprotein. HEX jest najaktywniejszym
enzymem wśród egzoglikozydaz lizosomalnych.
Gen kodujący izoenzym HEXA zlokalizowany jest
na chromosomie 15 (15q23-q24). Mutacja tego genu
prowadzi do niedoboru lub niewłaściwego działania
enzymu przez niego kodowanego i odpowiada za chorobę Tay-Sachsa. Choroba ta polega na gromadzeniu się
gangliozydu GM2 w lizosomach komórek nerwowych
mózgu. Gen kodujący izoenzym HEXB położony jest
na chromosomie 5 (5q13).
Dotychczas nie oznaczano poziomów ekspresji genów heksozoaminidazy w fibroblastach z perlaka oraz
zdrowej skóry okolicy zausznej. Uważa się, że zmiany
w ekspresji genów w komórkach perlaka mogą brać
istotny udział w jego patogenezie [9].
W naszym doświadczeniu analizujemy znaczenie
inhibitora HEX, tj. pirymetaminy w ekspresji genów
heksozoaminidazy w fibroblastach perlaka. Wykazuje
ona działanie supresyjne wobec syntezy kwasów nukleinowych poprzez kompetycyjne hamowanie reduktazy
kwasu dihydrofoliowego. Potwierdzono zdolności inhibicyjne pirymetaminy wobec heksozoaminidazy, nieznane jest jednak jej oddziaływanie na profil ekspresji
genów HEX w fibroblastach [10].
O tolar yngologia Polska tom 63, nr 6 , lis topad – gr udzień 20 0 9
Celem naszej pracy jest ocena wpływu pirymetaminy na ekspresję genów HEX przed i po podaniu pirymetaminy w hodowli fibroblastów uzyskanych z perlaka
oraz z wycinków zdrowej skóry okolicy zausznej.
Materiał i metody
Do badań użyto perlak i wycinek zdrowej skóry okolicy
zausznej pobrane od tego samego, dorosłego chorego
podczas zabiegu operacyjnego z powodu przewlekłego
zapalenia ucha środkowego z perlakiem. Chory wyraził
pisemną zgodę na pobranie powyższych tkanek. Badanie uzyskało zgodę Komisji Bioetycznej Uniwersytetu
Medycznego nr R-I-002/267/2009.
Pobrane od pacjenta wycinek skóry i perlak rozdrabniano w płytce Petriego na cząsteczki wielkości ok.
1 mm2, następnie poddawano działaniu kolagenazy (0,1%)
przez 30 min., w temperaturze 37°C. Tkanki płukano
dwukrotnie medium hodowlanym (DMEM z glukozą
i L-glutaminą (Gibko, UK), 10% surowicą cielęcą NCS
(PAA), 1% Penicillin – Streptomycin (Sigma),15 mM
HEPES) i inkubowano w następujących warunkach:
37°C, 5% CO2, 95% wilgotności. Komórki nieprzylegające były usuwane. Adherentne komórki hodowano
do uzyskania połączenia między nimi. Pokrywające
całą powierzchnię naczynia fibroblasty trypsynizowano, rozcieńczano i rozlewano do płytek, hodowlanych
o średnicy 10 cm w liczbie ok. 106 komórek na płytkę.
Po osiągnięciu konfluencji komórek do płytek dodawano odpowiednie stężenia pirymetaminy (20 μg/ml, 10
μg/ml, 3 μg/ml, 1,5 μg/ml) w objętości 10 ml medium
na płytkę. Jako rozpuszczalników dla PYR użyto DMSO
(sulfotlenku dimetylu o stężeniu końcowym: 0,5%) oraz
etanolu (końcowe stężenie: 0,6 %). Po 5-dniowej inkubacji z PYR, medium usuwano, dwukrotnie płukano
płytki PBS (zbuforowany roztwór soli fizjologicznej bez
wapnia i magnezu, Biomed, Lublin), komórki tryp-synizowano i wirowano (1500 obr./min, 10 min). Przed
wirowaniem zliczano komórki w komorze Neubauera).
Kontrolę stanowiły fibroblasty inkubowane bez pirymetaminy, wyłącznie z dodatkiem 0,5% DMSO (FKD)
oraz 0,6% etanolu (FKE). Wyhodowano również linie
fibroblastów z perlaka oraz z wycinka zdrowej skóry
okolicy zausznej, które nie zostały poddane działaniu
PYR lub rozpuszczalników. Wyhodowane fibroblasty
barwiono immunohistochemicznie z wimentyną oraz
cytokeratyną (ryc. 1, 2).
Oceniano względne poziomy ekspresji genów izoenzymów HEXA i HEXB w wyhodowanych i zamrożonych
FPUŚ (hodowla komórkowa fibroblastów z perlaka ucha
środkowego) i FSOZ (hodowla komórkowa fibroblastów
z wycinków skóry okolicy zausznej). Do oceny ekspresji
genów wykorzystano metodę Real-time-PCR, czyli analizę przyrostu produktów PCR w czasie rzeczywistym.
Dla oznaczenia poziomu ekspresji genu zastosowano
metodę względną, polegającą na porównaniu ekspre-
491
492
PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS
Tabela I. Względne poziomy ekspresji genów HEXA (RQ HEXA) i HEXB (RQ
HEXB) w fibroblastach skóry okolicy zausznej oraz perlaka bez dodatku inhibitora i rozpuszczalników.
Hodowla fibroblastów
bez wpływu
PYR i rozpuszczalników
RQ HEXA
w FSOZ
RQ HEXA
w FPUŚ
RQ HEXB
w FSOZ
RQ HEXB
w FPUŚ
1,8
10,1
9,7
15,4
Tabela II. Względne poziomy ekspresji genów HEXA (RQ HEXA) i HEXB (RQ
HEXB) w fibroblastach skóry okolicy zausznej oraz perlaka po dodaniu pirymetaminy z etanolem oraz w fibroblastach kontrolnych (FKE).
Stężenie PYR
mcg/ml
RQ HEXA
w FSOZ
RQ HEXA
w FPUŚ
RQ HEXB
w FSOZ
RQ HEXB
w FPUŚ
FKE
9,13
68,9
3,3
2,1
1,5
54,9
67,1
0,8
14,1
3
25,1
137,1
1,4
2,6
Tabela III. Względne poziomy ekspresji genów HEXA (RQ HEXA) i HEXB
(RQ HEXB) w fibroblastach skóry okolicy zausznej oraz perlaka po dodaniu
pirymetaminy z DMSO oraz w fibroblastach kontrolnych (FKD).
Stężenie PYR
mcg/ml
RQ HEXA
w FSOZ
RQ HEXA
w FPUŚ
RQ HEXB
w FSOZ
RQ HEXB
w FPUŚ
FKD
62,9
29,0
8,2
14,3
10
9,6
1,1
4,7
7,7
20
12,3
Brak ekspresji
HEXA mRNA
3,9
Brak ekspresji
HEXB mRNA
sji genu w badanej próbce z ekspresją w komórkach
kontrolnych, którymi w naszym badaniu były ludzkie
komórki Raji. Całkowite RNA z fibroblastów oraz komórek Raji zostało wyizolowane przy użyciu gotowego
zestawu odczynników QIAGEN wg protokołu producenta (RNeasy PlusMini Kit). Do izolacji wykorzystano
1-5 x 106 komórek z hodowli. Wyizolowane RNA zostało
przepisane na cDNA w reakcji odwrotnej transkryptazy z zastosowaniem gotowego zestawu odczynników
(Applied Biosystems, High Capacity cDNA Reverse
Transcription Kit). Analiza Real-time PCR została
przeprowadzona z zastosowaniem swoistych wobec
transkryptów genów HEXA i HEXB starterów i sond
typu TagMan (Applied Biosystem). Kontrolą endogenną
były transkrypty genu GAPDH. Analizę wykonano na
aparacie ABIPRISM 7900 HT firmy Applied Biosystems.
Do obliczeń względnej ekspresji zastosowano metodę
ΔΔCt zgodnie ze wzorem:
RQ= 2-ΔΔCt, gdzie RQ - względna ekspresja genu
wobec komórek kontrolnych
-ΔΔCt= - (ΔCt badane - ΔCt kontrola)
ΔCt badane=(Ct gen badany - Ct GAPDH) dla fibroblastów
ΔCt kontrola=(Ct gen badany - Ct GAPDH) dla komórek Raji
GAPDH – jest genem o stałej ekspresji w komórkach
ludzkich, który w naszym badaniu został użyty do
normalizacji otrzymanych wyników.
Wyniki
Zaobserwowano różnice w poziomach ekspresji genów
w komórkach pozyskanych z perlaka i skóry okolicy
zausznej. Zastosowanie różnych stężeń inhibitora doprowadziło do uzyskania odmiennych ekspresji genów
HEX uzyskanymi dzięki metodzie PCR. Wyniki ekspresji genów HEXA i HEXB przedstawiono w tabelach
I-III. Odnotowano wzrost zarówno względnej ekspresji
genu HEXA wobec komórek kontrolnych (RQ HEXA)
jak i względnej ekspresji genu HEX B wobec kontrolnych komórek (RQ HEXB) w fibroblastach z perlaka
względem fibroblastów ze skóry (odpowiednio 10,1 vs
1,8 oraz 15,4 vs 9,7) (tab. I). Zastosowane stężenie
PYR 20 μg/ml zahamowało ekspresje genów HEXA
i HEXB FPUŚ. RQ przy tym stężeniu dla kontroli, którą
stanowiły fibroblasty inkubowane bez pirymetaminy,
wyłącznie z dodatkiem 0,5% DMSO (FKD) – miało wartość odpowiednio: 29 dla HEXA oraz 14,3 dla HEXB.
Przy najwyższym stężeniu PYR (20 μg/ml) RQ HEXA
FSOZ wynosiło 12,3 oraz dla HEXB 3,9. Przy stężeniu
PYR 10 μg/ml RQ HEXA FPUŚ wynosiło 1,1 vs 29,0 dla
FKD, a dla HEXB odpowiednio: 7,7 vs 14,3 względem
kontroli z 0,5 % DMSO (tab. III). Przy stężeniu PYR 3
i 1,5 μg/ml RQ HEXA FPUŚ wynosiły odpowiednio
137,1 i 67,1 w porównaniu do FKE 68,9 (tab. II). Przy
stężeniach 3 i 1,5 PYR μg/ml RQ HEXA FSOZ wynosiły:
25,1 oraz 54,9, przy FKE 9,13. Oznaczone wartości RQ
HEXB FPUŚ dla stężeń PYR 3 i 1,5 μg/ml: 2,6 i 14,1
były większe względem kontroli FKE, gdzie RQ równało
się 2,1 (tab. II).
Omówienie
W monokulturze komórki rosną w jednej warstwie. Jej
zaletą jest powtarzalność wyników hodowli, a wadę
stanowić może brak wszystkich bodźców płynących od
innych komórek obecnych w środowisku in vivo. Dlatego też monokultura wydaje się być bardziej przydatnym narzędziem do oceny potencjału czynnościowego
danej komórki, natomiast kokultury i multikultury
przypominające warunki in vivo wykazują zastosowanie się do oceny potencjału proliferacyjnego komórek
[11]. Trudności, z jakimi można się spotkać podczas
prowadzenia hodowli komórkowych na fibroblastach
i keratynocytach to stan zapalny pobieranej od pacjenta tkanki oraz możliwe jej zakażenie. Korzystne jest zatem zastosowanie mieszanki antybiotyków,
w naszym przypadku: penicyliny i streptomycyny.
W trakcie eksperymentalnych hodowli porównywano
O tolar yngologia Polska tom 63, nr 6 , lis topad – gr udzień 20 0 9
PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS
Ryc. 1. Fibroblasty perlaka. Barwienie immunohistochemiczne z wimentyną. Magn. X 200.
Ryc. 2. Fibroblasty perlaka. Barwienie immunohistochemiczne z cytokeratyną. Magn. X 200.
zdolności proliferacyjne keratynocytów w stosunku do
fibroblastów. Zaobserwowano w kolejnych pasażach
keratynocytów zmniejszenie tempa procesu proliferacji
z towarzyszącymi zmianami morfologicznymi komórek
w postaci ich powiększenia i spłaszczenia. Zdolność
proliferacyjna tych komórek zanikała już w trzecim
pasażu. Hodowane fibroblasty były stabilne pod względem morfologicznym i zachowywały zdolność podziałów
komórkowych do 10 pasaży. Stwierdzono jednak, że
proces proliferacji fibroblastów ulega nasileniu podczas
wspólnej ich hodowli z keratynocytami [12].
Zgodnie z teorią, że perlak jest przewlekłym procesem gojenia rany [2], warto przyjrzeć się fibroblastom,
które biorąc w nim udział, razem z komórkami śródbłonka naczyń, wędrują do prowizorycznej macierzy, a tam rozrastają się i zwiększają liczbę komórek
rany.
W złożonym mechanizmie powstania blizn przerostowych i keloidów obserwowany jest nadmiar produkcji
fibroblastów, który przypuszczalnie prowadzi do patologicznego przedłużenia procesu gojenia lub zaburzenia regulacji komórek odpowiedzialnych za gojenie
rany. Nieprawidłowo proliferujące fibroblasty gromadzą
nadmiar składników macierzy zewnątrzkomórkowej
[6]. Badania wykazują, że keratynocyty pokrywające
keloid odgrywają ważną rolę w powstawaniu keloidów
poprzez promowanie proliferacji i zmniejszonej apoptozy
na drodze mechanizmów parakrynnych [13]. Podobnie
współdziałanie omawianych komórek obserwowano
w perlaku [12].
Możliwość transformacji fenotypu fibroblastów perlaka w typ komórki nowotworowej nie została potwierdzona.
Stwierdzono, że nie wykazują one właściwości inwazyjnych typowych dla komórek neoplastycznych [14].
Nowoczesne metody hodowli mogą stanowić w przyszłości źródło odpowiedzi na pytanie o patomechanizm
perlaka. Hodowla tkanek w postaci modelu trójwymiarowego, pozwala uwiarygodnić postulowane teorie
rozwoju perlaka, np. migracji komórkowej lub metaplazji [12, 15].
Fibroblasty produkują kolagen, włókna istoty międzykomórkowej i proteoglikany. Zauważono, że podczas
hodowli modelu trójwymiarowego perlaka dwukrotnie
szybsze naskórkowanie miało miejsce w przypadku dodanej warstwy kolagenu na spodnią stronę obserwowanego ekwiwalentu skóry z perforacją. Poza tym stwierdzono istotną wędrówkę komórek nabłonka wzdłuż
brzegu perforacji. Obserwacja ta sugeruje słuszność
teorii migracji w patogenezie perlaka [15].
W badaniach własnych potwierdziliśmy wysoką
aktywność HEX w perlaku w porównaniu ze zdrową
skórą [8]. Stało się to bodźcem do oznaczeń ekspresji
genów HEX z fibroblastów perlaka, a następnie zastosowania inhibitora HEX w hodowlach komórkowych
fibroblastów.
Badania ekspresji genów i znaczenia fibroblastów
w nadmiernej hiperkeratynizacji prowadzili Yoshikawa i wsp. Wyniki ich badań wskazują na udział tych
mezenchymalnych komórek perlaka w nadmiernej
hiperkeratynizacji z uwagi na wysokie poziomy ekspresji genów kodujących substancje, które są zaangażowane w produkcję czynników kluczowych w procesie
zapalnym oraz wzroście komórek naskórka [6]. W fibroblastach wykazano znaczną ekspresję czynnika
wzrostu kolonii granulocytarno-makrofagowych (Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor – GMCSF), który może stymulować proces proliferacji oraz
wpływać na ostateczne różnicowanie keratynocytów
[7]. Produkowana przez keratynocyty interleukina 1
pobudza fibroblasty do wydzielania czynników wzrostu keratynocytów – KGF (Keratinocyte Growth Factor),
czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów – GM-CSF oraz transformującego
czynnika wzrostu α – TGFα (Transforming Growth
Factor–α), które są cytokinami zwrotnie potęgującymi
wzrost i różnicowanie keratynocytów. Wykorzystując
O tolar yngologia Polska tom 63, nr 6 , lis topad – gr udzień 20 0 9
493
494
PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS
ten fakt, fibroblasty inkubowano z dodatkiem IL-1α
i/lub IL-1β. Uzyskane poziomy ekspresji mRNA LARC
(chemokina wątrobowa), GM-CSF, epireguliny, ICAM1,
and TGFα były zdecydowanie wyższe w fibroblastach
uzyskanych z perlaka w porównaniu do fibroblastów
skóry. W przypadku LARC i GM-CSF dopiero dodatek
IL-1α i/lub IL-1β prowadził do wykazania ekspresji
ich genów, której nie obserwowano bez obecności wymienionych cytokin. Mechanizm epigenetyczny może
mieć, zdaniem autorów, wpływ na odmienność fenotypową fibroblastów pozyskanych z odmiennych
źródeł, przy ich jednakowym genotypie, a hodowanych i stymulowanych w identycznych warunkach [6].
Podobnie, w naszym badaniu fibroblasty hodowane
i poddawane działaniu inhibitora HEX w identycznych
warunkach wykazywały odmienne ekspresje genów
N-acetylo-β-D-heksozoaminidazy.
Tokuriki i wsp. przeanalizowali 1176 genów, wśród
których 9 wykazywało ekspresję wyłącznie w perlaku.
Były to geny dla: psoriazyny, kalgranuliny A (MRP-14)
i B, płytkowego czynnika wzrostu (PDGF), katepsyn C,
D, H, metaloproteinazy MMP-9 i inhibitora metaloproteinazy 1 (TIMP1). Nie zaobserwowano ekspresji tych
genów w skórze okolicy zausznej. Poza tym stwierdzono
nadekspresję genów kalgranuliny A (MRP-8), tymozyny
β-10, integryny β-1 (ITGB1) w perlaku względem tkanki
kontrolnej. Zmienione poziomy ekspresji genów mogą
mieć związek z procesami proliferacji, różnicowania
i inwazyjności komórek w perlaku [9].
Pirymetamina (2,4-diamino-5-p-chlorophenyl-6ethyl-pyrimidine) – jest środkiem przeciwpierwotniakowym, stosowanym w leczeniu zakażeń Toxoplasma
gondii oraz Plasmodium falciparum. Wywiera supresyjny wpływ na syntezę kwasów nukleinowych poprzez
kompetycyjne hamowanie reduktazy kwasu dihydrofoliowego. W wyniku tych reakcji dochodzi do niedoboru kwasu tetrahydrofoliowego, który jest kofaktorem
w procesie syntezy DNA. Okazało się, że pirymetamina
ma zdolności immunomodulacyjne. Indukuje bowiem
apoptozę limfocytów na drodze aktywacji kaskady kaspaz zależnej od kaspazy 8 i kaspazy 10, bez udziału
cząsteczki CD95/Fas. Może mieć bezpośredni wpływ
na mitochondria w procesie apoptozy i zmiany w poziomach ekspresji genów zaangażowanych w apoptozę, np.
bcl-2 [16]. Dzięki zastosowaniu pirymetaminy uzyskano
supresję proliferacji limfocytów [16]. Pirymetamina jest
również chemicznym chaperonem, czyli tzw. białkiem
opiekuńczym. Chemiczne chaperony łączą się z odkształconymi białkami i umożliwiają uzyskanie przez
nie odpowiedniej struktury, co zapobiega transportowi
nieprawidłowo sfałdowanych białek z retikulum endoplazmatycznego do cytozolu i ich degradacji. Właściwości pirymetaminy, która jest również kompetycyjnym
inhibitorem HEX, określono przy użyciu linii komórkowych fibroblastów pacjentów z gangliozydazą GM2
o późnym początku. Stwierdzono, że w przeciwieństwie
do innego inhibitora HEX – tioguaniny, pirymetamina
nie wykazuje cech toksyczności względem komórkowej
linii fibroblastów [10].
Wnioski
Hodowla fibroblastów z perlaka pozwala badać ekspresję wybranych genów oraz wpływ na komórki substancji
regulacyjnych, w naszym przypadku inhibitora HEX
– pirymetaminy. Stwierdza się różnice w ekspresji
genów heksozoaminidazy A i B w hodowli fibroblastów z perlaka, jak i zdrowej skóry. W fibroblastach
inkubowanych bez obecności inhibitora obserwuje się
istotnie większą ekspresję izoenzymów HEXA i HEXB
w perlaku w porównaniu ze skórą. Była ona prawie
6-krotnie większa w przypadku genu HEXA. Dodatek
inhibitora w postaci pirymetaminy wpływa na poziomy
ekspresji genów HEX. Stężenie PYR 20 μg/ml przyczynia się do inhibicji ekspresji genów HEXA i HEXB
w fibroblastach pozyskanych z perlaka, nie wywołuje
natomiast zahamowania ekspresji omawianych genów
w fibroblastach zdrowej skóry. W przypadku genu
HEXB żadne zastosowane przez nas stężenie inhibitora
nie umożliwiło uzyskania mniejszej ekspresji w perlaku w porównaniu ze zdrową skórą, jednak pozwalało
uzyskać niższe poziomy ekspresji genu w porównaniu z próbą bez dodatku pirymetaminy. W przypadku mRNA HEXA zaobserwowano istotnie mniejszą
(ok. 10-krotnie) ekspresję w fibroblastach z perlaka
w porównaniu z kontrolą przy stężeniu pirymetaminy
10 μg/ml HEXB. Stężenie to wpływało również hamująco na ekspresję mRNA HEXB. Ekspresje genów
HEXA i HEXB znacząco wzrastały przy dodaniu niskich stężeń inhibitora do inkubowanych komórek.
Pirymetamina w stężeniach 3 i 1,5 μg/ml wykazywała
zdolność zmniejszenia poziomu ekspresji w przypadku
genu HEXB w skórze.
Pirymetamina wykazuje zdolność regulacji ekspresji genów heksozoaminidazy, co wskazuje na potrzebę dalszych badań nad możliwością kontrolowania
aktywności enzymów lizosomalnych mających duże,
nie w pełni jeszcze poznane znaczenie w procesach
zapalnych oraz rozwoju perlaka ucha środkowego. Poznanie mechanizmów oddziaływania inhibitorów HEX
na perlak może przyczynić się do stworzenia nowych
możliwości terapeutycznych w tym schorzeniu.
PIŚMIENNICTWO
1.
Harrisson RG. Observations on the living developing nervefiber.Proc Soc Exp Biol Med 1907; 4: 140-143
2.
Huisman MA, De Heer E, Ten Dijke P, Grote JJ. Transforming growth factor and wound healing in human cholesteatoma. Laryngoscope 2008; 118: 94-98
3.
Wang R, Ghahary A, Shen Q, Scott PG, Roy K, Tredget
EE. Hypertrophic scar tissues and fibroblasts produce
more transforming growth factor-beta1 mRNA and protein
O tolar yngologia Polska tom 63, nr 6 , lis topad – gr udzień 20 0 9
PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS
than normal skin and cells. Wound Repair Regen 2000;
4.
Clarke JT et al. Pyrimethamine as a potential pharmaco-
Lerner UH. Transforming growth factor-beta stimu-
logical chaperone for late-onset forms of GM2 gangliosido-
lates bone resorption in neonatal mouse calvariae by
a prostaglandin-unrelated but cell proliferation-dependent
pathway. J Bone Miner Res 1996; 11(11):1628-1639
5.
Milewski C. Role of perimatrix fibroblasts in development
of acquired middle ear cholesteatoma. A hypothesis. HNO
1998; 46(5): 494-501
6.
2004 p. 45-50
12. Raynov AM, Choung YH, Yi Park H, Choi SJ, Park K. Establishment and characterization of an in vitro model for cholesteatoma. Clin Exp Otorhinolaryngol 2008; 1(2): 86-91
13. Funayama E, Chodon T, Oyama A, Sugihara T. Keratino-
pression profiles in fibroblasts derived from middle ear
cytes promote proliferation and inhibit apoptosis of the
cholesteatoma. Arch Otolaryngol Head Neck Surg 2006;
underlying fibroblasts: an important role in the pathogenesis of keloid. J Invest Dermatol 2003; 121(6): 1326-1331
Huang T, Yan SD, Huang CC. Colony-stimulating factor in
14. Chole RA, Faddis BT, Chamberlain S, Magilke D. Invasive-
middle ear cholesteatoma. Am J Otolaryngol 1989; 10(6):
ness of fibroblasts from experimental cholesteatomas. Otol
Neurotol 2001; 22(1):15-17
Olszewska E, Borzym-Kluczyk M, Olszewski S, Rogowski
15. Tanaka Y, Yaguchi Y, Wada K, Kojima H, Moriyama H. Cre-
M, Zwierz K. Hexosaminidase as a new potential mar-
ation of a cholesteatoma model using three-dimensional
ker for middle ear cholesteatoma. Clin Biochem 2006;
39(11):1088-1090
9.
kłowska S. Hodowla komórek i tkanek, Warszawa: PWN;
Saito H, Moriyama H. Identification of specific gene ex-
393-398
8.
sis. J Biol Chem 2007; 282(12): 9150-9161
11. Stokłowska S. Biologia i charakterystyka hodowli. W: Sto-
Yoshikawa M, Kojima H, Wada K, Tsukidate T, Okada N,
132(7):734-742
7.
10. Maegawa GHB, Tropak M, Buttner J, Stockley T, Kok F,
8(2):128-137
cultured skin equivalents. Laryngoscope 2005; 115:1421-7
16. Pierdominici M, Giammarioli AM, Gambardella L, De Feli-
Tokuriki AM, Noda I, Saito T, Narita N, Sunaga H, Tsuzuki
ce M, Quinti I, Iacobini M. Pyrimethamine induces apop-
H et al. Gene expression analysis of human middle ear
tosis of freshly isolated human T lymphocytes bypassing
cholesteatoma using complementary DNA arrays. Laryn-
CD95/Fas molecule but involving its intrinsic pathway. J
goscope 2003; 113(5): 808-814
Pharmacol Exp Ther 2005; 315(3): 1046-1057
O tolar yngologia Polska tom 63, nr 6 , lis topad – gr udzień 20 0 9
495