Wpływ metody ekstrakcji na pozyskiwanie związków

&ARM0RZEGL.AUK†
7PŒYWMETODYEKSTRAKCJINAPOZYSKIWANIE
ZWI’ZKÌWPOLIFENOLOWYCHZOBN̘YPSZCZELICH
4HEINFLUENCEOFEXTRACTIONMETHOD
ONOBTAININGPOLYPHENOLICCOMPOUNDSFROMBEEPOLLEN
!NNA2ZEPECKA†3TOJKO)ZABELA-ACIEJEWSKA†0ASZEK-AŒGORZATA3TEC%WA+URZEJA
!GNIESZKA+ÃSKA+ATARZYNA0AWŒOWSKA†'ÌRAL
+ATEDRAI:AKŒADˆYWNOuCIIˆYWIENIA
7YDZIAŒ&ARMACEUTYCZNYgL’SKI5NIWERSYTET-EDYCZNYW+ATOWICACH
Streszczenie
Pszczeli pyłek kwiatowy (obnóża pszczele) jest jednym
z produktów pszczelich, charakteryzującym się dużymi
walorami odżywczymi i biotycznymi. W skład pszczelego
pyłku kwiatowego wchodzi wiele związków, między innymi polifenole. Związki polifenolowe są cennym składnikiem diety człowieka. Wykazują różnorodne działanie
biotyczne, będące w dużej mierze wynikiem właściwości
antyoksydacyjnych. Celem pracy było oznaczenie zawartości związków polifenolowych w ekstraktach z obnóży
pszczelich otrzymanych trzema metodami: ekstrakcja
etanolowa, ekstrakcja enzymatyczna z zastosowaniem
pepsyny oraz w etanolowa ekstrakcja osadu otrzymanego
po uprzednio przeprowadzonej ekstrakcji enzymatycznej.
Oznaczenie zawartości polifenoli wykonano metodą kolorymetryczną z zastosowaniem odczynnika Folina-Ciocalteu. Zawartość polifenoli oznaczono w trzech próbkach
każdego z trzech rodzajów ekstraktów. Dla każdej próbki
wykonano po pięć powtórzeń. Stężenie polifenoli obliczono w oparciu o krzywą wzorcową dla kwasu galusowego.
Najwyższe stężenie polifenoli oznaczono w etanolowych
ekstraktach uzyskanych z osadu otrzymanego po uprzednio przeprowadzonej ekstrakcji enzymatycznej natomiast
najniższe w ekstraktach enzymatycznych. Stwierdzono, iż
zawartość związków polifenolowych w ekstraktach zależy od zastosowanej metody ekstrakcji i nie ma związku
z ogólną wydajnością tego procesu. Najbardziej efektywną metodą ekstrakcji substancji polifenolowych jest ekstrakcja etanolowa po uprzednio przeprowadzonej ekstrakcji pepsynowej.
Abstract
Bee pollen is one of bee products which has a significant
nutritional and biotic value. Bee pollen comprises many
compounds, including polyphenols. Polyphenolic compounds constitute a valuable component of human diet.
They possess varied biotic activity, which results mainly
from their antioxidant capacity. The aim of our study was
to determine the polyphenolic compounds content in bee
pollen extracts obtained by three methods, i.e.: ethanol extraction, pepsin extraction, and ethanol extraction of the
precipitate formed after earlier pepsin extraction. Colorimetric analysis with the use of the Folin-Ciocalteu reagent
(FCR) was employed to determine polyphenol content.
Polyphenol content was assessed in three samples from
each of three types of extracts, and the procedure was
repeated 5 times for each sample. The concentration of
polyphenols was calculated on the basis of the gallic acid
standard curve. The highest concentration of polyphenols was determined in ethanol extracts of the precipitate
formed after earlier pepsin extraction, whereas the lowest
one characterized enzymatic extracts. It was established
that polyphenol content of the extracts was related to the
extraction method, but it was not related to the overall effectiveness of the procedure. Ethanol extraction following
pepsin extraction is the most effective method of extracting polyphenols.
Key words: bee-collected pollen, pollen extracts, polyphenols
Słowa kluczowe: obnóża pszczele, ekstrakty pyłku
pszczelego, polifenole.
Wstęp
Pszczeli pyłek czyli obnóża pszczele są łatwo dostępnym produktem pszczelim bogatym w aktywne biologicznie związki, wywierające korzystny wpływ na organizm człowieka. Z powodu szerokiego spektrum działania od stuleci są stosowane w lecznictwie ludowym.
Bogactwo substancji obecnych w obnóżach powoduje,
że spośród produktów pszczelich wyróżniają się zarówno dużą wartością odżywczą jak i wysoką aktywnością
biologiczną. W obnóżach stwierdzono występowanie
ponad 200 różnych substancji chemicznych takich jak:
białka i aminokwasy egzogenne, węglowodany, lipidy
bogate w niezbędne nienasycone kwasy tłuszczowe,
błonnik, karotenoidy, witaminy i biopierwiastki oraz
związki polifenolowe [1-3].
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
Badania doświadczalne i kliniczne dowodzą, iż obnóża
pszczele wykazują korzystne działanie farmakologiczne w
stanach zapalnych gruczołu krokowego jak również zaburzeniach przemiany lipidowej, a także wykazują działanie
detoksykacyjne, antybakteryjne i przeciwgrzybicze, antyalergiczne, antyoksydacyjne [4, 5].
Obok zastosowania w medycynie, pszczeli pyłek kwiatowy
wykorzystywany jest często w żywieniu jako składnik wspomagający odżywianie. Spożywany w niewielkich ilościach, zapobiega niedoborom niektórych składników odżywczych [6].
Dlatego też, wśród wielu zastosowań pszczelego pyłku
kwiatowego w medycynie, nie sposób pominąć tak cennego działania pyłku, jakim jest działanie prozdrowotne.
Z tego względu pszczeli pyłek kwiatowy wykorzystywany
jest również w leczeniu chorób cywilizacyjnych, na które
zapada coraz większa cześć populacji. Prewencyjne działanie pyłku w stosunku do niektórych chorób zdeterminowane
jest obecnością w jego składzie tak cennych substancji jakimi są związki polifenolowe [4, 7, 8].
Polifenole są substancjami o działaniu antyoksydacyjnym, chronią komórki przed uszkodzeniami wywołanymi
przez wolne rodniki - cząsteczki o dużej reaktywności. Wolne rodniki niszczą błony komórkowe oraz zaburzają podstawowe procesy enzymatyczne przebiegające w komórce,
przez co zakłóceniu ulega homeostaza całego organizmu.
Substancje o właściwościach antyoksydacyjnych mają zdolność wychwytywania wolnych rodników, dzięki czemu zapobiegają wielu chorobom, wywołanym stresem tlenowym
[7, 9]. Badania epidemiologiczne wykazują wyraźną zależność między zwiększeniem spożycia substancji antyoksydacyjnych, a zmniejszeniem zachorowalności i umieralności
z powodu choroby niedokrwiennej serca. Co więcej, spożywanie w diecie znacznej ilości tych substancji zapobiega
rozwojowi miażdżycy oraz jej następstwom, jakimi mogą
być: zawał mięśnia sercowego, udar mózgu, zaćma, zwyrodnienie plamki ocznej. Stąd bardzo ważnym jest dostarczanie wraz z pożywieniem optymalnej ilości tych cennych
substancji. Dzienne spożycie polifenoli powinno wynosić
1-2 g. W związki polifenolowe bogate są szczególnie aronia,
jagody, kapusta, czosnek, rośliny strączkowe oraz napoje:
czerwone wino oraz zielona herbata. Cennym źródłem polifenoli jest również pszczeli pyłek kwiatowy [7, 10, 11].
Biorąc pod uwagę opisane powyżej właściwości związków polifenolowych, oraz trudności związane z ich pozyskiwaniem z surowców naturalnych, celem pracy było oznaczenie zawartości związków polifenolowych w ekstraktach z
obnóży pszczelich otrzymanych trzema metodami: ekstrakcja
etanolowa, ekstrakcja enzymatyczna z zastosowaniem pepsyny oraz w etanolowa ekstrakcja osadu otrzymanego po
uprzednio przeprowadzonej ekstrakcji enzymatycznej.
Materiał i metody
Materiał do badań stanowiły mielone obnóża pszczele
pochodzące ze zbiorów w roku 2007 z Pasieki „Barć” im.
Ks. dr Henryka Ostacha w Kamiannej.
Badania prowadzono na trzech rodzajach ekstraktów
z obnóży pszczelich: ekstraktach etanolowych, ekstraktach
uzyskanych na drodze trawienia obnóży pszczelich pepsyną
(tzw. ekstrakty enzymatyczne) oraz etanolowych ekstrak-
tach uzyskanych z osadu otrzymanego po uprzednio przeprowadzonej ekstrakcji enzymatycznej.
Przygotowanie ekstraktów etanolowych z obnóży pszczelich
(EEO)
Do badań sporządzono 3 próbki etanolowych ekstraktów
obnóży pszczelich według metody opisanej przez AlmarazAbarca N. i wsp. [12] z niewielką własną modyfikacją.
W tym celu pobrano i odważono 3 próbki po 20 g zmielonych obnóży pszczelich. Każdą próbkę obnóży ekstrahowano 5-krotnie wodnym roztworem etanolu o stężeniu
50% (v/v) porcjami po 200 cm3 . Ekstrakty każdorazowo
wstrząsano przez 60 min. w temperaturze pokojowej w celu
maceracji obnóży. Wszystkie 5 porcji po ekstrakcji połączono i przesączono pod zmniejszonym ciśnieniem z użyciem
pompy wodnej, a następnie przesącz wirowano przy 10
tys. obr/min. przez 10 min. Supernatant odparowano pod
zmniejszonym ciśnieniem w rotacyjnej wyparce próżniowej
UNIPAN-PRO 350P. Odparowany ekstrakt suszono do stałej masy w cieplarce w temp. 38°C. Otrzymane suche ekstrakty etanolowe obnóży pszczelich zważono, a następnie
rozpuszczono w 100 cm3 50% (v/v) r-ru wodnego etanolu.
Tak przygotowane ekstrakty wykorzystano do oznaczenia
zawartości związków polifenolowych po odpowiednim rozcieńczeniu wodnym r-rem etanolu o stęż. 50% (v/v) do uzyskania końcowego stężenia 0,2 mg/ml. Ekstrakty etanolowe
z obnóży pszczelich nazwano dalej EEO.
Przygotowanie enzymatycznych ekstraktów pepsynowych
z obnóży pszczelich (EPO)
Przygotowanie enzymatycznego ekstraktu pepsynowego z
obnóży wykonano na podstawie metody opisanej przez Nagai
T. i wsp. [13], dokonując niewielkiej modyfikacji własnej.
Pobrano i odważono 3 próbki po 20 g obnóży pszczelich.
Następnie każdą z próbek zmieszano z 5-krotną objętością
wody destylowanej, która została uprzednio zakwaszona
stężonym HCl do pH = 2. Do każdej z próbek dodano pepsyny do uzyskania stężenia około 1,0%. Następnie próbki
inkubowano w temperaturze 37°C przez 48 h. Hydroliza została zatrzymana poprzez 10 minutowe gotowanie. Uzyskane ekstrakty enzymatyczne przesączono pod zmniejszonym
ciśnieniem z użyciem pompy wodnej, a następnie przesącz
wirowano przy 10 tys. obr/min. przez 10 min. Supernatant
odparowano w rotacyjnej wyparce próżniowej UNIPANPRO 350P. Otrzymane ekstrakty suszono do stałej masy
w cieplarce w temp. 38°C. Suche ekstrakty enzymatyczne
zważono, po czym rozcieńczono w 100 cm3 wody destylowanej. Tak przygotowane ekstrakty wykorzystano do oznaczenia zawartości związków polifenolowych po odpowiednim
rozcieńczeniu wodą destylowaną do uzyskania końcowego
stężenia EPO 0,2 mg/ml. Ekstrakty te nazwano dalej EPO.
Przygotowanie ekstraktów etanolowych po uprzednim trawieniu enzymatycznym pepsyną (EPEO)
Uzyskane 3 osady po wcześniej przeprowadzonej ekstrakcji enzymatycznej obnóży ekstrahowano 200 cm3 50%
(v/v) wodnego r-ru etanolu. Ekstrakcję prowadzono przez
&ARM0RZEGL.AUK
Tab. I. Wydajność ekstrakcji i zawartość polifenoli w ekstraktach i w obnóżach pszczelich.
Sucha masa ekstraktu
Wydajność ekstraktu
Zawartość polifenoli w ekstraktach
(mg GAE/g ekstraktu)
Ekstrakty etanolowe
obnóży
EEO
9,91±0,42
49,57±2,1
Ekstrakty pepsynowe
obnóży
EPO
14,14±0,75
70,7±3,42
Ekstrakty etanolowe
po hydrolizie pepsyną
EPEO
1,67±0,33
------
32,4±6,14
6,67±1,87
38,02±2,04
16,10±3,43
4,75±1,48
------
Zawartość polifenoli w obnóżach pszczelich
(mg GAE/g pyłku)
GAE - ekwiwalenty kwasu galusowego (Gallic Acid Equivalent)
60 min. w temperaturze pokojowej, często wstrząsając. Ekstrakty przesączono pod zmniejszonym ciśnieniem, a następnie przesącz wirowano przy 10 tys. obr/min. przez 10 min.
Supernatant odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem
w rotacyjnej wyparce próżniowej UNIPAN-PRO 350P. Następnie ekstrakty suszono w cieplarce w temp. 38°C do stałej masy. Suche ekstrakty rozpuszczono w 16 cm3 50% (v/v)
wodnego r-ru etanolu. Tak przygotowane ekstrakty wykorzystano do oznaczenia zawartości związków polifenolowych po
ich wcześniejszym rozcieńczeniu do uzyskania stężenia końcowego 0,2 mg/ml. Ekstrakty te nazwano dalej EPEO.
Oznaczanie polifenoli w uzyskanych ekstraktach
Oznaczenie ogólnej zawartości polifenoli w ekstraktach
z pyłku pszczelego przeprowadzono według metody kolorymetrycznej z wykorzystaniem odczynnika Folina-Ciocalteu,
przedstawionej w pracy Singleton V.L. i wsp. [14].
Odczynnik Folina-Ciocalteu jest mieszaniną kwasów:
fosforowolframowego i fosforomolibdenowego, które
pod wpływem związków polifenolowych ulegają redukcji
do niebieskich tlenków wolframu i molibdenu, natomiast
związki fenolowe ulegają utlenieniu. Tlenki wykazują maksimum absorbancji przy λ= 760 nm, a natężenie zabarwienia
jest proporcjonalne do całkowitej zawartości związków fenolowych w próbce.
W celu oznaczenia ogólnej zawartości związków polifenolowych z każdego z ekstraktów o stężeniu 0,2 mg/cm3
pobierano do jednorazowych probówek po 1 cm3 ekstraktu, dodawano 1 cm3 odczynnika Folina-Ciocalteu i pozostawiano na 5-8 min. Po tym czasie dodawano 1 cm3 10%
roztworu węglanu sodu. Próbki inkubowano przez 1 godz.
w temp. pokojowej. Następnie w każdej z próbek wykonano
pomiar absorbancji przy długości fali λ= 760 nm, w kuwecie
kwarcowej o długości drogi świetlnej 1 cm wobec próby
odnośnikowej, którą stanowił odczynnik Folina-Ciocalteu
z dodatkiem r-ru 10% węglanu sodu i 50% (v/v) wodnego
r-ru etanolu lub wody destylowanej. Dla każdej z próbek
wykonano po 5 powtórzeń. Stężenie polifenoli obliczano na
podstawie krzywej wzorcowej sporządzonej dla kwasu galusowego w zakresie stężeń 0,01-0,15 mg/cm3. Wyniki przedstawiono jako ekwiwalenty kwasu galusowego (mg GAE/g
suchej masy ekstraktu i mg GAE/g pyłku pszczelego)
Wyniki i ich omówienie
Zawartość związków polifenolowych w obnóżach
pszczelich określono poprzez ocenę stężenia tych substancji w ekstraktach z obnóży otrzymanych trzema różnymi
metodami. Dwie z zastosowanych w pracy metod ekstrakcji tzn. ekstrakcja etanolowa i ekstrakcja enzymatyczna
z zastosowaniem pepsyny opisane są w literaturze [12, 13].
Trzecia metoda polegająca na ekstrakcji etanolem po wcześniej przeprowadzonej hydrolizie enzymatycznej nie była
dotychczas przedstawiona w dostępnym piśmiennictwie.
Uzyskane wyniki przeprowadzonych badań pozwoliły
ocenić wydajność zastosowanych metod ekstrakcji. Wydajność procesu oceniono poprzez oznaczenie suchej masy
otrzymanego ekstraktu. Stwierdzono, iż w efekcie przeprowadzenia enzymatycznej ekstrakcji pepsynowej otrzymano
średnio 14,14 g suchej masy ekstraktu, a obliczona na tej
podstawie wydajność procesu ekstrakcji wynosi średnio
70,7% (Tab. I). W porównaniu z danymi zamieszczonymi
w dostępnym piśmiennictwie uzyskano średnio o 25,7%
wyższą wydajność, gdyż podana w pracy Nagai (2005) [13]
wydajność ekstrakcji enzymatycznej z zastosowaniem pepsyny wynosi 45%. W przypadku ekstrakcji etanolem uzyskano 9,91 g suchej masy ekstraktu, a obliczona wydajność
ekstrakcji wynosi 49,57% (Tab. I). Podana w piśmiennictwie wydajność ekstrakcji etanolem wynosi 31,1% [6], co
świadczy o tym, iż uzyskano o 18,47% wyższą wydajność
procesu.
Na podstawie uzyskanych danych stwierdzono najwyższą zawartość polifenoli w suchej masie ekstraktu etanolowego po uprzednio przeprowadzonej hydrolizie enzymatycznej, która wynosiła średnio 38,02 mg/g ekstraktu (Tab.
I). Średnia zawartość polifenoli obliczona dla ekstraktów
etanolowych wyniosła 32,4 mg/g ekstraktu (Tab. I). Wartość
ta jest wyższa od średniej podanej w literaturze [6] wynoszącej 24,6 mg/g ekstraktu o 7,8 mg/g. Natomiast średnia
zawartość polifenoli oznaczona w enzymatycznych ekstraktach pepsynowych wyniosła 6,67 mg/g ekstraktu (Tab. I)
i jest niższa od podanej w piśmiennictwie [13] średniej zawartości polifenoli wynoszącej 10,39 mg/g o 3,72 mg/g.
W oparciu o wykonane pomiary i oznaczenia, obliczono także średnią zawartość polifenoli w miligramach w odniesieniu do 1g badanych obnóży. W przypadku polifenoli
oznaczonych w ekstraktach etanolowych wartość ta w przeliczeniu na 1g obnóży wyniosła średnio 16,1 mg/g (Tab. I).
Średnia zawartość polifenoli oznaczonych w ekstraktach
etanolowych według danych zawartych w piśmiennictwie
[6] wynosi 8,2 mg/g pyłku. Tak więc, średnia zawartość polifenoli w przeliczeniu na 1g badanych obnóży jest o 7,9
mg/g wyższa. Średnia zawartość polifenoli w przeliczeniu
na 1g badanych obnóży oznaczona w ekstraktach enzymatycznych wynosi 6,67 mg/g (Tab. I) i jest o 3,72 niższa
od średniej podanej w literaturze, wynoszącej 10,39 mg/g,
[13].
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
Podsumowując stwierdzono, iż oznaczona zawartość
polifenoli w odniesieniu do masy ekstraktu nie ma związku
z wydajnością procesu ekstrakcji, co potwierdzają uzyskane wyniki. W przypadku ekstraktów etanolowych średnia
wydajność procesów ekstrakcji wyniosła 49,57%, natomiast
oznaczona średnia zawartość polifenoli wyniosła 32,4 mg/g
ekstraktu, i była znacznie wyższa niż średnia zwartość polifenoli oznaczona w ekstraktach enzymatycznych, która
wyniosła 6,67 mg/g ekstraktu, gdzie wydajność procesu
ekstrakcji w tym przypadku wyniosła aż 70,7%.
Tak więc, zastosowana metoda przeprowadzenia procesu
ekstrakcji ma istotne znaczenie w odniesieniu do efektywności
pozyskiwania związków polifenolowych. Najefektywniejszą
metodą ekstrakcji związków polifenolowych jest przeprowadzenie ekstrakcji etanolowej osadu uzyskanego po wcześniej
przeprowadzonej ekstrakcji enzymatycznej z zastosowaniem
pepsyny. W ekstraktach otrzymanych tym sposobem oznaczono najwyższą zawartość polifenoli wynoszącą średnio 38,02
mg/g ekstraktu. Na tej podstawie można przypuszczać, iż pod
wpływem pepsyny i kwaśnego środowiska (pH=2) zostaje
nadtrawiona błona komórkowa ziarenek pyłku wchodzącego
w skład obnóży, co z kolei wpływa na lepszą efektywność działania rozpuszczalnika etanolowego, a co za tym idzie, wyższą
efektywność ekstrakcji związków polifenolowych.
Wnioski
Stwierdzono, iż zawartość związków polifenolowych
w ekstraktach zależy od zastosowanej metody ekstrakcji
i nie ma związku z ogólną wydajnością tego procesu. Najbardziej efektywną metodą ekstrakcji substancji polifenolowych jest ekstrakcja etanolowa po uprzednio przeprowadzonej ekstrakcji enzymatycznej pepsyną.
Piśmiennictwo
1. Almeida-Muradian LB i wsp. Chemical composition and
botanical evaluation of dried bee pollen pellets. J Food
Compos Anal 2005; 18: 105-111.
2. Szczęsna T.: Protein content and amino acid composition
of bee-collected pollen from selected botanical origins.
J Apicult Sci 2006; 50: 81-90.
3. Szczęsna T.: Long-chain fatty acids composition of honeybee-collected pollen. J Apicult Sci 2006; 50: 65-79.
4. Campos MG wsp.: Age-induced diminution of free radical scavenging capacity in bee pollens and the contribution of constituent flavonoids. J Agric Food Chem 2003,
51, 742-745.
5. Bonvehi J, Torrento M, Lorente E. Evaluation of polyphenolic compounds in honeybee-collected pollen
produced in Spain. J Agric Food Chem 2001; 49:
1848-1853.
6. Kroyer G, Hegedus N. Evaluation of bioactive properties of pollen extracts as functional dietary food supplement. Innov Food Sci & Emerg Technol 2001; 2:
171-174.
7. Leja M i wsp. Antioxidative properties of bee pollen in
selected plant species. Food Chem 2007; 100: 237-240.
8. Nagai T i wsp. Antihypertensive activities of enzymatic hydrolysates from honeybee-collected pollen
of Cistus ladaniferus. J. Food Agric Environ 2007;
5: 86-89.
9. Saric A i wsp. Antioxidant effects of flavonoid from Croatian Cystus incanus L. rich bee pollen. Food Chem Toxic 2009; 47: 547-554.
10. Almaraz-Abarca N i wsp. Antioxidant activity of polyphenolic extract of monofloral honeybee-collected pollen from mesquite (Prosopis juliflora, Leguminosae).
J Food Compos Anal 2007; 20: 119-124.
11. Tyszka-Czochara M i wsp. Polifenole w diecie. Wybrane
aspekty metabolizmu i biodostępności związków polifenolowych. Farm Pol 2003; 59: 589-597.
12. Almaraz-Abarca N i wsp. Variability of antioxidant activity among honeybee-collected pollen of different botanical origin. Interciencia 2004; 29: 574-579.
13. Nagai T i wsp. Antioxidative ability in a linoleic acid
oxidation system and scavenging abilities against active oxygen species of enzymatic hydrolysates from
pollen Cistus ladaniferus. Int J Mol Med 2005; 15:
259-263.
14. Singleton VL, Orthofer R, Lamuela-Raventos RM. Analysis of total phenols and other oxidation substrates and
antioxidants by means of Folin-Ciocalteu reagent. Methods Enzymol 1999; 299: 152- 178.
data otrzymania pracy: 04.11.2009 r.
data akceptacji do druku: 26.01.2010 r.
Adres do korespondencji:
dr Anna Rzepecka-Stojko
Katedra i Zakład Żywności i Żywienia
Wydział Farmaceutyczny SUM w Katowicach
41-200 Sosnowiec, ul. Jedności 8,
tel. +48 32 364 11 73
e-mail: [email protected]