Pobierz opis

Paweł Trębas
[email protected]
Zakład Wirusologii
Państwowy Instytut Weterynaryjny – Państwowy Instytut Badawczy
Al. Partyzantów 57, 24-100 Puławy
Streszczenie pracy doktorskiej:
„Ocena odporności humoralnej w populacji psów i kotów po szczepieniu przeciwko
wściekliźnie z użyciem różnych szczepionek.”
Wścieklizna jest chorobą wirusową atakującą ssaki, w tym człowieka. Wirus należy do
rodziny Rhabdoviridae rodzaju Lyssavirus. Choroba ta jest niezwykle groźna, ponieważ w
przypadku zakażenia i przy braku szczepień jest w 100% śmiertelna. Jedynym znanym
obecnie sposobem na zatrzymanie rozprzestrzeniania się choroby oraz zmniejszenie liczby
zachorowań u ludzi są szczepienia. Zwierzęta które biorą czynny udział w przenoszeniu
wścieklizny są szczepione profilaktyczne, natomiast w przypadku ludzi głównie stosuje się
szczepienia poekspozycyjne, po kontakcie z podejrzanym zwierzęciem (pogryzienie, kontakt
błon śluzowych ze śliną, podrapania). Spośród zwierząt największą rolę w przenoszeniu
wścieklizny biorą udział lisy dzikie, oraz psy i koty, z których psy objęte są obowiązkiem
szczepień profilaktycznych, szczepionkami inaktywowanymi. Koty natomiast szczepione są
przez właścicieli dobrowolnie, lub w przypadku wyjazdu do pewnych krajów które
wprowadziły dodatkowe przepisy mające chronić terytoria przed zawleczeniem choroby.
Tematem Pracy Doktorskiej jest analiza szczepionek przeznaczonych dla zwierząt domowych
takich jak psy i koty do uodparniania przeciwko wściekliźnie. Celem podjętych badań jest
określenie które szczepionki dostępne na polskim rynku powodują największy wzrost
poziomu przeciwciał skierowanych przeciwko wirusowi wścieklizny u zwierząt(najlepsze
zabezpieczenie przeciwko wściekliźnie). Kolejnymi celami pracy jest stwierdzenie czy
pojedyncze szczepienie zabezpiecza zwierzęta przeciwko chorobie, określenie czy wiek, płeć
lub gatunek zwierzęcia ma wpływ na odporność po szczepieniu przeciwko wściekliźnie, jak
również analiza zależności pomiędzy czasem pomiędzy szczepieniem, a utrzymaniem się
odporności zwierzęcia na akceptowalnym poziomie. Wszystkie dane uzyskane w trakcie
przygotowywania Pracy Doktorskiej znajdą praktyczne zastosowanie w instrukcjach dla
lekarzy weterynarii.
Do określenia poziomu przeciwciał poszczepiennych skierowanych przeciwko wirusowi
wścieklizny w surowicy zwierząt opracowano test FAVN (fluorescent antibody virus
neutralization). Metoda ta polega na seroneutralizacji znanego miana wirusa w seryjnych
rozcieńczeniach badanej surowicy na 96-dołkowych płytkach. W teście FAVN stosowany jest
laboratoryjny szczep wirusa wścieklizny CVS (Challenge virus standard), o określonym
wcześniej mianie. W trakcie przebiegu testu wykonuje się seryjne rozcieńczenia badanych
surowic w płynie do hodowli komórek z postępem logarytmicznym co trzy. Każda badana
próbka nastawiana jest w czterech powtórzeniach. Następnie do każdego dołka dodawana jest
ta sama objętość wirusa CVS o określonym mianie. Mieszanina inkubowana jest przez 1
godzinę w 370C. Po okresie inkubacji do każdego dołka dodawane są komórki BHK-21.
Gęstość komórek w dodawanej zawiesinie powinna wynosić 4x105 na ml. Łącznie z
próbkami badanymi w identyczny sposób przygotowuje się kontrolę wirusa, surowicę
kontrolną dodatnią i ujemną, oraz surowicę referencyjną WHO lub OIE. Tak przygotowane
płytki inkubuje się przez 48 godzin w 370C w atmosferze z dodatkiem CO2. Po zakończeniu
inkubacji dołki na płytce znakuje się komercyjnie dostępnymi koniugatami znakowanymi
izotiocjanianem fluoresceiny. Znakowanie preparatu koniugatem ma na celu uwidocznienie
wirusa wścieklizny w komórkach (zielone, jasne punkty w cytoplazmie), ponieważ w
przypadku tego wirusa brak jest widocznego efektu cytopatycznego. Płytki ogląda się w
obrazie mikroskopu fluorescencyjnego pod powiększeniem 100x. W dołkach w których
miano przeciwciał było wysokie nie obserwuje się świeceń (wirus został zneutralizowany),
natomiast w miarę coraz większych rozcieńczeń surowicy miano przeciwciał spada co wiąże
się z pojawianiem się świeceń. Po odczycie płytki wynik mianowania surowic wylicza się w
stosunku do surowicy referencyjnej której miano wynosi 0,5 IU/ml, podstawiając wartości do
wzoru Spearmana- Karbera. Wartość 0,5 IU/ml jest mianem granicznym, wszystkie wartości
miana poniżej świadczą o niedostatecznym uodpornieniu zwierzęcia przeciwko wściekliźnie.
Dopiero obowiązek określania miana przeciwciał w przypadku transportu psów oraz kotów
do niektórych krajów, wpłynął na rozwój testów pozwalających na określenie statusu
immunologicznego zwierząt. W związku z powyższymi przepisami do Zakładu Wirusologii
Państwowego Instytutu Weterynaryjnego właściciele psów i kotów z którymi podróżowali
poza granice Polski przesłali ponad 11 000 próbek surowicy. Próbki gromadzone były od
2004 roku i dotyczyły zwierząt w różnym wieku, różnej płci, ras oraz z różną historią
szczepień. Testem FAVN przebadano dokładnie 11826 surowic. Do badan nadesłano 9845
surowic pochodzących od psów, 1986 surowic pochodzących od kotów. Pozostałe surowice
pochodziły od innych gatunków zwierząt. Do immunizacji zwierząt użyto ponad 20 różnych
szczepionek.
Do badanych próbek dołączono formularze w których lekarze weterynarii pobierający krew
umieszczali istotne dane które zostaną wykorzystane w pracy doktorskiej. Zgromadzone
informacje umieszczone zostały w opracowanych arkuszach programu Exel, a następnie
zostaną one użyte do analizy statystycznej. Dane podzielono na kilka grup. Pierwsza określa
różnicę gatunkową poziomu przeciwciał poszczepiennych pomiędzy psami a kotami.
Następnie porównywano poziomy przeciwciał u zwierzą szczepionych jednorazowo, w
stosunku do zwierząt szczepionych wielokrotnie dawkami przypominającymi. Wstępne dane
pokazują że nie u wszystkich zwierząt pierwsza dawka skutecznie zabezpiecza przeciwko
wściekliźnie. Duże znaczenie dla wyników pracy doktorskiej ma porównanie odpowiedzi
poszczepiennej zwierząt immunizowanych szczepionkami monowalentnymi z wynikami
zwierząt szczepionych szczepionkami poliwalentnymi. Wstępne dane pokazują że
szczepionki poliwalentne słabiej zabezpieczają zwierzęta immunizowane przed zakażeniem.
Kolejnym etapem badań jest porównanie poziomu przeciwciał w surowicy zwierząt
szczepionych w stosunku do czasu od momentu szczepienia. Dane te mają na celu określenie
w jak długim okresie po szczepieniu poziom przeciwciał utrzymuje się na poziomie
zapewniającym ochronę przed zakażeniem. Do badań związanych z pracą doktorską
włączono również ocenę wpływu wieku zwierzęcia na skuteczność szczepienia. Końcowym
etapem pracy będzie analiza odporności całej populacji psów i kotów w Polsce na podstawie
wszystkich danych uzyskanych w czasie badań.
Dane uzyskane z badań wszystkich próbek to niezwykle cenne źródło wiedzy o jakości
szczepionek stosowanych w Polsce. Jest to pierwsza praca w dziedzinie immunizacji
przeciwko wściekliźnie zwierząt domowych w Polsce i jedna z nielicznych na świecie.
Dodatkowym faktem przemawiającym za innowacyjnością pracy jest ogromna ilość
zgromadzonego materiału i wyników, które po zastosowaniu metod statystycznych pomogą w
przyszłości zwiększyć skuteczność szczepień w celu wyeliminowania zagrożenia dla życia
zwierząt i ludzi.