badanie aktywności lizozymu

FAKULTET - FIZJOLOGIA BAKTERII
Koordynator - dr hab. Magdalena Popowska, prof. UW
ĆWICZENIE: BADANIE AKTYWNOŚCI ENZYMATYCZNEJ LIZOZYMU
Autor i główny prowadzący dr hab. Magdalena Popowska, prof. UW
Asysta: mgr Marta Piotrowska, mgr Rafał Ostrowski
Wstęp teoretyczny
Struktura mureiny tworzącej ścianę komórkową
Zarówno u bakterii gramdodatnich jak i gramujemnych, na zewnątrz błony
cytoplazmatycznej znajduje się sztywna struktura zwana mureiną (syn. peptydoglikan),
dodatkowo wzmocniona kwasami tejchojowymi lub techuronowymi (bakterie gramdodatnie)
oraz różnymi białkami, w tym lipoproteinami. Mureina pełni przede wszystkim funkcje
mechaniczne, chroniąc komórkę przed skutkami zmian ciśnienia osmotycznego, wieloma
czynnikami chemicznymi (rozpuszczalniki czy detergenty), nadaje także i utrzymuje
charakterystyczny dla danego gatunku bakterii kształt i uczestniczy w procesach związanych
z podziałem komórkowym. Szkielet cukrowy mureiny składa się z jednostek dwucukrowych
zbudowanych z reszt N-acetyloglukozoaminy (GlcNAc) oraz kwasu N-acetylomuraminowego
(MurNAc), połączonych wiązaniem -14 glikozydowym (Rys. 1.). Do reszty Dmleczanowej kwasu N-acetylomuraminowego dołączony jest krótki peptyd, w skład którego
wchodzą zarówno typowe dla białek bakterii i organizmów wyższych izomery L, jak i rzadko
występujące izomery D, aminokwasów. Tetrapeptydy i tripeptydy sąsiadujących ze sobą
łańcuchów połączone są poprzecznymi wiązaniami peptydowymi. W ostatnim etapie
biosyntezy mureiny, to jest w wydłużaniu łańcuchów cukrowych (transglikozylacja) i
tworzeniu wspomnianych wiązań poprzecznych (transpeptydacja) uczestniczą białka, które
potrafią również wiązać penicylinę i wskutek tego zostały nazwane białkami wiążącymi
penicylinę (PBP). W czasie tzw. procesów dojrzewania mureiny, towarzyszących wzrostowi
komórki bakteryjnej, makrocząsteczka ta u niektórych gatunków bakterii, przede wszystkim
chorobotwórczych, ulega pewnym modyfikacjom. Do tego rodzaju zmian w części
glikanowej należy brak acetylacji grupy aminowej przy węglu C-2 w resztach glukozoaminy
lub kwasu muraminowego lub dodatkowa O-acetylacja kwasu N-acetylomuraminowego przy
węglu C-6. Obie te modyfikacje czynią mureinę mniej podatną na aktywność niektórych
muramidaz, np. lizozymu (występującego w komórkach i płynach ustrojowych ssaków), który
hydrolizuje wiązanie glikozydowe w łańcuchu cukrowym mureiny.
Deacetylazy N-acetyloaminocukrów
W trakcie biosyntezy bakteryjnej mureiny, tworzącej zrąb ściany komórkowej,
dołączane są prekursory w postaci disacharydopeptydu zawierającego N-acetyloglukozoaminę
(GlcNAc) i kwas N-acetylomuraminowy (MurNAc). W „dojrzałej” mureinie niektórych
bakterii, w tym bakterii patogennych, część reszt aminocukrowych może występować w
postaci nie N-acetylowanej (dotyczy to zarówno glukozoaminy, jak i kwasu muraminowego).
W mureinie oportunistycznej bakterii L. monocytogenes około 70% reszt glukozoaminy jest
niepodstawionych grupą acetylową (badania naszej grupy badawczej), co czyni ją gorszym
substratem dla lizozymu Dopiero w roku 2002 wykryto u dwoinki zapalenia płuc enzym o
charakterze deacetylazy GlcNAc, który przypuszczalnie in vivo usuwa grupy acetylowe z
aminocukru. Podobne badania przeprowadzono również u bakterii glebowowych z rodzaju
Bacillus (2008 r.), a w roku 2007 opisano deacetylazę GlcNAc u L. monocytogenes.
Wyniki te podkreślają centralną rolę N-deacetylacji peptydoglikanu w wirulencji L.
monocytogene i Streptococcus pneumoniae. Dzięki tej modyfikacji komórki bakterii są zdolne
do przeżycia w przewodzie pokarmowym, w profesjonalnych fagocytach, ponieważ nie są
wrażliwe na działanie lizozymu. Istotną konsekwencją N-deacetylacji peptydoglikanu jest
1
zwiększenie przeżywalności bakterii w pierwszych, a także późnychj etapach procesu
infekcji.
Lizozym
Enzym o właściwościach muramidazy, zdolny do hydrolizy wiązań -14 glikozydowych
pomiędzy N-acetyloglukozoaminą (GlcNAc) oraz kwasem N-acetylomuraminowymo
(MurNAc). Lizozym występuje w niektórych komórkach i płynach ustrojowych człowieka
oraz zwierząt i stanowi bardzo istotną pierwszą barierę dla bakterii. Największe jego ilości
można znaleźć we łzach oraz w białku jaja kurzego.
G
N-acetylmuramic acid (MurNAc)
O
CH2OH
O
H H
OH H
H
LD-C
DD-C
O
H
H
H
CH2OH
O
H H
OH H
O
H NH
O
H C CH3 C O
C O
CH 3
H N
H C CH3
L-alanine
C O
T
H N
HOOC C H
CH2
D-glutamic acid
CH2
C O
O
H N
C OH
O
meso-DAP H C (CH2)3 CH
C O
NH C
H N
D-alanine H3C C H
C O
H N
D-alanine H3C C H
COOH
N -Acetylglucosamine
A
CH2OH
O
H H
O
NH
C O
CH 3
H
O
H
NH
C O
CH 3
N-Acetylglucosamine (GlcNAc)
E
CH 3
C H
D-alanine
NH
O
C O
C OH
H C (CH2)3 CH
O
H N
NH C
meso-DAP
C O
CH2
CH2
D-glutamic acid
HOOC C H
H N
C O
H3C C H
A
L-alanine
H N
C O
G
H3C C H
MurNAc
T
GlcNAc
MurNAc
Rysunek 1. Struktura mureiny (peptydoglikanu) Escherichia coli
Wykonanie ćwiczenia
Izolacja lizozymu z jaja kurzego oraz oznaczanie jego stężenia
1. Umyć dokładnie detergentem świeże jajko kurze,
2. Po rozbiciu jajka należy przelać białko do cylindra o objętości 50 ml w celu
odczytania objętości, odczytaną wartość zanotować,
3. Białko kurze rozcieńczyć 1:1000 w buforze fosforanowym o pH=7,,4
2
4. Przygotować roztwór lizozymu krystalicznego (Serva) w stężeniu 1 mg/ml, a
następnie wykonać szereg rozcieńczeń: 100, 10, 5 g/ml w probówkach typu
Eppendorf.
Przygotowanie hodowli Micrococcus lysodeikticus
1. Bakterie Micrococcus lysodeikticus zebrać z szalek i materiał z każdej szalki zawiesić
w 4 ml buforu fosforanowego o pH=7,4. (UWAGA! Na poprzednich ćwiczeniach (2
dni wcześniej) rozsiać na szalki z agarem odżywczym Micrococcus lysodeikticus).
2. Tak przygotowana zawiesina będzie wykorzystana do oznaczenia aktywności
lizozymu wg podanej poniżej tabeli.
OZNACZANIE AKTYWNOŚCI ENZYMATYCZNEJ LIZOZYMU
1. Przygotować szereg probówek do oznaczenia aktywności enzymatycznej lizozymu
wyizolowanego z białka jajka kurzego (rozcieńczenie 1:1000) lub lizozymu
komercyjnego (stężenie 10, 5 g/ml) wg podanej poniżej tabeli
2. Po przygotowaniu szeregu probówek należy spektrofotometrycznie zmierzyć OD
mieszaniny przy długości fali 520 nm i wpisać w odpowiedniej pozycji w tabelę.
Próby inkubować 30 minut w temp. 37oC, a następnie ponownie odczytać wartość
OD.
3. Dodatkowo należy oznaczyć aktywność enzymatyczną lizozymu z wykorzystaniem
testu szalkowego (jako substrat liofilizat komórek Micrococcus lysodeikticus).
4. Uzyskane wyniki przedstawić w postaci tabeli i wykresów.
Tabela
z wykorzystaniem probówek szklanych
Nr
Bufor
Fosforanowy (ml)
Lizozym z
jajka/lizozym (Serva)
Micrococcus luteuszawiesina (ml)
OD w czasie t0
OD po 30 min
1
0
2
2
3
3
4
3,5
5
3,75
6
3,88
7
3,94
4
2
1
0,5
0,25
0,12
0,06
0,3
0,3
0,3
0,3
0,3
0,3
0,3
Tabela
z wykorzystaniem probówek Eppendorf
Nr
Bufor
Fosforanowy (ml)
Lizozym z
jajka/lizozym (Serva)
Micrococcus luteuszawiesina (ml)
OD w czasie t0
OD po 30 min
1
0
2
0,2
3
0,3
4
0,35
5
0,375
6
0,388
7
0,394
0,4
0,2
0,1
0,05
0,025
0,012
0,006
0,03
0,03
0,03
0,03
0,03
0,03
0,03
3
TEST SZALKOWY - BADANIE AKTYWNOŚCI HYDROLITYCZNEJ
(na podstawie Becker i wsp. 2015)
Materiały:
 Agar odżywczy
 Roztwór liofilizowanych komórek Micrococcus lysodeikticus (200 mg/ml).
 Roztwór Ampicylina (100 mg/ml)/ Roztwór azydku sodu 0,2%
Wykonanie:
 Rozpuścić w Aparacie Koch'a Agar odżywczy, schłodzić w łaźni wodnej do ok. 48C
i dodać 200 l roztworu ampicyliny/azydku sodu do końcowego stężenia 0,02% i 3 ml
roztworu komórek M. lysodeikticus.
 Mieszaninę wylewać na szalki Petriego 95 mm po ok. 7 ml (cienka warstwa).
 Na szalki nanieść badany enzym hydrolityczny - lizozym (np. poprzez nasączenie
czystych krążków antybiotykowych) i inkubować przez 16 h w 37C.
 Po tym czasie zmierzyć strefę przejaśnienia.
Literatura uzupełniająca:
1.Biologia molekularna bakterii pod redakcją Baj J., Markiewicz Z., PWN 2006, 2015
(nowe wydanie)
2. Struktura i funkcje osłon bakteryjnych. Markiewicz Z., PWN 1993
3. Markiewicz Z., Popowska M. 2011. An update on some structural aspects of the mighty
miniwall Pol. J. Microbiol. 60(3):181-186
4. Popowska M., Kusio M., Szymańska P., Z. Markiewicz. 2009. Inactivation of the wallassociated de-N-acetylase (PgdA) of Listeria monocytogenes results in greater
susceptibility of the cells to induced autolysis. J. Microbiol. Biotechnol. 9:932-945
5. Popowska M. 2004. Analysis of the peptidoglycan hydrolases of Listeria
monocytogenes: Multiple Enzymes with Multiple Functions. Pol. J. Microbiol. 53: 29-34
6. Becker S.C., Swift S., Korobova O., Schischkova N., Kopylov P., Donovan D.M.,
Abaev I. 2015. Lytic activity of the staphylolytic Twort phage endolysin CHAP domain
is enhanced by the SH3b cell wall binding domain. FEMS Microbiol Lett. 362(1):1-8. doi:
10.1093/femsle/fnu019
4