Ćwiczenie U1/U2 - Wydział Chemii UJ

Chemiczne badania kryminalistyczne i toksykologiczne
Ćwiczenie U3
Identyfikacja i oznaczenie związku psychotropowego
w preparacie farmaceutycznym metodą wysokosprawnej
chromatografii cieczowej z detekcją spektrofotometryczną
w zakresie UV
Chemiczne badania kryminalistyczne i toksykologiczne
Chemiczne badania kryminalistyczne i toksykologiczne
Wprowadzenie
Leki stanowią dużą grupę związków, najczęściej organicznych, która stanowi
ważny przedmiot sądowej analizy toksykologicznej. Substancje te są identyfikowane
i oznaczane zarówno w materiale biologicznym (w płynach ustrojowych – krwi, osoczu,
moczu oraz w wycinkach narządów wewnętrznych – wątrobie, nerce, mózgu) jak
i materiale nie biologicznym, np. płynach, proszkach, tabletkach. Te ostatnie materiały
(nie biologiczne) często bywają znajdowane przy zwłokach lub wśród rzeczy osobistych
osób, które uległy zatruciu. Nieraz również całe tabletki lub ich fragmenty są
znajdowane w treści pokarmowej żołądka. Wspomniane materiały są zabezpieczane
wraz z materiałem biologicznym do badań sądowych, gdyż wyniki ich analizy
niejednokrotnie stanowią cenną wskazówkę, jaką (-ie) truciznę (-y) (np. leki) spożyła
osoba zatruta i tym samym pozwalają ukierunkować dalszy tok analizy materiału
biologicznego.
Do leków będących szczególnym przedmiotem zainteresowania toksykologów
sądowych należą leki psychotropowe z grupy pochodnej fenotiazyny (PHE) oraz
z grupy trójpierścieniowych leków przeciwdepresyjnych (TCA). Związki te bowiem
są powszechnie stosowane w terapii chorób psychicznych i często są przyczyną
śmiertelnych zatruć.
Najczęściej stosowanymi metodami w analizie toksykologicznej leków są
metody
chromatograficzne
(chromatografia
gazowa
(GC)
i
wysokosprawna
chromatografia cieczowa (HPLC) z różnymi metodami detekcji oraz chromatografia
cienkowarstwowa
(TLC)),
a
także,
metody
immunologiczne
(immunoassays)
i spektrofotometria w zakresie UV-VIS. Od ostatniego dziesięciolecia ubiegłego wieku,
w analizie leków w płynach ustrojowych i w preparatach farmaceutycznych znaczącą
rolę zaczęła odgrywać metoda elektroforezy kapilarnej (CE), a szczególnie jej dwa
warianty separacyjne, tj. strefowa elektroforeza kapilarna (CZE) i micelarna
elektrokinetyczna chromatografia kapilarna (MECC). Metody te są jednak wciąż
na etapie rozwoju, zwłaszcza jeśli chodzi o ich rutynowe zastosowanie w analizie
toksykologicznej.
Trójpierścieniowe leki przeciwdepresyjne – ogólna charakterystyka
Trójpierścieniowe leki przeciwdepresyjne (TCA), spośród których można
wymienić
amitryptylinę,
imipraminę,
doksepin,
nortryptylinę,
dezypraminę
Chemiczne badania kryminalistyczne i toksykologiczne
i klomipraminę
należą
do
pochodnych:
dibenzodiazepiny
(np.
imipramina,
dibenzocykoheptadienu (np. amitryptylina) oraz dibenzoksepiny (np. doksepin).
Właściwości fizykochemiczne ww. leków zebrano w tabeli 1.
Podchodne dibenzepiny
Imipramina (Imipramine
Klomipramina (Clomipramine
hydrochloride)
hydrochloride)
C19H24N2⋅HCl
C19H24ClN2⋅HCl
N
N
Cl
CH3
CH3
N
N
CH3
CH3
Dezypramina (Desipramine
Opipramol (Opipramol
hydrochloride)
hydrochloride)
C18H22N2⋅HCl
C23H29N3O⋅HCl
N
N
CH3
N
N
H
N
OH
Pochodne dibenzocykoheptadienu
Amitryptylina (Amitryptyline
Nortryptylina (Nortryptyline
hydrochloride)
hydrochloride)
C20H23N⋅HCl
C19H21N⋅HCl
H
CH3
N
N
CH3
CH3
Chemiczne badania kryminalistyczne i toksykologiczne
Pochodne dibenzoksepiny
Doksepina (Doxepin hydrochloride)
C19H21NO⋅HCl
O
CH3
N
CH3
Tabela 1 Właściwości fizykochemiczne wybranych trójpierścieniowych leków przeciwdepresyjnych
Nazwa związku
Masa
soli
molowa (m. T.top.
pKa
[oC]
molowa soli)
[g/mol]
Położenie
maksimum
pasm abs. w
UV [nm]
Amitryptylina
277,4
(313,9)
Dezypramina
266,4
(302,8)
214
10,2
250
Doksepina
279,4
(315,8)
185-191
9,0
292
Imipramina
280
(316,9)
170-174
9,5
251
252
Klomipramina
314,9
(351,3)
ok. 192
Nortryptylina
263,4
(299,8)
215-220
Opipramol
363,5
(436,4)
195-199
210
9,42
239
251
9,7
3,8
239
253
Postać
fizyczna
soli
bezbarwne
kryształy lub
biały proszek
biały proszek
krystaliczny
Rozpuszczalność
woda, etanol,
chloroform
woda, etanol,
chloroform,
praktycznie
nierozp. w eterze
biały proszek woda, etanol,
krystaliczny
chloroform
biały lub lekko woda, etanol,
żółty proszek chloroform,
krystaliczny
praktycznie
nierozp. w eterze
biały lub lekko woda, etanol,
żółty proszek chloroform
krystaliczny
biały proszek woda, etanol
lekko żółty
b.dobrze w
krystaliczny
wodzie, etanol
proszek,
czerwieniejący
na świetle
TCA działają przeciwdepresyjnie, silnie pobudzają psychomotorycznie lub
przeciwdepresyjnie uspokajająco, znoszą uczucie lęku, nieprzyjemnego napięcia
psychicznego. Mechanizm działania TCA nie jest całkowicie poznany, uważa się
jednak,
że
hamują
one
wychwyt
uwolnionej
z
neuronu
noradrenaliny
i 5-hydroksytryptaminy, zwiększając stężenie tych amin wokół receptora. Leki te należą
do najczęściej stosowanych w terapii schorzeń psychicznych o charakterze depresji.
Dawkowanie TCA oraz ich stężenia spotykane we krwi zebrano w tabeli 2.
Chemiczne badania kryminalistyczne i toksykologiczne
TCA silnie wiążą się z tkankami (87-96%), co powoduje, że stężenie w tkankach
jest znacznie wyższe niż we krwi. Metabolizowane są w wątrobie poprzez procesy
demetylacji, N-oksydacji i hydroksylacji, a następnie ulegają sprzęgnięciu z kwasem
glukuronowym. Charakterystyczne dla tej grupy leków jest to, iż ich metabolity
(np. nortryptylina – metabolit amitryptyliny oraz dezypramina- metabolit imipraminy)
również wykazują działanie farmakologiczne. Poziomy stężeń TCA we krwi
w przypadkach zatruć wynoszą zwykle powyżej 1 µg/ml.
Tabela 2 Dawki dobowe oraz zakresy stężeń terapeutycznych i toksycznych wybranych leków
psychotropowych
Stężenia
Stężenia
Maksymalna
toksyczne
terapeutyczne
Okno terapeutyczne1
1
dobowa dawka
Nazwa leku
[mg]
(krew) 2
(krew)2
[mg]
[µg/ml]
[µg/ml]
Amitryptylina
300
150-200
0,05-0,2
0,5-2,0
Dezypramina
200
100-150
0,075-0,25
0,5
Doksepina
300
100-200
0,1-0,25
0,5-2,0
Imipramina
300
150-200
0,045-0,15
0,4-0,5;L=2
Klomipramina
300
150-200
0,05-0,15
0,4
Nortryptylina
300
150-200
0,05-0,14
osocze3
Opipramol
300
150-200
b.d.
0,2
osocze3
0,115
osocze3
b.d. – brak danych; L – stężenie spotykane w przypadkach zatruć śmiertelnych
*
- stężenie wyjściowe w początkowym okresie
Wysokosprawna chromatografia cieczowa– aparatura oraz podstawy teoretyczne
Chromatografia
jest
jedną
z
najbardziej
rozpowszechnionych
metod
instrumentalnych w chemii analitycznej, a w analizie związków organicznych zajmuje
pozycję lidera. Zapewnia ona możliwość identyfikacji substancji oraz ich ilościowej
analizy, nawet w niskich stężeniach w obecności innych związków.
Możliwość rozdzielania chromatograficznego substancji wynika z faktu,
że poszczególne składniki próbki w niejednakowym stopniu ulegają podziałowi między
dwie niemieszające się fazy, przy czym jedna z tych faz jest ruchoma (tzw. eluent),
a druga
stanowi
nieruchome
wypełnienie
kolumny
chromatograficznej
(faza
stacjonarna). Różnica we współczynnikach podziału (K) składników mieszaniny
1
Pużyński S. (1996) Leki psychotropowe. Podręczny poradnik terapii, Springer PWN, Warszawa
Uges D. R. A. (1996) Therapeutic and Toxic drug concentrations, Bull. Int. Assoc. of Forensic Toxicol.,
26:1 (Suppl.)
3
Brandys J. (1999) Toksykologia – wybrane zagadnienia, Wydawnictwo Uniwersytetu Jagiellońskiego,
Kraków
2
Chemiczne badania kryminalistyczne i toksykologiczne
pomiędzy fazę ruchomą i fazę stacjonarną warunkuje rozdzielenie tych substancji.
K jest wielkością charakteryzującą daną substancję i zależy od fazy stacjonarnej.
Między liczbą cząsteczek związków chromatografowanych, obecnych w fazie ruchomej
i nieruchomej, ustala się równowaga dynamiczna. Naturalne przemieszczanie się
substancji rozdzielanych w kolumnie następuje tylko w fazie ruchomej, tj.
za pośrednictwem gazu nośnego (chromatografia gazowa) lub eluentu (chromatografia
cieczowa).
Efekt rozdzielenia chromatograficznego wykreślony jest w postaci krzywej elucji
(chromatogramu), przedstawiającego zależność sygnału analitycznego od czasu retencji
lub
objętości
retencji.
Czas
retencji
oznacza
czas
przebywania
substancji
chromatografowanej w kolumnie.
Do wykonania analiz techniką chromatografii cieczowej kolumnowej służy
chromatograf cieczowy. W skład aparatu wchodzi:
− zbiornik lub zbiorniki z rozpuszczalnikami tworzącymi fazę ruchomą
− kolumna wypełniona fazą stacjonarną, zazwyczaj umieszczona w termostacie
w celu utrzymania stałej temperatury procesu separacji
− dozownik, który umożliwia wprowadzenie próbki do układu, umieszczony
między pompą a kolumną
− detektor wykrywający rozdzielone na kolumnie składniki próbki
− komputer (rzadziej integrator) rejestrujący sygnał z detektora w postaci piku
chromatograficznego
Literatura obowiązkowa
1. W. Szczepaniak, Metody instrumentalne w analizie chemicznej, PWN, 2002
2. Z. Witkiewicz, Podstawy chromatografii, WNT, 2002
3. P. Kościelniak, „Problematyka kalibracji w analizie chemicznej” w: Chemia
Środowiska cz.2, str. 294-297
oraz
Informacje zawarte w Instrukcji do ćwiczenia
Chemiczne badania kryminalistyczne i toksykologiczne
ĆWICZENIE U3
Identyfikacja i oznaczenie związku psychotropowego w preparacie
farmaceutycznym techniką wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC)
Cel ćwiczenia
1. Przeprowadzenie analizy materiału dowodowego techniką wysokosprawnej
chromatografii cieczowej na obecność substancji psychotropowych.
a. Przygotowanie próbki do analizy.
b. Kalibracja.
c. Wykonanie pomiarów
2. Zapoznanie się z poprawnym sporządzeniem sprawozdania z przeprowadzonych
oględzin badanego materiału dowodowego i jego analizy chemicznej oraz
sformułowaniem wniosków z badań, dla celów opinii sądowej.
Zakres materiału naukowego
9 Podstawowe
wiadomości
na
temat
struktury
chemicznej,
własności
fizykochemicznych i farmakologicznych leków z grupy trójpierścieniowych
leków przeciwdepresyjnych
9 Podstawy teoretyczne chromatografii cieczowej oraz budowa aparatu do HPLC.
9 Metody detekcji stosowane w chromatografii cieczowej.
9 W jakich dziedzinach analizy sądowej można wykorzystywać chromatografię
cieczową?
9 Co to jest standard (wzorzec) wewnętrzny, jakie musi spełniać warunki
i w jakim celu się go stosuje?
Odczynniki, materiały, aparatura
Materiał badany: materiał dowodowy pobrany z miejsca zdarzenia
Odczynniki i materiały: metanolowe roztwory (stężenie 1mg/ml) leków
(w postaci chlorowodorków): amitryptyliny, imipraminy, doksepiny, nortryptyliny,
dezypraminy, acetonitryl, bufor fosforanowy pH=7,1 (10mM K2HPO4), metanol.
Chemiczne badania kryminalistyczne i toksykologiczne
Aparatura: chromatograf cieczowy, LaChrom, (Merck, USA), kolumna RP
Select-B o długości 12,5 cm, średnicy 4,6 mm, średnica ziarna 5 µm.
Dodatkowy sprzęt: waga analityczna, moździerz, wytrząsarka typu vortex,
kolby miarowe (25 i 10 ml), pipety automatyczne, lejek, naczyńko wagowe, naczyńka
szklane (4 ml), naczynie szklane (20 ml), zlewki, plastikowe pipety Pasteura.
Sposób wykonania:
I Przeprowadzić dokładne oględziny materiału przeznaczonego do badania
(dowodu rzeczowego) oraz sporządzić jego opis (uwzględnić sposób zabezpieczenia
dowodu, odpisać treść na ewentualnej przywieszce). Zapoznać się z pytaniami
zawartymi w piśmie lub postanowieniu, skierowanym do biegłego. Jeśli jest to
potrzebne przeprowadzić wstępne czynności analityczne, np. zważyć badany materiał,
określić zapach, zmierzyć pH roztworu, itp.
Przykładowe przygotowanie tabletki – dowodu zabezpieczonego na miejscu
zdarzenia
II Pobrać reprezentatywną próbkę dowodu i przygotować ją do badań. Wziąć
jedną tabletkę i zważyć ją na wadze analitycznej. Jeśli tabletka jest powleczona
zewnętrzną warstwą usunąć ją używając wody z kranu, przepłukać tabletkę wodą
destylowaną i wysuszyć. Następnie tabletkę rozetrzeć w moździerzu i pobrać
ok. połowę proszku do analizy. Pobraną część proszku odważyć w naczyńku wagowym
na wadze analitycznej i przenieść ilościowo za pomocą metanolu do kolbki na 25 ml.
Kolbkę uzupełnić metanolem do kreski, a jej zawartość dokładnie i energicznie
wymieszać. Przelać część roztworu do naczynia szklanego (20 ml) (wypełnić
roztworem w ok. ½ pojemności), zatkać naczynie parafilmem i umieścić w wirówce.
Wirówkę wyważyć drugim takim samym naczyniem, wypełnionym tą samą objętością
wody i wirować przez 5 minut, przy obrotach 4000 rpm. Następnie pobrać 1 ml
supernatantu i rozcieńczyć go 10 razy mieszaniną acetonitrylu i fazy wodnej (1:1, v/v).
III Sporządzić roztwór wzorca wewnętrznego o stężeniu 0,05 mg/ml
w mieszaninie acetonitrylu i buforu fosforowego pH=7,1 (1:1 v/v). Następnie
sporządzić mieszaninę wzorcową pięciu leków z grupy TCA: nortryptyliny,
dezypraminy, amitryptyliny, imipraminy i doksepinu. Przygotować próbkę zawierającą
wzorce badanych leków w stężeniu 5µg/ml. W tym celu pobrać pipetą takie ilości
Chemiczne badania kryminalistyczne i toksykologiczne
metanolowych roztworów leków o stężeniu 1mg/ml, odparować metanol w strumieniu
azotu i suchą pozostałość rozpuścić w 1ml przygotowanego roztworu wzorca
wewnętrznego.
IV Wykonać analizę skryningową (przesiewową). Przygotowaną mieszaninę
wzorcową leków i próbkę nieznana umieścić w przystawce automatycznego podajnika
próbek chromatografu i przeprowadzić analizę chromatograficzną wzorców stosując
program elucji gradientowej, prędkość przepływu fazy ruchomej 2 ml/min, objętość
próbki wprowadzonej do kolumny 10µl.
Czas[min.] Bufor fosforanowy (%) Acetonitryl (%)
0
45
55
8
45
55
15
35
65
18
35
65
20
45
55
25
45
55
Na podstawie czasów retencji i widm UV badanych związków umieszczonych
w bazie danych przyporządkować piki otrzymane na chromatogramie mieszaniny
wzorcowej leków. Porównać chromatogramy dla mieszaniny wzorcowej oraz badanej
tabletki i wstępnie zidentyfikować (na podstawie czasów retencji) związek czynny
w tabletce.
V Przeprowadzić analizę ilościową substancji czynnej w tabletce. W celu
oznaczenia substancji czynnej w tabletce sporządzić 3-punkową krzywą kalibracyjną,
stosując odpowiednio stężone wzorcowe roztwory tego leku z takim samym dodatkiem
(stężeniem) wybranego standardu wewnętrznego. Do badanego roztworu tabletki
również dodać ten standard wewnętrzny w takim samym stężeniu. Dla każdego
roztworu (wzorcowych i badanego) wykonać pomiar.
VI Opracować wyniki analizy i zinterpretować je. Zidentyfikować substancje
czynne w tabletce na podstawie czasu retencji i widma UV. Następnie wykreślić
odpowiednią krzywą kalibracji dla zidentyfikowanej substancji czynnej, w ten sposób,
że na osi rzędnych odłożyć stosunek pola pod powierzchnią odpowiedniego piku do
pola pod powierzchnią piku wzorca wewnętrznego (Sx / SIS ), a na osi odciętych -
Chemiczne badania kryminalistyczne i toksykologiczne
stężenie oznaczanej substancji (cx ). Wyznaczyć równanie krzywej wzorcowej i policzyć
z niego stężenie leku. Uzyskany wynik stężenia przeliczyć na masę całej tabletki
i podać go w mg.
Sporządzić opinię dla Sądu wg następujących punktów:
1.
Nawiązać w 1-2 zdaniach do otrzymanego pisma i postanowienia Prokuratury.
2.
Podkreślić cel przeprowadzenia zleconych badań.
3.
Sporządzić dokładny opis badanego dowodu rzeczowego
4.
Napisać zwięzłą część sprawozdawczą z przeprowadzonych badań (w tym
również uwzględnić sposób przygotowania dowodu do badań).
5.
W części dotyczącej wykonania analiz podać dokładnie zastosowaną metodę
analityczną (nazwę i parametry doświadczalne metody), a także model i firmę
stosowanego aparatu.
6.
Podać końcowy wynik zarówno analizy jakościowej jak i ilościowej. Jeżeli nie
można kategorycznie wypowiedzieć się na temat uzyskanego wyniku
(na przykład była dostępna tylko jedna metoda i technika analityczna,
dysponowano niewystarczającą ilością materiału do badań, itd.) należy
to podkreślić. Zawsze należy pamiętać, iż uzyskany wynik jedną metodą
analityczną należy potwierdzić przynajmniej jeszcze drugą metodą o podobnej
czułości i odmiennym mechanizmie fizykochemicznym. Szczególnie dotyczy to
analiz sądowych!
7.
Na końcu opinii podać w zwięzły i logiczny sposób wnioski wyciągnięte
z przeprowadzonych analiz i oględzin badanego materiału.
8.
W ostatnim zdaniu podać informację, czy pozostała jakaś reszta materiału
po badaniach oraz gdzie i do jakiego terminu będzie przechowywana.
9.
Ostatecznie złożyć swój podpis pod sporządzoną opinią.