INDUKOWANIE ZJAWISKA AUTOLIZY U BAKTERII

FAKULTET - FIZJOLOGIA BAKTERII
Koordynator - dr hab. Magdalena Popowska, prof. UW
ĆWICZENIE: INDUKOWANIE ZJAWISKA AUTOLIZY U BAKTERII
Autor i główny prowadzący dr hab. Magdalena Popowska, prof. UW
Asysta: mgr Marta Piotrowska, mgr Rafał Ostrowski
Wstęp teoretyczny
Struktura mureiny tworzącej ścianę komórkową
Zarówno u bakterii gramdodatnich jak i gramujemnych, na zewnątrz błony
cytoplazmatycznej znajduje się sztywna struktura zwana mureiną (syn. peptydoglikan),
dodatkowo wzmocniona kwasami tejchojowymi lub techuronowymi (bakterie gramdodatnie)
oraz różnymi białkami, w tym lipoproteinami. Mureina pełni przede wszystkim funkcje
mechaniczne, chroniąc komórkę przed skutkami zmian ciśnienia osmotycznego, wieloma
czynnikami chemicznymi (rozpuszczalniki czy detergenty), nadaje także i utrzymuje
charakterystyczny dla danego gatunku bakterii kształt i uczestniczy w procesach związanych
z podziałem komórkowym. Szkielet cukrowy mureiny składa się z jednostek dwucukrowych
zbudowanych z reszt N-acetyloglukozoaminy (GlcNAc) oraz kwasu N-acetylomuraminowego
(MurNAc), połączonych wiązaniem -14 glikozydowym (Rys. 1.). Do reszty Dmleczanowej kwasu N-acetylomuraminowego dołączony jest krótki peptyd, w skład którego
wchodzą zarówno typowe dla białek bakterii i organizmów wyższych izomery L, jak i rzadko
występujące izomery D, aminokwasów. Tetrapeptydy i tripeptydy sąsiadujących ze sobą
łańcuchów połączone są poprzecznymi wiązaniami peptydowymi. W ostatnim etapie
biosyntezy mureiny, to jest w wydłużaniu łańcuchów cukrowych (transglikozylacja) i
tworzeniu wspomnianych wiązań poprzecznych (transpeptydacja) uczestniczą białka, które
potrafią również wiązać penicylinę i wskutek tego zostały nazwane białkami wiążącymi
penicylinę (PBP). W czasie tzw. procesów dojrzewania mureiny, towarzyszących wzrostowi
komórki bakteryjnej, makrocząsteczka ta u niektórych gatunków bakterii, przede wszystkim
chorobotwórczych, ulega pewnym modyfikacjom. Do tego rodzaju zmian w części
glikanowej należy brak acetylacji grupy aminowej przy węglu C-2 w resztach glukozoaminy
lub kwasu muraminowego lub dodatkowa O-acetylacja kwasu N-acetylomuraminowego przy
węglu C-6. Obie te modyfikacje czynią mureinę mniej podatną na aktywność niektórych
muramidaz, np. lizozymu (występującego w komórkach i płynach ustrojowych ssaków), który
hydrolizuje wiązanie glikozydowe w łańcuchu cukrowym mureiny.
Enzymy hydrolizujące wiązania w mureinie (Rys. 1)
1. Wiązanie -1,4-glikozydowe hydrolizowane jest przez glikozydazy:
(G) -N-acetyloglukozoaminidaza
(T) -N-acetylomuramidaza, Lityczna transglikozylaza*
2. Wiązania w części peptydowej są hydrolizowane przez:
(E) endopeptydazy, DD-peptydazy
(A) amidaza N-acetylomuramoilo-L-alaninowa
(LD-C) L,D-karboksypeptydaza
(DD-C) DD-karboksypeptydaza
9
G
N-acetylmuramic acid (MurNAc)
O
CH2OH
O
H H
OH H
H
LD-C
DD-C
O
H
H
H
CH2OH
O
H H
OH H
O
H NH
O
H C CH3 C O
C O
CH 3
H N
H C CH3
L-alanine
C O
T
H N
HOOC C H
CH2
D-glutamic acid
CH2
C O
O
H N
C OH
O
meso-DAP H C (CH2)3 CH
C O
NH C
H N
D-alanine H3C C H
C O
H N
D-alanine H3C C H
COOH
N -Acetylglucosamine
A
CH2OH
O
H H
O
NH
C O
CH 3
H
O
H
NH
C O
CH 3
N-Acetylglucosamine (GlcNAc)
E
CH 3
C H
D-alanine
NH
O
C O
C OH
H C (CH2)3 CH
O
H N
NH C
meso-DAP
C O
CH2
CH2
D-glutamic acid
HOOC C H
H N
C O
H3C C H
A
L-alanine
H N
C O
G
H3C C H
MurNAc
T
GlcNAc
MurNAc
Rysunek 1. Struktura mureiny (peptydoglikanu) Escherichia coli
 GLUKOZOAMINIDAZY: przecinają łańcuch oliosacharydowy, uwalniając
disacharydy lub dłuższe cząsteczki. Hydrolizują również produkty obrotu
metabolicznego mureiny, uwalniając tym samym substraty wykorzystywane przez
komórki jako źródło węgla i energii. Uwolnione komponenty mureiny mogą również
pełnić rolę efektora w procesie agregacji i sporulacji np. u Myxococcus xanthus. U
Staphylococcs aureus, hydrolaza ta jest odpowiedzialna za wywoływanie odpowiedzi
immunologicznej u ssaków, będąc jednym z determinatów patogenezy.
 MURAMIDAZY: biorą udział w metabolizmie bakteryjnej ściany komórkowej.
Dzięki kontrolowanemu rozrywaniu wiązań w mureinie enzymy te są niezbędne w
procesach wydłużania ściany komórkowej i podziału komórki, ale także mogą
powodować autolizę komórki. Znane są także przypadki uczestnictwa tych enzymów
w procesie sporulacji np. u rodzaju Bacillus oraz w obrocie metabolicznym mureiny u
Lactobacillus acidophilus.
 LITYCZNE TRANSGLIKOZYLAZY: Enzym ten nie jest hydrolazą mureiny,
ponieważ reakcji nie towarzyszy cząsteczka wody*. W komórkach E. coli występują
specyficzne muramidazy, które nie tylko rozrywają wiązanie glikozydowe ale
jednocześnie katalizują wewnątrzcząsteczkową transglikozylację z wytworzeniem
wiązania 1,6-anhydro w cząsteczce kwasu muraminowego (Rys. 2).
10
Rysunek 2. Wewnątrzcząsteczkowa transglikozylacja z wytworzeniem wiązania 1,6-anhydro
w cząsteczce kwasu muraminowego
 AMIDAZY: Odcinają peptyd od łańcuch cukrowego w mureinie. Enzymy te biorą
udział w hydrolizie produktów obrotu metabolicznego na mniejsze cząsteczki. Bierą
udział w procesie autolizy w fazie stacjinarnej u bakterii z rodzaju Bacillus oraz w
lizie indukowanej antybiotykami -laktamowymi, np. u Streptococcus pneumoniae.
 ENDOPEPTYDAZY: Katalizują reakcje rozszczepienia wiązania poprzecznego
między sąsiednimi peptydami w mureinie i są tym samym odpowiedzialne za stopień
usieciowania tego polimeru.
 KARBOKSYPEPTYDAZY: Enzymy te są zazwyczaj białkami PBP (ang. penicillin
binding protein). Enzymy te odcinają D-alaninę od peptydu
Główne funkcje autolizyn
 wzrost i podział komórki
 oddzielanie się komórek potomnych po podziale
 dojrzewanie mureiny
 obrót metaboliczny i recykling mureiny
 indukcja -laktamaz
 sporulacja i kiełkowanie
 chemotaksja
 formowanie funkcjonalnej struktury rzęski
 autoliza
 transformacja komponentów komórkowych
 wydzielanie białek
Autoliza komórki bakteryjnej zachodzi w wyniku niekontrolowanej aktywności endogennych
enzymów hydrolitycznych (autolizyn) wobec ściany komórkowej, co prowadzi do śmierci
komórki. Mechanizm tego procesu nie jest dotąd w pełni poznany.
Rozluźnienie struktury mureiny lub częściowe jej usunięcie powoduje, na skutek wysokiego
cisnienia wewnątrzkomórkowego (3 6Atm, a więc porównywalne z ciśnieniem
występującym w dętce rowerowej), pęknięcie błony cytoplazmatycznej i wyciek zawartości
komórki na zewnątrz. "Samobójcza" aktywność autolizyn jest, w nieznany dotąd sposób,
umożliwiana lub wyzwalana przez warunki wpływające hamująco na syntezę mureiny lub
naruszające strukturę osłon komórkowych.
Autoliza komórki bakteryjnej związana jest z degradacją mureiny przez endogenne enzymy.
Nie wszystkie hydrolazy mureinowe są potencjalnymi enzymami autolitycznymi mogącymi
spowodować lizę komórki bakteryjnej. W skład systemu autolitycznego E. coli wchodzą trzy
11
lityczne transglikozylazy Slt70, MltA, MltB oraz trzy endopeptydazy PBP4, PBP7 i MepA. U
B. subtilis, poprzez analizę sekwencji genomu, wykazano obecność ok. 35 potencjalnych
enzymów o aktywności hydrolaz mureiny.
W warunkach laboratoryjnych autolizę niektórych gatunków bakterii można wywołać w
różny sposób.
Najczęściej stosowane metody to:
- stworzenie warunków beztlenowych (np. dla Bacillus subtilis)
- zastosowanie czynników chaotropowych (np. kwas trichlorooctowy, etanol)
- usunięcie ze środowiska wzrostowego składnika ściany (kwas diaminopimelinowy)
nie syntetyzowanego przez bakterię
- inkubacja niektórych bakterii gramdodatnich w hipertonicznym podłożu
- zastosowanie czynników naruszających integralność błony zewnętrznej bakterii
gramujemnych (poliaminy, wersenian sodowy)
- potraktowanie rosnących bakterii antybiotykami hamującymi wczesne
(fosfonomycyna, D-cykloseryna) lub późne ( antybiotyki -laktamowe,
moenomycyna) etapy syntezy mureiny
- hodowle niektórych gatunków bakterii (Streptococcus pneumoniae, niektóre szczepy
Neisseria gonorrhoeae) ulegają spontanicznej lizie w krótkim czasie po osiągnięciu
fazy stacjonarnego wzrostu. Agregacja komórek Myxococcus xanthus w warunkach
głodu, z wytworzeniem ciał owocowych, połączona jest a autolizą ogromnej części
populacji. Niektóre gatunki bakterii ulegają spontanicznej autolizie w wyniku zmiany
pH lub potencjału oksydoredukcyjnego środowiska.
Stosunkowo najlepiej zbadano proces indukcji autolizy komórek bakteryjnych w obecności
antybiotyków -laktamowych. Klasyczne -laktamy indukują autolizę wyłącznie w
komórkach aktywnie rosnących. Mimo, że już minęło ponad 60 lat od odkrycia penicyliny
przez Fleminga, to efekt bakteriolizy jest nadal niezrozumiały. Powodem takiej sytuacji jest
brak dostatecznej wiedzy na temat wewnątrzkomórkowej kontroli enzymów autolitycznych.
Proponowane są dwie hipotezy dla wyjaśnienia autolizy pod wpływem działania
penicyliny i podobnych inhibitorów:
1. Model enzymatycznej równowagi (Weidel i Pelzer, 1964 ), który zakłada, ze wzrost
mureiny wymaga dwóch systemów enzymatycznych - hydrolaz i syntetaz, będących w
równowadze. Autoliza miałaby być wynikiem zachwiania tej równowagi na skutek
selektywnego zahamowania syntetaz, białek PBP przez penicylinę.
2. Mechanizm wyzwalania hydrolizy peptydoglikanu (Giesbrecht, 1992) zakłada, że
autoliza indukowana penicyliną jest rezultatem działania specyficznych hydrolaz, normalnie
biorących udział w procesie przecinania septy, podczas oddzielania się komórek potomnych
po podziale. Hydrolazy te kontynuują swoje działanie nawet mimo braku właściwego
formowania septy (zablokowane syntetazy PBP).
12
Wykonanie ćwiczenia
1. Przygotować hodowlę logarytmiczną (inoculum 1:20, 100 ml), A600 – 0,8,
następujących bakterii:
- Escherichia coli
- Bacillus subtilis
2. Hodowle odwirować (5 tys. rpm, 10 min, 4oC) w probówkach wirowniczych z
wykorzystaniem wirówki typu „Sorvall RC-5B” firmy DuPont Instruments.
3. W czasie wirowania należy rozlać na szalki rozpuszczone podłoże stałe (Agar
Odżywczy-AO)
4. Po zakończeniu wirowania, zlać supernatant (dokładnie osuszyć brzegi probówki
ręcznikiem papierowym w pozycji „do góry nogami”)
5. Osad zawiesić w 40 ml odpowiedniego buforu lizującego o składzie:
A)
- 40 ml buforu o pH=8,0 (50 mM Tris/HCl)
- 0,4 ml 100 mM EDTA
B)
-
40 ml buforu o pH=8,0 (50 mM Tris/HCl)
0,4 ml 100% Tritonu X-100
6. Wykonać spektrofotometryczny pomiar OD, przy długości fali 600 nm (t0)
UWAGA! Gęstość optyczna (optical density - OD) mierzona przy długości fali 600 nm
powinna mieścić się w zakresie 0,6-0,8. Jeżeli jest wyższa wartość OD, należy dolać
odpowiednią ilość buforu lizującego i ponownie wykonać pomiar.
7. Próby (zawiesinę bakterii) należy inkubować z wytrząsaniem w temp. 37oC. Kolejne
pomiary OD wykonywać po 10, 20, 30 , 40 i 60 minutach.
8. Jednocześnie po dokonaniu pomiaru OD, należy pobierać po 1 ml zawiesiny bakterii
w celu wykonania odpowiedniego rozcieńczenia (10-2; 10-4) w probówkach z
wykorzystanie soli fizjologicznej - RF i wysiania na podłoże stałe. Wyniki w postaci
liczby kolonii (przeżywalność) należy odczytać na następnych ćwiczeniach.
9. Odczytane wartości OD należy zestawić w tabeli i policzyć procentowy spadek
wartości OD, traktując wartość pomiaru w czasie t0 jako 100%. Wyniki doświadczenia
należy przestawiać w postaci wykresu – patrz przykład poniżej.
10. Po omówieniu wyników, należy sformułować i zapisać wnioski!
11. Dodatkowo, należy wykonać przyżyciowe obserwacje mikroskopowe.
Tabela
Czas
[min]
0
10
20
30
40
60
Escherichia coli
0,8/100%
X/X%
“
“
“
“
Bacillus subtilis
0,8/100%
X/X%
“
“
“
“
13
Wykres - przykład
Triton X-100-stimulated autolysis
of L. monocytogenes EGD and mutant MK
100
80
l. monocytogenes EGD
OD [%]
60
L. monocytogenes MK
40
20
0
0
30
60
90
120
time [min]
150
180
210
Literatura uzupełniająca:
1.Wykłady z Fizjologii Bakterii. Popowska M.
2.Biologia molekularna bakterii pod redakcją Baj J., Markiewicz Z., PWN 2006, 2015
(nowe wydanie)
3. Struktura i funkcje osłon bakteryjnych. Markiewicz Z., PWN 1993
4. Markiewicz Z., Popowska M. 2011. An Update on Some Structural Aspects of the
Mighty Miniwall Pol. J. Microbiol. 60(3):181-186
5. Popowska M. 2004. Analysis of the Peptidoglycan Hydrolases of Listeria
monocytogenes: Multiple Enzymes with Multiple Functions. Pol. J. Microbiol. 53: 29-34
6. Popowska M.1998. Bakteryjne enzymy hydrolizujące wiązania w mureinie. Post
Microbiol. 2, XXXVII.
14