docMateusz Kropiwnicki, Joanna Koniuszewska, Małgorzata Robak
download 
Reklamacja Transkrypt
Mateusz Kropiwnicki, Joanna Koniuszewska, Małgorzata Robak
Acta Sci. Pol., Biotechnologia 14 (1) 2015, 5-16 ISSN 1644–065X (print) ISSN 2083–8654 (on-line) PORÓWNANIE SYNTETAZ ACETYLO-COA DROŻDŻY Z WYKORZYSTANIEM NARZĘDZI BIOINFORMATYCZNYCH1 Mateusz Kropiwnicki, Joanna Koniuszewska, Małgorzata Robak Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu Streszczenie. Syntetazy acetylo-CoA (acetylokoenzymu A) są enzymami powszechnie występującymi w komórkach. Celem pracy było porównanie sekwencji nukleotydowej i aminokwasowej enzymów z: Ashbya gossipii, Candida albicans, Candida glabrata, Debaromyces hansenii, Kluyveromyces lactis, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe oraz Zygosaccharomyces bailii. W tym celu wykorzystano narzędzia bioinformatyczne. W porównaniu sekwencji nukleotydowych i aminokwasowych uzyskano podział na dwie grupy (ACS1 i ACS2) oraz znajdujące się pomiędzy sekwencje ACSA z S. pombe. Następnie porównano sekwencje enzymów z sekwencją ACS2 z Z. bailii. Wytypowano fragmenty identyczne, konserwatywne i wybrano trzy sekwencje powtarzające się we wszystkich białkach, o długości od 11 do 21 aminokwasów. Ustalono aminokwasy biorące udział w wiązaniu substratów (ATP i CoA) oraz potwierdzono występowanie i określono położenie sekwencji FTAGD, YFTGD, YFAGD, LRTGD, YFSGD, stanowiących katalitycznie ważny motyw III. Słowa kluczowe: syntetaza acetylo-CoA , ACS, bioinformatyka, sekwencje aminokwasowe, sekwencje nukleotydowe, motyw III WSTĘP Bioinformatyka jest obecnie jedną z najbardziej rozwijających się dziedzin nauki. Już w latach 80. wzrosło zainteresowanie metodami gromadzenia danych biologicznych dotyczących w szczególności genów i białek. Doprowadziło to do powstania w 1971 r. pierwszej bazy danych gromadzącej informacje na temat struktur białkowych – Protein Data Bank [Ślesak i Karpiński 2010]. Dzięki opracowaniu specjalistycznych programów bioinformatyka stała się narzędziem umożliwiającym tworzenie przestrzennych struktur białek, analizę wzajemnych powiązań szlaków metabolicznych, analizę ekspresji genów © Copyright by Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu Adres do korespondencji – Corresponding author: Małgorzata Robak, Katedra Biotechnologii i Mikrobiologii Żywności, Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu, 51-630 Wrocław, ul. J. Chełmońskiego 37/41, e-mail: [email protected] 6 M. Kropiwnicki i in. czy kodowanych przez nie białek [Bansal 2005]. Obecnie istnieje wiele typów baz danych. Mogą one zawierać informacje o klasyfikacji białek i identyfikacji domen białkowych (PROSITE, PRINTS), enzymach i szlakach metabolicznych (BioCyc, BRENDA, KEGG- pathway), klasyfikacji organizmów (NCBI- Taxonomy) czy o sekwencjach genów i kodowach przez nie białek [Ślesak i Karpiński 2010]. Poniżej przedstawiono wykaz znanych baz danych dotyczących drożdży (tab. 1). Tabela.1. Zestawienie baz danych dotyczących drożdży Table 1. Summary of yeasts databases Baza danych Data base PomBase Gatunek Species Adres Address Schizosaccharomyces pombe http://www.pombase.org Saccharomyces cerevisiae http://www.yeastgenome.org/ Saccharomyces cerevisiae http://rulai.cshl.edu/SCPD/ Zawiera informacje na temat 40 gatunków drożdży http://www.genolevures.org/ Candida albicans Candida dubliniensis Candida glabrata http://www.candidagenome.org/ Candida albicans Candida tropicalis Lodderomyces elongisporus Candida guilliermondii Candida lusitaniae http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/candida_group/MultiHome.html Schizosaccharomyces japonicus Schizosaccharomyces octosporus Schizosaccharomyces cryophilus http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/schizosaccharomyces_group/MultiHome.html Saccharomyces Genome Database THE PROMOTER DATABASE OF SACCHAROMYCES CEREVISIAE Génolevures Candida Genome Database Candida Database Schizosaccharomyces group Database Acta Sci. Pol. Porównanie syntetaz acetylo-CoA... 7 Drożdże jako najprostsze eukarionty stanowią modelowe układy do badań poznawczych i porównawczych. Są one również dość różnorodną grupą organizmów wykorzystywaną do badań potencjalnych mechanizmów warunkujących przebieg ewolucji. Do tej pory udało się poznać sekwencje całych genomów dla ponad 20 gatunków drożdży [http://www.genolevures.org/]. Porównania materiału genetycznego można przeprowadzić, wyszukując wyznaczone sekwencje, grupując je i porównując z wykorzystaniem specjalistycznych programów bioinformatycznych takich jak BioEdit [www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html], Clustal [http://www.clustal.org/] czy WEPA [Walczak i in. 2009]. W przypadku tej pracy do porównania wybrano geny kodujące acetylo-CoA syntetazy, enzymy powszechnie występujące w każdej komórce. Są to enzymy z klasy ligaz (EC 6.2.1.1), katalizujące reakcję syntezy acetylo-CoA, jednego z centralnych metabolitów przemian komórkowych. Enzymy te są niezbędne do funkcjonowania każdej komórki. Biorą udział w syntezie acetylo-CoA z octanu i CoA, wymagając przy tym energii z ATP (rys. 1). W pierwszym etapie reakcji powstaje acetylo-AMP i pirofosforan, a dopiero potem acetylo-CoA i wolny AMP. Najważniejszy produkt reakcji to acetylo-CoA, ale powstający AMP jest też znanym intermediatem regulującym ekspresje wielu genów. Najprawdopodobniej syntetazy acetylo-CoA biorą również udział w przyswajaniu octanu, w acetylacji histonów oraz w syntezie adenenozyno-5’-tetrafosforanu i adenozyno-5’-pentafosforanu [Guranowski i in. 1994]. Biorą też udział w metabolizmie metanu, propionianu, maślanu oraz pirogronianu [http://www.genome.jp, Ingram-Smith i Smith 2006]. ATP + octan + CoA = AMP + difosoran + acetylo- CoA Rys. 1. Mechanizm reakcji katalizowanej przez acetylo-CoA syntetazy [http://www.ebi.ac.uk] Fig. 1. The mechanism of the reaction catalyzed by acetyl-CoA synthetase Najlepiej poznanymi enzymami eukariotycznymi są syntetazy acetylo-Co-A drożdży Saccharomyces cerevisiae. Znane są dwa izoenzymy, ASC1 i ASC2, które różnią się występowaniem w komórce i parametrami kinetycznymi takimi jak stała Michaelisa-Menten (Km). W przypadku izoenzymu ACS1 wartość Km wynosi 0,32 mM dla octanu i 1,4 mM dla ATP. W przypadku ACS2 powinowactwo z octanem jest słabsze Biotechnologia 14 (1) 2015 8 M. Kropiwnicki i in. (Km wynosi 8,8 mM), a dla ATP podobne (Km wynosi 1,3 mM) [www.uniprot.org/uniprot/P52910, Satynarayana i Klein 1973]. Obecność danego izoenzymu w komórce jest uwarunkowana napowietrzaniem. W warunkach tlenowych dominuje ACS1, a w warunkach beztlenowych ACS2. Wykorzystanie octanu czy etanolu jako źródło węgla jest możliwe w warunkach tlenowych i wymaga ACS1, a podczas fermentacji glukozy niezbędny jest izoenzym ACS2 [Van der Berg i in. 1996]. Izoenzym ten głównie występuje w jądrze, gdzie jest odpowiedzialny za kontrolę długowieczności replikacyjnej S. cerevisiae [Falcon i in. 2010]. Celem poniższej pracy było porównanie sekwencji genów acetylo-CoA syntetaz, których obecność wykazano w genomach ośmiu gatunków drożdży oraz porównanie sekwencji aminokwasowej, wytypowanie fragmentów identycznych, wyznaczenie położenia aminokwasów biorących udział w wiązaniu substratów oraz wyszukanie motywu III, opisywanego jako jeden z trzech niezbędnych do aktywności enzymatycznej. MATERIAŁ I METODY Sekwencje nukleotydowe genów kodujących acetyl-CoA syntetazy występujących u ośmiu gatunków drożdży uzyskano z zasobów dwóch baz danych: GenBank [http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/] oraz UniProtKB [http://www.uniprot.org]. Do porównania sekwencji nukleotydowych oraz aminokwasowych wykorzystano program BioEdit [www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html], a analizę porównawczą opartą na identyczności sekwencji wykonano na podstawie aplikacji WEPA [Walczak i in. 2007]. WYNIKI I OMÓWIENIE Pomimo niezwykle ważnej roli odgrywanej w komórce przez acetylo-CoA syntetazy dotychczas przeprowadzono niewiele badań dotyczących wyizolowanych enzymów z organizmów eukariotycznych. Większość informacji dotyczących struktur krystalicznych odnosi się do enzymu z Salmonella enterica. Strukturę krystaliczną tego enzymu opisali Gulick i in. w 2003 r. [za Ingram-Smith i in. 2006], a strukturę krystaliczną ACS1 z S. cerevisiae odnotowali dwa lata wcześniej Jogl i Tong [za Ingram-Smith i Smith 2006]. Ostatnio ukazały się prace dotyczące enzymów z ekstremofilnej bakterii Kuenenis stuttgartiensis [Russ i in. 2012] i archebakterii: Methanotermobacter thermoautotrophicus oraz Archaeoglobus fulgidus [Ingram-Smith i Smith 2006]. W przypadku drożdży wyodrębniono izoenzymy ACS1 i ACS2 z S. cerevisiae [van den Bergi i in. 1996] oraz ACS2 Zygosaccharomyces bailii [Rodrigues i in. 2004]. Przeszukując bazy danych (GenBank oraz UniProtKB), uzyskano sekwencje nukleotydowe kodujące ACS u 8 gatunków drożdży (tab. 2). W genomie 6 gatunków występują dwa geny kodujące, odpowiednio ACS1 i ACS2. W genomie dwóch gatunków Schizosaccharomyces pombe i Z. bailii występuje tylko jeden gen, odpowiednio ACSA i ACS2. Pomimo że tylko kilka z tych enzymów zostało wyizolowanych na podstawie sekwencji, wnioskujemy o podobnej ich wielkości (liczba aminokwasów od 662 do 713; masa molekularna od 73 036 do 79 263 Da) i o podobnym pI (od 5,59 do 6,33). Acta Sci. Pol. 9 Porównanie syntetaz acetylo-CoA... Analiza porównawcza sekwencji nukleotydowych genów acetylo-CoA syntetazy ukazała podział na dwie główne grupy: grupę genów kodujących wariant ACS1 enzymu i grupę genów kodujących wariant ACS2. Pomiędzy nimi znalazł się natomiast gen ACSA z S. pombe (rys. 2). W obrębie grupy genów ACS1 największą identycznością charakteryzowały się sekwencje z S. cerevisiae i C. glabrata oraz D. hansenii i C. Albicans, odpowiednio 82 i 81%. Należy zaznaczyć, że pary te wykazały między sobą identyczność na poziomie 62%. Pozostałe geny w tej grupie były zbliżone do pary S. cerevisiae i C. glabrata. Tabela 2. Zestawienie gatunków drożdży wraz z podstawowymi informacjami na temat porównywanych sekwencji i białek Table 2. Juxtaposition of yeast species with basic information about compared sequences and proteins Gatunek Species Gen gene Numer dostępu Wielkość Numer dostępu accession number [pz] accession number GenBank size [bp] UniProtKB AA [liczba] [number] pI m.cz m.w. [Da] ACS1 NC_005785 2085 Q758X0 694 5.75 76 809 ACS2 NC_005788 2064 Q750T7 687 5.59 75 369 ACS1 AL033502 2028 O94049 675 5.90 75 100 ACS2 NW_139540 2016 Q8NJN3 671 5.73 73 861 ACS1 NC_006035 2115 Q6FLU2 704 5.90 79 263 ACS2 NC_005968 2052 Q6FXI2 683 5.80 75 551 ACS1 XM_459568 2016 Q6BQF2 671 5.78 74 992 ACS2 NC_006046 2040 Q6BS00 679 5.69 74 992 ACS1 NC_006037 2124 O60011 707 5.63 78 420 ACS2 NC_006040 2055 Q9Y7B5 684 5.57 75 105 ACS1 NC_001133 2142 Q01574 713 6.02 79 142 ACS2 NC_001144 2052 P52910 683 6.21 75 492 SchizosaccharoACSA myces pombe ZygosaccharomyACS2 ces bailii NC_003421 2278 P78773 662 6.33 73 036 AJ314837 2027 Q96VC7 675 6.02 74 508 Ashbya gossypii Candida albicans Candida glabrata Debaryomyces hansenii Kluyveromyces lactis Saccharomyces cerevisiae W drugiej grupie genów (ACS2) dało się zauważyć bardzo podobny do grupy pierwszej podział sekwencji. Identyczność na poziomie 79–84% wykazały geny z S. cerevisiae, K. lactis, Z. bailli, C. glabrata i A. gossypii. Para genów z D. hansenii i C. albicans o 80% identyczności okazała się podobna w 68% do reszty grupy. Geny ACS1 wykazały 55% identyczność sekwencji nukleotydowej z genami ACS2 i genem ACSA z S. pombe. Natomiast sekwencja genu ACSA była w 57% identyczna z sekwencjami genów ACS2. Zastanawiające jest, że pomimo niezwykle ważnej roli ogrywanej przez acetylo-CoA syntetazy w literaturze brakuje porównań sekwencji kodujących ich genów. Biotechnologia 14 (1) 2015 10 M. Kropiwnicki i in. Rys. 2. Fenogram reprezentujący identyczność sekwencji genów ACS1 i ACS2 Fig. 2. Phenogram representing ACS1 and ACS2 genes sequences identities Analiza porównawcza sekwencji aminokwasowych acetylo-CoA syntetaz ukazała rozdział na dwie grupy: grupę izoenzymu ACS1 i grupę izoenzymu ACS2 oraz ponownie odseparowany od reszty enzym ACSA z S. pombe (rys. 3). Podział sekwencji aminokwasowych w grupie ACS1 ukazał 67% identyczność enzymu z A. gossypii ze zgrupowaniem białek pochodzących z S. cerevisiae, C. glabrata i K. lactis wykazujących identyczność na poziomie 73–74%. Pary białek o największym, 78% poziomie identyczności znalazły się obrębie drugiej grupy. Były to sekwencje izoenzymów ACS2 z C. albicans i D. hansenii oraz z C. glabrata i S. cerevisiae. Co ciekawe, największe podobieństwo do pierwszej pary wykazały sekwencje izoenzymów ACS1 z C. albicans i D. hansenii, które znalazły się w grupie ACS2. Pozostałe sekwencje aminokwasowe zawarte w tej grupie (o identyczności 70–78%), były w 65% podobne do izoenzymów z C. albicans i D. hansenii. Odrębna sekwencja aminokwasowa enzymu ACSA z S. pombe okazała się identyczna z resztą białek w 57%. Zbliżone drzewka filogenetyczne otrzymali Rogrigues i in. [2004] oraz Ingram-Smith i Smith [2006], porównując sekwencje aminokwasowe acetylo-CoA syntetaz z Z. bailii, S. cerevisiae, K. lactis, C. albicans, C. glabrata, D. hansenii, Y. lypolitica i S. pombe. W celu wytypowana fragmentów konserwatywnych wszystkie sekwencje aminokwasowe zostały porównane z sekwencją białka z Z. bailli (tab. 3). Na podstawie zebranych danych wybrano trzy sekwencje powtarzające się we wszystkich białkach. Pierwszym konserwatywnym fragmentem była sekwencja 16 aminokwasów (NSEDPLFLLYTSGSTG), która w białku z Z. bailii znajduje się w pozycji 268–283, licząc od N-końca. Sekwencja ta była obecna również w ACS1 i ACS2 u C. albicans oraz D. hansenii. W izoenzymach ACS1 z A. gossypii, C. glabrata, K. lactis, S. cerevisiae i ACSA z S. pombe fragment konserwatywny był krótszy o 1 do 4 aminokwasów początkowych. Izoenzymy ASC2 z A. gossypii, C. glabrata, K. lactis, S. cerevisiae, poza brakującymi aminokwasami początkowymi (0–4), w wybranej sekwencji konserwatywnej zawierały również końcowy, homologiczny fragment o długości od 4 do 15 aminokwasów. Co ciekawe, w wybranej sekwencji nie wykazano występowania żadnego z aminokwasów wiążących CoA czy ATP [http://www.uniprot.org/]. Acta Sci. Pol. Porównanie syntetaz acetylo-CoA... 11 Rys. 3. Fenogram reprezentujący identyczność sekwencji aminokwasowych izoenzymów ACS1 i ACS2 Fig. 3. Phenogram representing ACS1 and ACS2 isoenzymes aminoacid sequences identities Drugi z wybranych, konserwatywnych fragmentów zawierał 21 aminokwasów (GRVDDVVNVSGHRLSTAEIEA), które w sekwencji białka u Z. bailii znajdują się w pozycji 530-550 (od N-końca) i występował w ACS1 u C. albicans, C. glabrata, D. hansenii, K. lactis i S. cerevisiae. Nieco krótszy fragment (18 aminokwasów) znalazł się w ACS1 u A. gossypii. Najdłuższe fragmenty homologiczne do sekwencji z Z. balii, zawierające konserwatywną sekwencję GRVDDVVNVSGHRLSTAEIEA znalazły się w izoenzymie ACS2 u S. cerevisiae, C. glabrata, A. gossypii oraz K. lactis, odpowiednio obejmowały 34, 45, 48 i 48 aminokwasów. Zaproponowana sekwencja konserwatywna zawiera dwa miejsca wiążące ATP i jedno wiążące koenzym A [http://www.uniprot.org/]. W obu przypadkach aminokwasem wiążącym ATP jest arginina. Aminokwasem wiążącym koenzym A jest seryna. Dodatkowe miejsce (kwas asparaginowy) biorące udział w wiązaniu substratu (ATP) znajdujemy w tych dłuższych fragmentach homologicznych. Szczegółowe zestawienie pozycji miejsc wiążących substrat wraz z aminokwasami dla każdego enzymu zawarto w tabeli 4. Rodrigues i in. [2004] do poszukiwania genu(ów) u Z. balii (dobranie starterów) wytypowali w sekwencji enzymu ACS1 z S. cerevisiae dwa fragmenty w pozycjach 210-270 oraz 570-630 od N-końca. Następnie na podstawie tych fragmentów autorzy wybrali dwie sekwencje o wysokiej homologii, obecne także w sekwencjach enzymu z S. cerevisiae i K. lactis. Druga z tych sekwencji (RVDDVVNVSGH) stanowi część fragmentu konserwatywnego otrzymanego w tej pracy. Fragment ten u Z. bailli leży w pozycji 531-542, licząc od N-końca enzymu. Jako trzeci fragment konserwatywny wyszukano sekwencję (DLPKTRSGKIMRR) o długości 13 aminokwasów w pozycji 621–633 u Z. bailii. W takiej postaci zawierały go wszystkie enzymy z wyjątkiem ACS2 z K. lactis (sekwencja dłuższa o 7 aminokwasów) oraz ACS2 z S. cerevisiae, w którego sekwencji nie znaleziono wyżej wymienionego fragmentu. Również i w tej sekwencji konserwatywnej nie stwierdzono miejsc wiążących substraty [http://www.uniprot.org/]. Biotechnologia 14 (1) 2015 94-115 150-160 153-161 94-115 141-151 136-159 95-116 154-164 154-161 142-152 95-110 156-166 155-167 146-157 135-153 84-101 3 95-112 2 1 DLPKTRSGKIMRR GRVDDVVNVSGHRLSTAEIEA NSEDPLFLLYTSGSTG 4 6 171-182 171-193 313-329 313-324 268-283 302-335 267-278 307-336 306-336 317-333 317-336 316-336 302-335 8 270-290 311-325 213-224 290-302 286-301 308-319 294-306 269-284 323-332 286-301 7 272-287 271-288 305-316 269-284 274-289 274-290 295-306 269-299 196-210 206-221 5 190-222 207-218 170-195 204-215 194-205 Sekwencje konserwatywne – Conservative sequences Enzym AG ACS1 AG ACS2 CA ACS1 CA ACS2 CG ACS1 CG ACS2 DH ACS1 DH ACS2 KL ACS1 KL ACS2 SC ACS1 SC ASC2 SP ACSA ZB ACS2 342-360 343-361 345-360 9 363-377 337-386 366-384 364-378 364-378 342-374 10 393-404 386-398 391-406 393-407 393-413 398-407 274-289 392-404 11 414-439 414-439 421-440 429-440 424-439 12 441-457 441-457 442-458 445-457 13 473-484 473-484 473-484 14 15 507-518 550-561 539-554 508-519 508-519 Tabela 3. Zestawienie zakresów sekwencji konserwatywnych w sekwencjach aminokwasowych izoenzymów ACS1 i ACS2 Table 3. Juxtaposition of conservative aminoacid sequences in ACS1 and ACS2 isoenzymes 16 530-550 521-544 512-545 573-593 504-551 567-587 521-551 534-554 507-551 564-584 521-551 536-556 503-550 554-571 17 621-633 610-622 667-679 630-649 661-673 628-640 622-634 630-646 658-670 620-632 626-638 634-646 648-660 633-651 633-651 648-660 654-664 18 12 M. Kropiwnicki i in. Acta Sci. Pol. 13 Porównanie syntetaz acetylo-CoA... Tabela 4. Zestawienie miejsc wiążących substraty w porównywanych sekwencjach aminokwasowych [http://www.uniprot.org/] Table 4. Summary of substrate binding sites in compared amino acid sequences Substrat Gatunek i izoenzym i aminokwas Species and isoenzyme wiążący Substrate AG AG CA CA CG CG DH DH KL KL SC SC SP ZB and binding ACS1 ACS2 ACS1 ACS2 ACS1 ACS2 ACS1 ACS2 ACS1 ACS2 ACS1 ACS2 ACSA ACS2 aa CoA/T 348 325 331 326 358 326 329 326 361 326 367 325 320 325 CoA/S 563 539 545 540 573 540 543 540 576 540 582 539 533 539 CoA/R 631 617 609 603 641 613 605 611 644 613 650 612 594 604 ATP /D 540 516 522 517 550 517 520 517 553 517 559 516* 510 516 ATP/ R 555 531 537 532 565 532 535 532 568 532 574 531* 525 531 ATP/ R 566 542 548 543 576 543 546 543 579 543 585 542 536 542 *możliwe wiązanie AMP possibile binding of AMP Tabela 5. Enzymy ACS1 i ACS2 zawierające warianty motywu III w swoich sekwencjach aminokwasowych Table 5. ACS1 and ACS2 enzymes containing motif III in their aminoacid sequences Wariant motywu III z pozycją w sekwencji aminokwasowej Motif III variant and position in protein sequence Enzym Enzyme YFTGD FTAGD LRTGD YFSGD YFAGD AG ACS1 ------------- 339-343 ------------- ------------- 536-540 AG ACS2 512-516 316-320 77-81 ------------- ------------- CA ACS1 ------------- 322-326 ------------- 518-522 ------------- CA ACS2 513-517 317-321 ------------- ------------- ------------- CG ACS1 546-550 ------------- ------------- ------------- ------------- CG ACS2 513-517 317-321 ------------- ------------- ------------- DH ACS1 ------------- 320-324 ------------- 516-520 ------------- DH ACS2 513-517 317-321 ------------- ------------- ------------- KL ACS1 549-553 352-356 ------------- ------------- ------------- KL ACS2 513-517 317-321 ------------- ------------- ------------- SC ACS1 555-559 358-362 ------------- ------------- ------------- SC ACS2 512-516 316-320 ------------- ------------- ------------- SP ACSA 506-510 ------------- ------------- ------------- ------------- ZB ACS2 512-516 316-320 ------------- ------------- ------------- Biotechnologia 14 (1) 2015 14 M. Kropiwnicki i in. Wszystkie sekwencje aminokwasowe enzymów ACS1, ACS2 i ACSA zostały przeszukane pod kątem obecności konserwatywnego motywu III (Y[F/L]-R[T/K/X]-T[S/V/ A]-G-D), który według Chang i in. [1997] może znajdować się w obrębie lub w bliskim otoczeniu centrum aktywnego. W sekwencji badanych enzymów odnaleziono 5 z 264 możliwych kombinacji aminokwasowych tego motywu. Najczęściej powtarzającymi się motywami były sekwencje FTAGD i YFTGD. Motyw FTAGD obecny był w 12 białkach. Nieobecny był w sekwencjach ACS1 u C. glabrata i ACSA u S. pombe. Motywu YFTGD, który znalazł się w 11 białkach, brakowało w sekwencjach ACS1 u A. gossypii, C. albicans i D. hansenii. Ponadto enzymy ACS1 z C. albicans i D. hansenii zawierały wariant YFSGD motywu III, a w sekwencjach ACS1 i ACS2 z A. gossypii znaleziono dodatkowe warianty YFAGD i LRTGD. Miejsca położenia odnalezionych motywów w badanych sekwencjach zamieszczono w tabeli (tab. 5). Należy zaznaczyć, że najczęściej powtarzające się motywy występują w pobliżu miejsc wiązania substratów. Motyw FTAGD jest oddalony o najwyżej kilka aminokwasów od miejsca wiązania koenzymu A. W podobnych odległościach od miejsca wiązania ATP położony jest motyw YFTGD. Z analizy położenia w sekwencji aminokwasowej wynika, że motywy YFSGD i YFAGD zastępują motyw YFTGD w białkach ACS1 u A. gossypii, C. albicans oraz D. hansenii. Otrzymane wyniki zdają się potwierdzać obserwacje Ingram-Smith i in. [2012] dotyczące ważnej roli odgrywanej przez motyw III w reakcji katalizowanej przez acetylo-CoA syntetazy. Natomiast zastanawiające jest, że w dwóch powtarzających się we wszystkich przeszukiwanych białkach sekwencjach NSEDPLFLLYTSGSTG oraz DLPKTRSGKIMRR nie były obecne aminokwasy wiążące ATP czy CoA. WNIOSKI 1. Stosując proste narzędzia informatyczne, wykazano podobieństwo genów kodujących aminoacylo-CoA syntetazy oraz homologie sekwencji aminokwasowych tych białek z ośmiu gatunków drożdży. Zarówno sekwencje nukleotydowe, jak i aminokwasowe wykazują duży stopień identyczności (55 i 57%). 2. Wyszukano położenie sekwencji konserwatywnych, z których trzy o długości od 11 do 21 aminokwasów obecne są we wszystkich białkach. 3. Ustalono aminokwasy biorące udział w wiązaniu substratów (ATP i CoA). 4. Potwierdzono występowanie w sekwencjach aminokwasowych aminoacylo-CoA syntetaz motywu III, uznanego przez innych badaczy jako ważnego katalitycznie. Wykazano występowanie sekwencji FTAGD, YFTGD, YFAGD, LRTGD i YFSGD. Określono położenie tych motywów w sekwencji każdego białka. Acta Sci. Pol. Porównanie syntetaz acetylo-CoA... 15 PIŚMIENNICTWO Bansal. A.K., 2005. Bioinformatics in microbial biotechnology – a mini review. Microbial Cell Factories, 4 (19), 1–11. Chang K.H., Xiang H., Dunaway-Mariano D., 1997. Acyl-adenylate motif of the acyl-adenylate/ thioester-forming enzyme superfamily: a site-directed mutagenesis study with the Pseudomonas sp. Strain CBS3 4-chlorobenzoate: coenzyme A ligase. Biochemistry, 36 (50), 15650–15659. Falcon A.A., Chen S., Wood M.S., Aris J.P. 2010. Acetyl-coenzyme A synthetase 2 is a nuclear protein required for replicative longevity in Saccharomyces cerevisiae . Mol Cell Biochem., 333, 99–108. Guranowski A., Sillero M.A.G., Sillero A., 1994. Adenosine 5’-tetraphosphate and adenosine 5’-pentaphosphate are synthesized by yeast acetyl coenzyme A synthetase. Journal of Bacteriology, 176 (10), 2986–2990. Ingram-Smith Ch., Thurman J.L., Zimowski K., Smith K.R., 2012. Role of motif III in catalysis by acetyl-CoA synthetase. Archaea, doi: 10.1155/2012/509579, 1–8. Ingram-Smith Ch., Smith K.R., 2006. AMP-forming acetyl-CoA synthetases in Archaea show unexpected diversity in substrate utilization. Archea, 2. 95–107. Mayer F., Küper U., Meyer C., Daxer S., Müller V., Rachel R., Huber H., 2012. AMP-forming acetyl CoenzymeA synthetase in the outermost membrane of the hyperthermophilic crenarchaeon Ignicoccus hospitalis. J. Bacteriol., 194, 1572–1581. Russ L., Harhangi H.R.,Schellekenes J., Verdellen, B., Kartal B., Op den Camp H.J.M., Jetten M., S., M., 2012. Genome analysis and heterologous expression of acetate-activating enzymes in the anammox bacterium Kuenenis. Arch. Microbiol., 194, 943–948. Satyanarayana T., Klein H.P., 1973. Studies on acetyl-CoenzymeA synthetase of yeast: inhibition by long-chain-Coenzyme A esters. J. Bacteriol., 115(2), 600–606. Ślesak I., Karpiński S. 2010. Biologiczne bazy danych i ich zastosowanie w funkcjonalnej analizie porównawczej organizmów – wybrane zagadnienia. Biotechnologia 4 (91), 39–52. van den Berg, M.A., De Jong-Gubbels P., Kortland Ch.,J., Van Dijken J.P., Pronk J.T., Steensma H.Y., 1996. The two acetyl-coenzymeA synthetases of Saccharomyces cerevisiae differ with respect to kinetic properties and transcriptional regulation. J. Biol. Chem., 271, 28953–28959. Rodrigues F., Zeeman A.M., Cardoso H., Sousa M.J., Steensma H.Y., Côrte-Real M., Leão C., 2004. Isolation of an acetyl-CoA synthetase gene (ZbACS2) from Zygosaccharomyces bailii. Yeast, 21, 325–331. Walczak E., Czaplińska A., Barszczewski W., Wilgosz M., Wojtatowicz M., Robak M., 2007. RAPD with microsatellite as a tool for differentiation of Candida genus yeasts isolated in brewing. Food Microbiology 24, 305–312. Walczak E., Robak M., 2009. Wzrost z sacharozy klonów drożdży Yarrowia lipolytica z genem inwertazy z Saccharomyces cerevisiae. Acta Sci. Pol. Biotechnologia 8 (4), 25–36. Biotechnologia 14 (1) 2015 16 M. Kropiwnicki i in. YEAST SYNTHETASES OF ACETYL-COA: COMPARISON BY BIOINFORMATIC TOOLS Abstract. The purpose of study was to compare acetyl-CoA synthetases (ASC1, ACS2) in yeast: Ashbya gossipii, Candida albicans, Candida glabrata, Debaromyces hansenii, Kluyveromyces lactis, Saccharomyces cerevisiae, Zygosaccharomyces bailii and ACSA in Schizosaccharomyces pombe. The first step was to compare nucleotide sequence of genes and aminoacid sequence of enzymes. For nucleotide sequences two different clusters of genes were obtained (ACS1 and ACS2) located between them ACSA gene from S. pombe. For aminoacid sequences obtained results were similar to nucleotide ones. In the next step, comparison of amino acid sequences to the sequence of ACS2 from Z. bailii, three conservative fragments were detected. Moreover the presence of motif III (consider as catalytically important) was confirmed. Five sequences were found (FTAGD, YFTGD, YFAGD, LRTGD, YFSGD) and their exact positions were determined. Key words. Acetyl-CoA synthetase, ACS, bioinformatics, aminoacid sequences, nucleotide sequences, motif III Zaakceptowano do druku – Accepted for print: 30.03.2015 Do cytowania – For citation: Kropiwnicki M., Koniuszewska J., Robak M., 2015. Porównanie syntetaz acetylo-CoA drożdży z wykorzystaniem narzędzi bioinformatycznych Acta Sci. Pol. Biotechnol., 14 (1), 5–16. Acta Sci. Pol.
