Wielofunkcyjność białka MDM2 oraz jego rola w niestabilności

Wielofunkcyjność białka MDM2 oraz jego rola
w niestabilności genomowej komórek nowotworowych
Marta Małuszek1,2, 
Instytut Biochemii i Biofizyki PAN, Warszawa
2
Międzynarodowy Instytut Biologii Molekularnej i Komórkowej, Warszawa
1
Zakład Biologii Molekularnej, Międzynarodowy Instytut Biologii Molekularnej i
Komórkowej w Warszawie, ul. Księcia Trojdena 4, 02-109 Warszawa; tel.: (22) 597 07 00
wew. 741, e-mail: [email protected]

Artykuł otrzymano 1 października 2014 r.
Artykuł zaakceptowano 27 listopada 2014 r.
Słowa kluczowe: supresor nowotworów,
transformacja nowotworowa, onkogen,
MDM2, naprawa dwuniciowych pęknięć
DNA
Wykaz skrótów: DSB (ang. DNA double
strand break) – pęknięcia dwuniciowe DNA;
dsDNA (ang. double-strand DNA) – dwuniciowy DNA; HR (ang. homologous recombination) – rekombinajca homologiczna;
MDM2 – (ang. mouse double minute 2); MEF
(ang. mouse embryonic fibroblasts) – mysie fibroblasty zarodkowe; MRN – (ang. MRE11-RAD50-NBN); NBN – nibryna; NBN/NBS1
(ang. Nijmegen breakage syndrome protein 1,
NBS1); NHEJ (ang. non-homologous end joining) – niehomologiczne łączenie końców;
p53 – (ang. cellular tumor antigen p53); SSA
(ang. single strand annealing) – dopasowanie pojedynczych nici; ssDNA (ang. single-strand DNA) – jednoniciowy DNA
Podziękowania: Autorka składa podziękowania Prof. dr hab. Alicji Żylicz oraz Prof.
dr hab. Maciejowi Żylicz za wsparcie merytoryczne i edytorskie w przygotowaniu niniejszej pracy. Badania prowadzone przez
autorkę poniższej pracy przeglądowej były
finansowane ze środków na naukę przyznanych przez Narodowe Centrum Nauki
na realizację projektu NCN 2012/06/A/
NZ1/00089.
STRESZCZENIE
B
adania nad powstawaniem i biologią nowotworów ujawniły zwiększony poziom białka MDM2 w różnych jego typach. Jednocześnie dowiedziono, że MDM2 w pewnych
warunkach może działać hamująco na proces transformacji nowotworowej. To sprawia, że
mówi się o podwójnej roli MDM2, białka manifestującego właściwości onkogenne jak i supresorowe. Złożona budowa, szereg makrocząsteczek oddziałujących z MDM2, a także wiele
modyfikacji potranslacyjnych wpływają na różnorodność funkcji MDM2 w komórce. Zaburzenie równowagi w działaniu MDM2 wpływa na proces transformacji i rozwoju nowotworów. Charakterystyczna dla komórek nowotworowych jest niestabilność genomowa, która
bardzo często jest wynikiem zaburzeń naprawy DNA. W przypadku komórek prawidłowych
MDM2 działa jako białko onkogenne, hamując naprawę uszkodzeń DNA. W przypadku komórek nowotworowych MDM2 stymuluje naprawę uszkodzeń DNA wywołanych chemio- i
radioterapią, stymulując w ten sposób zarówno chemio- jak i radiooporność.
WPROWADZENIE
Białko MDM2 z biochemicznego punktu jest E3 ligazą ubikwityny, która ubikwityluje i prowadzi do degradacji supresor nowotworów, białko p53. Obecny
stan wiedzy pozwala jednak postrzegać MDM2 jako wielofunkcyjne białko zaangażowane w bardzo różnorodne procesy komórkowe. Jest dobrze udokumentowane, że MDM2 ulega deregulacji w wielu przypadkach nowotworów i działa
onkogennie zarówno za sprawą hamowania p53 jak i innych, niezależnych od
p53 aktywności. MDM2 odgrywa znaczącą rolę w regulacji naprawy DNA prawidłowych komórek, a wszelkie aberracje zaburzające ten proces są potencjalnie
kancerogenne. W obliczu obecnie prowadzonych badań mających przybliżyć
molekularny mechanizm powstawania i funkcjonowania komórek nowotworowych, zagadnienie MDM2 zajmuje znaczące miejsce. Obserwacje prowadzone
nad onkogennym charakterem MDM2 często wydają się być rozbieżne lub nawet wykluczające się. Celem niniejszej pracy przeglądowej jest przedstawienie
udziału białka MDM2 w generowaniu niestabilności genomowej komórek nowotworowych oraz w naprawie dwuniciowych pęknięć DNA w świetle najnowszych doniesień literaturowych.
PROTOONKOGEN MDM2
Protoonkogen Mdm2 (ang. Mouse double minute 2)1 został odkryty jako jeden
z trzech genów (Mdm1, Mdm2 i Mdm3) ulegających ponad 50-krotnej amplifikacji w pozachromosomalnym regionie nazywanym „double minute”, w mysich
komórkach 3T3-DM, które uległy spontanicznej transformacji. Analiza tych sekwencji wykazała, że w mysim genomie, w chromosomie 10 zlokalizowane są
geny Mdm1 i Mdm2 [1]. Dziś wiadomo, że Mdm2 jest szeroko reprezentowany w
świecie organizmów począwszy od bezkręgowców tak prostych jak płaskowce,
jeżowce czy ukwiały, poprzez pajęczaki, mięczaki, niższe i wyższe kręgowce, aż
do człowieka [2,3]. Już jedne z pierwszych badań ujawniły, że brak genu Mdm2 u
myszy okazał się letalny, natomiast równoczesny brak genu Trp53, który koduje
supresor nowotworów białko p53, powodował zniesienie letalności [4]. Przeprowadzono także doświadczenia, w których wykorzystano myszy o zmniejszonej
o ok. 30% ekspresji Mdm2. Zwierzęta takie miały obniżoną masę ciała, wykazywały wady w hematopoezie i charakteryzowały się wyższą wrażliwością na
promieniowanie jonizujące [5]. Ludzki gen MDM2 (Ryc. 1) jest złożony z 12 eksonów, które mogą generować więcej niż jeden produkt [6]. Są znane dwa promotory w obrębie sekwencji MDM2, P1 i P2 (Ryc. 1). P2 jest regulowany transkrypcyjnie przez p53, a jego aktywacja prowadzi do powstania białka MDM2 o
pełnej długości i masie 55 kDa. Promotor P1 jest aktywowany konstytutywnie, a
1 Zgodnie z obowiązującą nomenklaturą nazwa genu i białka ludzkiego zostały napisane wielkimi literami, natomiast w
nazwie genu i białka mysiego pierwsza litera jest wielka, pozostałe są małe. Nazwy genów dodatkowo zostały napisane
kursywą.
42
www.postepybiochemii.pl
FUNKCJE I LOKALIZACJA MDM2
Rycina 1. Regulacja transkrypcji MDM2. Pierwszym kodującym eksonem genu
MDM2 jest ekson 2. Promotor P2 (znajdujący się w eksonie 2) jest indukowany
przez p53, podczas gdy transkrypcja z promotora P1 (ekson 1) jest konstytutywna. Transkrypcja z promotora P1 jest indukowana sygnałami pochodzącymi od
mitogenów, hormonów, układu odpornościowego, a także bodźców stresowych.
W przypadku komórek, które uległy transformacji nowotworowej może być podwyższona przez czynniki transkrypcyjne takie jak: p53, IRF8 (ang. interferon regulatory factor 8), Sp1 czy ETS (ang. E26 transformation-specific). Szereg mikro RNA
(miR) może blokować translację mRNA MDM2 oddziałując z regionem 3’UTR
[90]. Na rysunku kolejne eksony zaznaczono prostokątami. Zmodyfikowano wg
[48].
jego produktem jest forma MDM2 o masie 50 kDa, która nie
posiada domeny wiążącej p53 [7]. W P2 zostało zidentyfikowane miejsce polimorfizmu pojedynczego nukleotydu, SNP
(ang. Single nucleotide polymorphism) skojarzone z podwyższeniem transkrypcji MDM2 i zwiększeniem ryzyka występowania raka. Zamiana T na G w pozycji 309 (SNP309G)
powoduje silniejsze wiązanie czynnika transkrypcyjnego
Sp1 (ang. Transcription factor Sp1) w tym miejscu promotora
i zwiększoną produkcję transkryptu MDM2 [8]. Natomiast
polimorfizm występujący w pozycji 285 (SNP285C) zmniejsza wiązanie Sp1 do promotora i powoduje obniżenie ryzyka wystąpienia trzech głównych rodzajów nowotworów
u kobiet - raka piersi, raka jajnika i raka endometrium [9].
Rycina 2. Funkcje MDM2 związane z aktywnością p53. Poznane funkcje MDM2
są związane z jego oddziaływaniem z białkiem MDMX. Homodimer MDM2 lub
heterodimer MDM2-MDMX ubikwityluje i prowadzi do degradacji w proteasomie białko p53. MDM2 posiada aktywność autoubikwitylacji jak również odpowiada za przyłączenie ubikwityny do MDMX. MDM2 wpływa na transrepresję
genów regulowanych przez p53, nie tylko ubiwitylując ten supresor nowotworów, ale też poprzez bezpośrednie wiązanie się z p53 oraz indukcję ubikwitylacji histonów otaczających region, w którym znajdują się sekwencje elementów
odpowiedzi dla p53. MDM2 jest czynnikiem determinującym opiekuńczą rolę
względem p53 i przyczynia się do translacji mRNA TP53.
Postępy Biochemii 61 (1) 2015
MDM2 jest białkiem, które w komórce odgrywa szereg,
często zupełnie odmiennych ról: I) Jest E3 ligazą ubikwityny, która odpowiada za ubikwitylację i doprowadzenie do
degradacji w proteasomie supresora nowotworów, białka
p53 [10]. II) Poprzez wiązanie się z N-końcową domeną
p53 wpływa na transrepresję genów regulowanych przez to
białko [11]. III) W wyniku stresu genotoksycznego MDM2
zostaje ufosforylowany (S395) i zaczyna oddziaływać z
mRNA TP53 aktywując jego translację [12]. IV) Charakteryzuje się aktywnością podobną do białka opiekuńczego (ang.
chaperone like) względem p53 [13] (Ryc. 2). MDM2 występuje
w komórce w cytoplazmie, jądrze i jąderku [14]. Lokalizacja
komórkowa MDM2 jest regulowana odpowiednio przez sekwencje lokalizacji jądrowej, NLS (ang. nuclear localization
signal), eksportu jądrowego, NES (ang. nuclear export signal)
i lokalizacji jąderkowej, NoLS (ang. nucleolar localization signal) (Ryc. 3). Fosforylacja reszt serynowych 166 i 186 kieruje MDM2 z cytoplazmy do jądra komórkowego [15,16].
Transport z jądra do cytoplazmy i wzmożenie autoubikwitylacji jest powodowane przez związanie C-końcowej domeny RING MDM2 z białkiem adaptorowym 14-3-3σ (ang.
epithelial cell marker protein 1) [17]. Domena RING białka
MDM2 posiada także w swojej sekwencji motyw Walkera
A i motyw pętli P [18], które są charakterystyczne dla białek
wiążących ATP/GTP. MDM2 wiąże nukleotyd wykazując
największe powinowactwo do ATP, jednak nie katalizuje
jego hydrolizy. Mutacja w obrębie pętli P powoduje niezdolność MDM2 do wiązania nukleotydu (MDM2 K454A).
Pokazano, że funkcja wiązania ATP ogrywa istotną rolę w
lokalizacji jąderkowej MDM2 po potraktowaniu komórek
aktynomycyną D [19], jak również, że wiązanie nukleotydu
Rycina 3. Struktura domenowa i modyfikacje potranslacyjne MDM2. Łańcuch
polipeptydowy MDM2 zawiera 491 reszt aminokwasowych ułożonych w ewolucyjnie zachowane domeny. Szereg modyfikacji potranslacyjnych, w tym mające
swój znaczny udział fosforylacje, wpływają na aktywność omawianego białka.
Począwszy od końca aminowego znajdują się: miejsce fosforylacji reszty serynowej (S17) dla kinazy DNA-PKCS (ang. DNA-dependent protein kinase); kieszeń
hydrofobowa (25-100aa) odpowiadająca za wiązanie p53; sygnał lokalizacji jądrowej (179-185aa) oraz sygnał eksportu jądrowego (190-202aa), w obrębie których
znajdują się reszty aminokwasowe fosforylowane przez kinazę AKT (alt. nazwa
PKB, ang. protein kinase B-alpha); miejsce fosforylacji dla kinazy CDK2 (ang. cyclin-dependent kinase inhibitor 2A) [91]; domena kwaśna (243-301aa), a w niej miejsca fosforylacji dla kinazy GSK3 (ang. glycogen synthase kinase-3 alpha) obniżające
zdolność wiązania p53 [92]; kinazy CK1 (ang. casein kinase 1), wpływające na ubikwitylację MDM2 przez SCF(beta-TRCP) (ang. F-box/WD repeat-containing protein
1A) [93]; kinazy CK2 (ang. casein kinase 2) obniżające zdolność wiązania MDM2-p53 [94,95]; motyw palca cynkowego (290-335aa); miejsca fosforylacji dla kinazy
c-ABL (ang. tyrosine-protein kinase ABL1) [96]; miejsca fosforylacji dla ATM (ang.
ataxia telangiectasia mutated); domena RING zlokalizowana na końcu karboksylowym, w obrębie której znajduje się miejsce wiązania dla ATP oraz sygnał lokalizacji jąderkowej. Miejsca fosforylacji oznaczone kolorem zielonym prezentują
wzrost zahamowania aktywności białka p53 zależny od MDM2. Miejsca fosforylacji oznaczone kolorem żółtym prezentują obniżenie zahamowania aktywności
białka p53 zależne od MDM2. Hamowanie oddziaływania MDM2 z p53 oznaczone jest jako OBB (oddziaływanie białko-białko); modulacja stabilności MDM2
oznaczona jest jako S; zamiana statusu oligomeryzacji MDM2 oznaczona jest jako
O; modulacja oligomeryzacji i stabilności oznaczona jest jako O/S. Zmodyfikowano wg [48].
43
jest czynnikiem determinującym opiekuńczą rolę MDM2
względem p53.
SIEĆ ODDZIAŁYWAŃ MDM2
Spośród wszystkich białek oddziałujących z MDM2 tym
najlepiej opisanym jest białko p53. Regulacja oddziaływania
pomiędzy MDM2 i p53 opiera się na pętli sprzężenia zwrotnego. p53 jest czynnikiem transkrypcyjnym indukującym
promotor P2 MDM2. Ponieważ MDM2 hamuje aktywność
p53 powstaje ujemne sprzężenie zwrotne, które w warunkach bezstresowych ściśle reguluje poziom białka p53 [20].
Z drugiej strony niskie stężenie p53 warunkuje utrzymanie podstawowego, niskiego poziomu MDM2. Dodatkowo MDM2 ubikwityluje i prowadzi do degradacji również
sam siebie [21]. W warunkach stresowych, np. w obecności
czynników uszkadzających DNA, następuje stabilizacja i
akumulacja p53 [22]. W wyniku indukcji uszkodzeń DNA
kinaza ATM fosforyluje MDM2 i p53, zapobiegając tworzeniu się kompleksu MDM2-p53, co powoduje zahamowanie
ubikwitylacji p53. Ufosforylowany MDM2 (S395) wiąże się
także do mRNA TP53 i wzmacnia jego translację. Paralogiem MDM2 jest białko MDMX (zwane także MDM4). Podobnie jak MDM2 pełni rolę regulatorową wobec p53, a
zaburzenia w jego funkcjonowaniu są skorelowane z procesem transformacji nowotworowej [23]. MDM2 tworzy zarówno homodimery jak i heterodimery z MDMX [24]. Oba
białka dzielą 50% homologii sekwencji aminokwasowej,
przy czym homologia końca aminowego wiążącego p53
wynosi 70% [25]. MDMX posiada domenę RING jednak nie
ubikwityluje i nie prowadzi do degradacji p53, natomiast
samo jest substratem MDM2 lub, określając to bardziej precyzyjnie, kompleksu MDM2-MDMX, jest ubikwitylowane
i kierowane do proteolizy [26,27] (Ryc. 2). Sugeruje się, że
forma oligomeryzacji MDM2 reguluje stabilność zarówno
MDM2 jak i MDMX, jednak to zagadnienie nie jest jeszcze
w pełni zbadane [28,29]. Dotychczas pokazano, że tworzenie heterodimeru MDM2-MDMX wzmaga aktywność E3
ligazową MDM2 i tym samym przyczynia się do degradacji zarówno p53 jak i MDM2 [30,31]. Wiadomo również, że
fosforylacja katalizowana przez ATM wpływa na deoligomeryzację, destabilizując MDM2 po uszkodzeniu DNA [32].
Dotychczas scharakteryzowano wiele białek wiążących się
do MDM2, jak również opisano funkcje, które są niezależne
od najwnikliwiej zbadanej interakcji: MDM2-p53. Złożona
budowa domenowa pozwala MDM2 oddziaływać nie tylko
z ponad 100 białkami lecz także z nukleotydami. Co ważne,
nie wszystkie białka, które oddziałują z MDM2, są przez nie
ubikwitylowane. Ta właściwość MDM2 plasuje je w gronie
białek węzłowych (ang. hub proteins), czyli posiadających
wiele współoddziałujących partnerów w postaci białek
czy kwasów nukleinowych z różnych obszarów komórki
[33]. Aby pośredniczyć i brać udział w wielu zróżnicowanych oddziaływaniach, białka węzłowe muszą być ściśle
selektywne i precyzyjnie regulowane. Istnieje hipoteza,
że MDM2 można rozpatrywać również w kategorii białka
rusztowania (ang. scaffold protein), czyli takiego, które stanowi punkt wiązania dla białek danej ścieżki sygnałowej.
Interakcje MDM2 z innymi cząsteczkami są determinowane
przez jego lokalizację w komórce, izoformy, w jakich występuje, a także modyfikacje potranslacyjne, które wpływają na
jego konformację (Ryc. 3).
44
AKTYWACJA MDM2 W NOWOTWORACH
Badania nad powstawaniem nowotworów ujawniły, że
zwiększony poziom MDM2 odnajdywany jest w kostniakomięsakach [34], mięsakach oraz rakach płaskonabłonkowych głowy i szyi [35,36]. Wykazano ponadto, że nadprodukcją MDM2 charakteryzują się raczej guzy metastatyczne
i nawracające niż pierwotne [37]. Badania na niedrobnokomórkowym raku płuca, NSCLC (ang. non-small-cell lung carcinoma) ujawniły, że amplifikacja MDM2 jest złym prognostykiem dla chorych [38]. Spośród przeanalizowanych 28
typów nowotworów amplifikacją MDM2 charakteryzowało
się średnio 7% z nich, z czego największy udział, 20%, przypadał na nowotwory tkanek miękkich. W tej samej analizie
wykazano, że w 29 na 33 przypadki badanych nowotworów
charakteryzujących się amplifikacją MDM2, występowała
niezmieniona forma genu TP53 [39]. Podwyższenie stężenia
MDM2 w komórkach nowotworowych w wielu przypadkach wywołane może być przez czynniki niezależne od p53.
Już pierwsze badania pokazały, że niezależnie od statusu
p53, podwyższony poziom MDM2 w gruczole piersiowym
prowadził do niestabilności genetycznej i rozwoju nowotworu [40]. Wykazano, że doksorubicyna, antybiotyk stosowany przy leczeniu niektórych rodzajów nowotworów,
obniża poziom zarówno mRNA MDM2 jak i białka MDM2
niezależnie od tego, w jakiej formie występuje p53, zmienionej lub niezmienionej [41]. W badaniach nad rolą estrogenów w kontroli białek, niezależnej od p53, związanych z
regulacją cyklu komórkowego komórek raka piersi wykazano, że w promotorze P2 MDM2 znajduje się sekwencja
elementu odpowiedzi na receptor ERα (ang. estrogen receptor α). Autorzy badania postulują, że najprawdopodobniej
niezależna od p53 transkrypcja MDM2, w komórkach raka
piersi zależnych od estrogenu, promuje wykluczenie działania niezmienionej formy p53 w jądrze i może prowadzić do
obejścia punktów kontrolnych cyklu komórkowego G1/S
oraz G2/M [42]. Z kolei doświadczenia na transgenicznych myszach nie posiadających p53, badające tzw. jałowy
naciek, połączyły aktywność Mdm2 i gojenie się nabłonka
występujące w poudarowym, ostrym niedokrwieniu nerek.
Pokazano, że jałowy naciek został znacznie wytłumiony po
zablokowaniu Mdm2 jego inhibitorem nutliną-3A. Blokada Mdm2 osłabiła poniedokrwienną indukcję czynników
prozapalnych takich jak cytokiny i chemokiny, jak również
następujące po tym rekrutowanie leukocytów do miejsca
uszkodzenia tkanki. Pokazano, że Mdm2 działa jako kofaktor białka NFκB (ang. nuclear factor NF-kappa-B); wiążąc się
do sekwencji miejsc odpowiedzi dla tego czynnika transkrypcyjnego promuje powstawanie mRNA elementów prozapalnych zależnych od NFκB [43,44]. Warto także nadmienić, że w ostatnich badaniach nad mysim modelem gruczolakoraka trzustki otrzymano pozytywne wyniki działania
inhibitorów Mdm2 skojarzonych z inhibitorami topoizomerazy II na niektóre grupy komórek rakowych, niezależnie
od statusu p53 [45]. Wielokierunkowe działanie MDM2,
złożoność budowy i mnogość białek z jakimi wchodzi ono
w interakcje daje szerokie pole do analizy funkcjonowania
tego białka i jego zaangażowania w mechanizm transformacji nowotworowej. Tło genetyczne, na jakim manifestuje
się ekspresja MDM2 jest niezwykle istotnym czynnikiem
w analizie problemu. Transgeniczne myszy nie posiadające p53 rozwijają spektrum nowotworów inne niż zwierzęwww.postepybiochemii.pl
ta, które dodatkowo wykazują zwiększony poziom Mdm2
[46]. Istotny wkład w problematykę zagadnienia mają badania, które wyraźnie pokazują, że efekt działania MDM2 manifestuje się różnie w zależności od tkanki i typu komórek
[47]. Guzy, w których odnaleziono podwyższony poziom
MDM2 i/lub MDMX charakteryzują się niższą aktywnością
p53, lecz niektóre z nich mają jednocześnie podwyższony
poziom MDM2 i/lub MDMX i nieaktywny gen TP53 [48].
MDM2 JAKO BIAŁKO O WŁAŚCIWOŚCIACH
ONKOGENNYCH I SUPRESORA
TRANSFORMACJI NOWOTWOROWEJ
Identyfikacja mechanizmów molekularnych przyczyniających się do powstawania nowotworów jest drogą wyjścia
do projektowania nowych leków, terapii, ale też profilaktyki przeciwnowotworowej. Cały czas żywa jest dyskusja zagadnienia podwójnej roli MDM2: jako białka onkogennego
lub supresora nowotworów [49]. MDM2 z jednej strony zachowuje się jak białko onkogenne stymulujące transformację nowotworową, moduluje aktywność supresora nowotworów p53 (inaktywuje i degraduje p53). Co istotne, działa
jako białko onkogenne także w reakcjach niezależnych od
p53: wzmaga translację czynnika antyapoptotycznego XIAP
(ang. X-linked inhibitor of apoptosis protein), stymulując w ten
sposób przeżywalność komórek nowotworowych; promuje
translację onkogenu MYCN (ang. N-myc proto-oncogene protein) [50]; ubikwityluje i prowadzi do degradacji, między
innymi, czynnik FOXO3A (ang. Forkhead box protein O3),
co prowadzi do pozytywnej kontroli cyklu komórkowego
[51]; hamuje aktywność supresora nowotworów pRB (ang.
retinoblastoma-associated protein) [52], uniemożliwiając w ten
sposób zajście apoptozy; stymuluje angiogenezę, aktywuje
NFκB i hamuje naprawę DNA, zwiększając niestabilność genetyczną komórki. Z drugiej strony MDM2 działa także jako
supresor nowotworów - utrata aktywności MDM2 powoduje podwyższenie ekspresji zmutowanych TP53, których
produkty białkowe, jeśli nie są degradowane z udziałem
MDM2, nabywają aktywności onkogennych; wspomagając
export z jądra umożliwia apoptozę prowadzącą przez szlak
mitochondrialny zależny od p53; po uszkodzeniu DNA stymuluje translację mRNA TP53 oraz fałdowanie powstającego łańcucha polipeptydowego p53 do jego natywnej formy.
Reasumując, MDM2 modulując aktywność supresorów nowotworowych oraz onkogenów wpływa na transformację
nowotworową, a część z tych reakcji jest niezależna od klasycznego oddziaływania MDM2 z p53 (Ryc. 4).
staje zdefosforylowana [53], a koniec karboksylowy ulega
fosforylacji przez kinazy c-Abl oraz ATM, co wpływa na
deoligomeryzację i destabilizację MDM2 [54,55]. W komórkach prawidłowych szereg modyfikacji potranslacyjnych
zarówno MDM2 jak i p53, które pojawiają się po uszkodzeniu DNA ma na celu zdestabilizowanie wiązania MDM2-p53 poprzez zmianę konformacji obu białek. Fosforylacja
p53 zapobiega jego degradacji oraz uruchamia jego aktywność transkrypcyjną. Komórki nowotworowe charakteryzują się dużą niestabilnością genomową/chromosomową.
Rozwój nowotworu, porównywany jest do ewolucyjnego
mechanizmu doboru naturalnego. Komórki, które ulegają
transformacji, dzięki niestabilności informacji genetycznej,
mają szanse na dostosowanie się do zmieniających się warunków otoczenia, na przykład niedoboru tlenu czy glukozy. Ta selekcja komórek, które są w stanie dostosować się
do nowych warunków otoczenia zależna jest nie tylko od
częstości mutacji, ale także od systemu naprawy DNA. W
skrajnych przypadkach zbyt duża częstość mutacji i niewydajna ich naprawa może spowodować apoptozę lub nekrozę komórek nowotworowych. Udział MDM2 w procesie
transformacji zazwyczaj kojarzony jest z jego aktywnością
jako E3 ligazy w stosunku do p53. Pokazano jednak również w licznych pracach [56-58], że MDM2 niezależnie od
p53 i od swojej aktywności E3 ligazy może prowadzić do
rozwoju nowotworu. Doświadczenia przeprowadzone na
mysich fibroblastach zarodkowych, MEF (ang. mouse embryonic fibroblasts), które nie posiadają p53, pokazały, że nadprodukcja białka MDM2 powoduje spontaniczne złamania
chromatyd i chromosomów, jak również opóźnia naprawę
DNA [59]. Taka właściwość MDM2 objawiająca się w komórkach może być bezpośrednią przyczyną transformacji
nowotworowej. Obserwowana zwłoka w naprawie DNA
komórek prawidłowych nadprodukujących MDM2 może
mieć źródło w opóźnieniu fosforylacji cząsteczek zaangażowanych we wczesną odpowiedź na uszkodzenia materiału
genetycznego [60]. Podobne wyniki, jakie opisano powyżej
uzyskano także z doświadczeń wykonanych z wykorzystaniem tych samych komórek (MEF) nadprodukujących
MDMX. Autorzy obu badań wnioskują, że regulacja na-
UDZIAŁ MDM2 W PROCESACH
ZWIĄZANYCH Z NAPRAWĄ DNA
Nienaprawiony materiał genetyczny komórki może prowadzić do nagromadzenia mutacji, a w konsekwencji do
chorób genetycznych (jeśli mutacje są pierwotne) lub nowotworów. Uszkodzony w czasie chemioterapii DNA może
również stać się przyczyną śmierci komórki nowotworowej.
Rozmaite czynniki pochodzące z wnętrza komórki, które
można uznać za fizjologiczne lub przypadkowe, wynikające ze środowiska zewnętrznego mogą przyczynić się do
zmian naruszających integralność DNA. Wiadomo, że na
skutek indukcji pęknięć DNA, powstałych w wyniku chemioterapii czy napromienienia, domena kwaśna MDM2 zoPostępy Biochemii 61 (1) 2015
Rycina 4. MDM2 moduluje procesy związane z transformacją nowotworową.
DNA Polε (ang. DNA polymerase epsilon) – polimeraza DNA ε; NBN – nibryna;
NBN/NBS1 (NBS1, ang. Nijmegen breakage syndrome protein 1); E2F1 (alternatywna nazwa RBAP-1, ang. retinoblastoma-associated protein 1) – czynnik transkrypcyjny; p21 (alt. nazwa WAF1, ang. wild type p53-activated fragment 1) – inhibitor
kinaz zależnych od cyklin; pRB – supresor nowotworów; FOXO3A – czynnik
transkrypcyjny; ECDH (ang. epithelial cadherin, e-cadherin) – E-kadheryna, białko
adhezyjne; VEGF (ang. vascular endothelial growth factor) – czynnik wzrostu; XIAP
– inhibitor kaspaz; NFκB – czynnik transkrypcyjny. Zmodyfikowano wg [97].
45
prawy DNA jest zachowaną ewolucyjnie funkcją członków
rodziny białek MDM [61]. Doświadczenia przeprowadzone
w naszym laboratorium potwierdzają te obserwacje, że w
komórkach MEF podwyższona produkcja białka MDM2
przyczynia się do powstawania większej liczby pęknięć
i złamań chromatyd. Co ciekawe, w przypadku zastosowania produktu białkowego zmutowanej formy MDM2,
nie wiążącego ATP (MDM2 K454A), spontaniczne uszkodzenia chromosomów występują z niższą częstotliwością,
zbliżoną do wartości kontrolnej. Sytuacja zupełnie inaczej
wygląda w ludzkich, nowotworowych komórkach niedrobnokomórkowego raka płuca (linia komórkowa H1299). O
ile samych uszkodzeń jest relatywnie więcej, to ani MDM2
ani jego zmieniona forma nie wiążąca ATP (MDM2 K454A)
nie powodują zwiększenia liczby obserwowanych złamań i
pęknięć chromatyd i chromosomów. Nadprodukcja MDM2
(lub MDM2 K454A) w linii H1299 ukazała nam interesujący
fenotyp - niezdolność wiązania ATP przez MDM2 obniża
wydajność, spowalnia w czasie naprawę DNA i negatywnie wpływa na przeżywalność komórek nowotworowych.
Zgłębiając to zagadnienie zauważyliśmy również, że wiązanie ATP przez MDM2 wpływa na obniżenie jego stabilności
po zaindukowaniu pęknięć obu nici DNA. Z naszych badań
wynika, że w komórkach nowotworowych przyłączanie
nukleotydu do MDM2 odgrywa niebagatelną rolę w procesie naprawy DNA zachodzącej dzięki/z udziałem homologicznej rekombinacji. Wyniki te po raz kolejny sugerują, że
nadprodukcja MDM2 w komórkach może mieć różne oblicza i działać jak miecz obosieczny, w przypadku komórek
prawidłowych MDM2, hamując naprawę DNA, stymuluje
niestabilność genetyczną niezbędną do transformacji nowotworowej. W przypadku komórek, które już uległy transformacji nadprodukcja MDM2 promuje naprawę zaindukowanych uszkodzeń DNA, przyczyniając się do przeżywalności
komórek nowotworowych i nabywania przez nie oporności
na działanie chemioterapeutyków uszkadzających DNA.
NAPRAWA DWUNICIOWYCH PĘKNIĘĆ DNA
Dwuniciowe pęknięcia DNA (DSB, ang. DNA double-strand breaks) są szczególnie niebezpieczne dla komórki.
Brak jest nici, która mogłaby służyć jako matryca do syntezy DNA. DSB prowadzą do zahamowania replikacji i mogą
przyczynić się do utraty dłuższych fragmentów nici DNA.
Dwuniciowe pęknięcia mogą być reperowane za pomocą
rekombinacji homologicznej (HR, ang. homologous recombination) zwanej też naprawą rekombinacyjną, niehomologicznego łączenia końców (NHEJ, ang. non-homologous end
joining) oraz dopasowania pojedynczych nici (SSA, ang. single strand annealing). SSA zachodzi w miejscach sekwencji
powtarzalnych (repetytywnych) i wymaga udziału białka
RAD52 (ang. DNA repair protein RAD52 homolog) oraz kompleksu nukleolitycznego XPF/ERCC1 (ang. Xeroderma pigmentosum group F-complementing protein i ang. excision repair
cross-complementation group 1) [62]. W odpowiedzi na uszkodzenie DSB aktywacji ulegają białka z grupy kinaz skorelowanych z kinazami fosfatydyloinozytolu-3 (PIKK, ang.
phosphatidylinositol-3 kinase-like family) - ATM, ATR i DNA-PKCS oraz białka z rodziny polimeraz poli(ADP-ryboza),
PARP (ang. poly(ADP-ribose) polymerase). ATM i ATR biorą
udział między innymi w naprawie HR i NHEJ, stabilizują
również widełki replikacyjne w trakcie replikacji [63]. p53
46
warunkuje zatrzymanie cyklu komórkowego, apoptozę lub
starzenie się komórki [64]. Głównym czynnikiem wpływającym na wybór ścieżki naprawy jest zasięg, w jakim końce
DNA w miejscu uszkodzenia ulegną wstępnemu wycięciu
(resekcji). Klasyczny NHEJ może przebiegać bez wycięcia
nukleotydów w miejscu pęknięcia, natomiast HR i szereg
modyfikacji tych napraw wymagają resekcji [65]. Cztery,
częściowo niezależne kompleksy sensorowe biorą udział w
wymienionych wyżej naprawach: MRN (MRE11-RAD50-NBS1; ang. meiotic recombination 11 – ang. DNA repair protein
RAD50 – ang. Nijmegen breakage syndrome protein 1), heterodimer złożony z białka Ku70 (alt. nazwa XRCC6, ang. X-ray
repair cross-complementing protein 6) oraz białka Ku80 (alt.
nazwa XRCC5, ang. X-ray repair cross-complementing protein
5), PARP (ang. poly(ADP-ribose) polymerase) i RPA (ang. replication protein A 32 kDa subunit). Składowe kompleksu MRN
są fosforylowane przez kinazę ATM, co prowadzi do aktywacji odpowiedzi na uszkodzenia DNA i tworzy dodatnią
pętlę sprzężenia zwrotnego, która podtrzymuje aktywność
samego ATM [66,67]. Udział MDM2 w zaobserwowanej indukcji niestabilności genomowej jest ściśle sprzężony z wiązaniem i osłabianiem aktywności białka NBN (NBS1, ang.
Nijmegen breakage syndrome protein 1) z kompleksu MRN
przez MDM2 [68]. Pokazano, że podwyższony poziom
MDM2 w komórkach MEF, który hamuje NBN prowadzi
do większej liczby złamań chromosomów i opóźnienia naprawy DNA [59]. Porządek w wyborze sposobu naprawy
pęknięć dwuniciowych DNA jest możliwy dzięki negatywnej kontroli jednego szlaku naprawy przez drugi. Istotnym
aspektem w regulacji tych procesów jest acetylacja białka
CTIP (ang. CtBP-interacting protein), aktywatora resekcji i
białka współoddziałującego z BRCA1 (ang. breast cancer
type 1) oraz kompleksu MRN, który to tworzy się na DSB
niezależnie od sposobu naprawy DSB. W trakcie trwania
fazy G1 cyklu komórkowego, acetylacja CTIP ma charakter
konstytutywny i utrzymuje to białko w stanie nieaktywnym (Ryc. 5). Dodatkowo 53BP1 (ang. p53-binding Protein 1)
i oddziałujące z nim białko biorące udział w kontroli cyklu
komórkowego RIF1 (ang. telomere-associated protein RIF1)
zapobiegają wiązaniu CTIP i BRCA1, promując naprawę
NHEJ [69]. W momencie wejścia komórki w fazę S deacetylaza SIRT6 (ang. NAD-dependent protein deacetylase sirtuin-6)
usuwa grupę acetylową z CTIP aktywując tę endonukleazę
Rycina 5. Regulacja wyboru drogi naprawy. Kompleks MRN (składający się z
białek MRE11, RAD50 oraz NBN) tworzy się w miejscach DSB niezależnie od
tego czy dojdzie do naprawy HR czy NHEJ. W fazie G1 białko CTIP pozostaje w formie zacetylowanej, co hamuje jego aktywność endonukleolityczną. Dodatkowo oddziałujące ze sobą 53BP1 oraz białko RIF1 zapobiegają przyłączeniu
BRCA1 do CTIP i hamują możliwość rozpoczęcia naprawy drogą rekombinacji
homologicznej, promując niehomologiczne łączenie zakończeń. W fazie S/G2
deacetylaza SIRT6 katalizuje odłączenie grupy acetylowej od CTIP, możliwe jest
wtedy związanie BRCA1, zainicjowanie resekcji oraz przeprowadzenie naprawy
HR. Hamujący wpływ MDM2 na NBN z kompleksu MRN może przyczyniać się
do zaburzenia regulacji wyboru drogi naprawy. Zmodyfikowano wg [98].
www.postepybiochemii.pl
i przyczynia się do promocji resekcji, a co za tym idzie naprawy HR (Ryc. 5) [70].
REKOMBINACJA HOMOLOGICZNA
Naprawa poprzez rekombinację homologiczną zachodzi po replikacji, w trakcie
późnej fazy S. Po uformowaniu się chromatyny, siostrzana chromatyda z drugiego chromosomu może służyć jako matryca
do przeprowadzenia dokładnej naprawy
[71]. MDM2 wiążąc się do NBN może modulować szybkość z jaką zachodzi naprawa DNA, przy czym nie jest to związane
z aktywnością MDM2 jako E3 ligazy [59].
Dobrze poznane etapy naprawy poprzez
HR obejmują (Ryc. 6): I) Utworzenie fragmentów jednoniciowych po stronie 3’ w
miejscu podwójnego pęknięcia; jest to warunek konieczny, aby mogła zajść inwazja
nici homologicznej i utworzenie heterodupleksu DNA. Wolne końce 3’ są generowane na każdej z obu nici DNA. Proces
przebiega dwuetapowo [72]. Pierwszy
etap - inicjacji angażuje endonukleazę
CTIP oddziałującą z BRCA1 oraz białko
MRE11, charakteryzujące się aktywnością
endo- i egzonukleazową, znajdujące się w
kompleksie MRN. Wycięcie nukleotydów
w obszarze pęknięcia ma miejsce w późnej
fazie S, kiedy są już uformowane siostrzane chromatydy i zachodzi możliwość rekombinacji. Drugi etap - elongacji zachodzi przy udziale kompleksu BLM złożonego z helikazy BLM (ang. Bloom syndrome
protein), topoizomerazy Top3α (ang. DNA
topoisomerase 3-alpha), białek RMI1 (ang.
RecQ-mediated genome instability protein 1)
i RMI2 (ang. RecQ-mediated genome instability protein 2) oraz egzonukleazy EXO1
(ang. exonuclease 1), które kontynuują resekcję [73] (Ryc. 6). II) Opłaszczenie jednoniciowych końców 3’ przez białko RPA.
Przeprowadzenie wymiany pojedynczych
nici DNA wymaga złożenia, rearanżacji,
a następnie rozłożenia filamentów białka
RAD51 (ang. DNA repair protein RAD51
homolog 1). Najprawdopodobniej RAD51
nie jest w stanie wejść w oddziaływanie
z pojedynczą nicią DNA, dlatego jednoniciowe końce DNA zostają opłaszczone
przez białko RPA [74] (Ryc. 6). Dotychczas
proces ten zbadano i przedstawiono na
odpowiednikach bakteryjnych, ale można
przypuszczać, że u organizmów wyższych
dzieje się podobnie [75]. III) Zastąpienie
RPA przez RAD51 w celu utworzenia filamentu nukleoproteinowego. RAD51
przy udziale białka BRCA2 (ang. breast
cancer type 2) oddziałuje z jednoniciowym
DNA. W procesie zależnym od hydrolizy
ATP zostają utworzone nukleofilamenty
Postępy Biochemii 61 (1) 2015
złożone z jednoniciowego DNA (ang. single-strand DNA,
ssDNA) i RAD51 [76]. IV) Utworzenie heterodupleksu
DNA i struktury Hollidaya (ang. Holliday Junction, HJ). Rearanżacja przestrzenna RAD51 związanego z DNA i BRCA2
umożliwia wymianę nici między siostrzanymi chromatyda-
Rycina 6. Naprawa dwuniciowych pęknięć DNA. W zależności od początkowego zaawansowania wycięcia
nukleotydów (lub jego braku) DSB mogą zostać naprawione na jeden z trzech sposobów. 1. NHEJ: Związanie
Ku70/80 promuje naprawę NHEJ przyłączając kinazę DNA-PKCS. MDM2 może ubikwitylować i obniżać poziom podjednostki Ku70. DNA-PKCS fosforyluje MDM2 i umożliwia zahamowanie cyklu komórkowego w celu
naprawy DNA. Fosforylacje przeprowadzane przez DNA-PKCS aktywują kompleks endo/egzonukleolityczny
ARTEMIS. Autofosforylacja DNA-PKCS zapobiega nadmiernej obróbce końców DNA przez ARTEMIS. Końcowym etapem jest ligacja końców DNA. 2. HR: W początkowych etapach naprawy DSB białko PARP konkuruje
z Ku70/80 o dostęp do zakończeń DNA. MDM2 oddziałuje z NBN z kompleksu MRN hamując jego aktywność
w procesie naprawy. Wstępna resekcja przebiega przy udziale białka CTIP oraz BRCA1. Dalsze wycinanie
nukleotydów i opłaszczenie wolnych końców 3’ DNA przez białko RPA jest promowane przez EXO1 i BLM.
Kinaza ATM pełni kluczową rolę w fosforylacji elementów składowych kaskady naprawy HR. Wymiana RPA
na RAD51 przy udziale BRCA2 powoduje utworzenie nukleofilamentów i inwazję nici na sekwencję homologiczną. Może dojść do cięcia przy pomocy kompleksu MUS81/EME1 lub utworzenia HJ. HJ może zostać
przecięte w sposób umożliwiający powstanie rekombinantu lub heterodupleksu, dzieje się to przy udziale
kompleksu białek MUS81/EME1, które łączą się z SLX1/SLX4 i nukleazą GEN1. HJ może także ulec rozpleceniu przy pomocy kompleksu BLM/TOPOIIIa. 3. SSA: jednoniciowe fragmenty 3’ są tworzone bezpośrednio
w sąsiedztwie pęknięcia nici DNA. RAD52 katalizuje reakcję łączenia końców 3’ DNA, kompleks XPF/ERCC1
usuwa wolne końce DNA. Zmodyfikowano wg [99].
47
mi i utworzenie heterodupleksu DNA [77] (Ryc. 6). Uważa
się, że BRCA2 oddziałuje z RAD51 promując powstawanie
filamentów RAD51 raczej z ssDNA niż z dwuniciowym
DNA (ang. double-strand DNA, dsDNA) [78]. V) Migracja
rozgałęzienia wzdłuż nici DNA. W procesie migracji rozgałęzienia DNA biorą udział helikazy z rodziny RecQ: BLM,
RECQ1 (ang. ATP-dependent DNA helicase Q1), RECQ5 (ang.
ATP-dependent DNA helicase Q5) i RAD54 (ang. DNA repair
and recombination protein RAD54-like) [79]. VI) Uwolnienie
naprawionego DNA. Naprawiony DNA może zostać uwolniony ze struktury Hollidaya na trzy sposoby. Pierwszy
z nich zakłada rozplecenie nici naprawionego DNA i powstanie heterodupleksu, co oznacza, że DNA siostrzanych
chromatyd nie zostało wymienione, a jedynie użyte jako
matryca do naprawy. Dzieje się to przy udziale topoizomerazy IIIa, RMI1 i RMI2. Druga i trzecia możliwość obejmują
przecięcie nici DNA i powstanie rekombinantu lub heterodupleksu, zależnie od orientacji cięcia nukleolitycznego.
Endonukleaza GEN1 (ang. flap endonuclease GEN homolog 1)
przeprowadza symetryczne cięcie w obu niciach u podstawy HJ. Takie cięcie może być przeprowadzone również
przez endonukleolityczny heterodimer MUS81-EME1 (ang.
crossover junction endonuclease MUS81 i ang. crossover junction endonuclease EME1). Białko SLX4 (ang. structure-specific
endonuclease subunit SLX4) sprawuje funkcję rusztowania
dla aktywnych endonukleaz [80] (Ryc. 6). Pokazano, że inhibitory MDM2 mogą wpływać na spowolnienie naprawy
HR działając stymulująco na p53 [81].
NIEHOMOLOGICZNE ŁĄCZENIE KOŃCÓW DNA
Niehomologiczne łączenie końców jest naprawą, która zachodzi w komórce w czasie trwania całego cyklu komórkowego, przy czym szczególne znaczenie ma w fazie
G1. Jest to główny rodzaj naprawy pęknięć dwuniciowych
DNA [82]. Kluczowymi elementami biorącymi udział w naprawie NHEJ są: heterodimer Ku70/80, podjednostka katalityczna kinazy białkowej zależnej od DNA - DNA-PKCS,
egzo- i endonukleazowy kompleks ARTEMIS/DCLRE1C
(ang. DNA cross-link repair 1C protein), białko XRCC4 (ang.
X-ray repair cross-complementing protein 4), ligaza DNA IV
oraz czynnik XLF (ang. XRCC4-like factor; alt. nazwa: Cernnunos). Proces naprawy zachodzi w trzech etapach (Ryc. 6):
I) Rozpoznanie dwuniciowego pęknięcia DNA. Ku70/80,
toroidalny heterodimer o aktywności helikazy rozpoznaje miejsce DSB, częściowo zabezpiecza wolne końce DNA
oraz rekrutuje do miejsca uszkodzenia kinazę serynowo-treoninową DNA-PKCS. DNA-PKCS wpływa na wewnętrzną translokację Ku70/80 i swoje umiejscowienie na końcach
przeciętych nici [83]. Pokazano, że DNA-PKcs fosforylując
MDM2 (S17) osłabia wiązanie MDM2-p53 i umożliwia zahamowanie cyklu komórkowego [84]. II) Obróbka niesparowanych końców DNA. W miejscu uszkodzenia formuje się
holoenzym DNA-PKCS. Oddziaływanie pomiędzy dwoma
cząsteczkami DNA-PKCS znajdującymi się na sąsiadujących
ze sobą niciach stymuluje ich aktywność kinazową, tworzy
się kompleks synaptyczny, który na zasadzie pomostu tymczasowo łączy obie nici [85]. Dochodzi do autofosforylacji,
a następie do dysocjacji DNA-PKCS. DNA-PKCS fosforyluje
Ku70/80 pobudzając jej aktywność helikazową. Ku70/80
rozplata końce DNA w miejscu uszkodzenia. Do miejsca
naprawy rekrutowana jest endonukleaza ARTEMIS, kon-
48
trolowana przez kinazę ATM. Grupa ARTEMIS/DNA-PKCS
ma możliwość nukleolitycznego cięcia i usuwania różnego
typu wolnych końców DNA powstałych w miejscu DSB
[86]. Kinaza/fosfataza polinukleotydowa PNKP (ang. polynucleotide kinase/phospatase), która oddziałuje z białkiem
XRCC4 usuwa grupę fosforanową z końca 3’ jak również
dodaje ją do końca 5’, aby umożliwić ligację [87]. III) Ligacja.
Łączenie wolnych końców DNA przeprowadza ligaza DNA
IV w kompleksie z XRCC4. Czynnik XLF stymuluje zarówno kompleks XRCC4/ligaza DNA IV jak i samo XRCC4 w
wydajnym łączeniu końców DNA [88] (Ryc. 6). Elastyczność z jaką mogą działać nukleaza, polimerazy i ligaza naprawy NHEJ sprawia, że ostateczny wynik naprawy DNA
może być zróżnicowany mimo, że początkowy uszkodzony materiał był taki sam. Ku70 wiąże i hamuje aktywność
białka BAX (ang. Bcl-2-asocciated X protein). Dowiedziono,
że MDM2 ubikwityluje Ku70 obniżając jego poziom. Autorzy badania sugerują, że ubikwitylacja Ku70 przez MDM2
może spełniać funkcję przełącznika i być elementem regulacji w procesie prowadzącym do apoptozy po uszkodzeniu
DNA [89].
PODSUMOWANIE
MDM2 jest wielofunkcyjnym białkiem węzłowym zaangażowanym w szereg procesów zachodzących w komórce
w tym także naprawę DNA. Pokazano, że MDM2 ulega deregulacji w wielu przypadkach nowotworów i działa jako
białko onkogenne zarówno hamując p53 jak i funkcjonując
niezależnie od niego. Kluczowe dla zrozumienia procesu
transformacji i rozwoju nowotworu jest poznanie mechanizmów modulujących naprawę DNA. Jednym z czynników,
który może wpływać na te procesy jest MDM2, białko którego poziom jest wyraźnie podwyższony w przypadku wielu
nowotworów. Choć pokazano związek MDM2 z uszkodzeniami i naprawą DSB, jego udział w tych procesach nie jest
jeszcze do końca poznany i stanowi interesujące zagadnienie do przyszłych badań np. nad rolą MDM2 w szlaku SSA.
PIŚMIENNICTWO
1. Cahilly-Snyder L, Yang-Feng T, Francke U, George DL (1987) Molecular analysis and chromosomal mapping of amplified genes isolated
from a transformed mouse 3T3 cell line. Somat Cell Mol Genet 13: 235244
2. Lane DP, Cheok CF, Brown C, Madhumalar A, Ghadessy FJ, Verma C
(2010) Mdm2 and p53 are highly conserved from placozoans to man.
Cell Cycle 9: 540-547
3. Momand J, Villegas A, Belyi VA (2011) The evolution of MDM2 family
genes. Gene 486: 23-30
4. Montes de Oca Luna R, Wagner DS, Lozano G (1995) Rescue of early
embryonic lethality in mdm2-deficient mice by deletion of p53. Nature
378: 203-206
5. Mendrysa SM, McElwee MK, Michalowski J, O’Leary KA, Young KM,
Perry ME (2003) mdm2 Is critical for inhibition of p53 during lymphopoiesis and the response to ionizing irradiation. Mol Cell Biol 23: 462472
6. Liang H, Atkins H, Abdel-Fattah R, Jones SN, Lunec J (2004) Genomic
organisation of the human MDM2 oncogene and relationship to its alternatively spliced mRNAs. Gene 338: 217-223
7. Zauberman A, Flusberg D, Haupt Y, Barak Y, Oren M (1995) A functional p53-responsive intronic promoter is contained within the human
mdm2 gene. Nucleic Acids Res 23: 2584-2592
www.postepybiochemii.pl
8. Bond GL, Menin C, Bertorelle R, Alhopuro P, Aaltonen LA, Levine
AJ (2006) MDM2 SNP309 accelerates colorectal tumour formation in
women. J Med Genet 43: 950-952
31.Linares LK, Hengstermann A, Ciechanover A, Muller S, Scheffner M
(2003) HdmX stimulates Hdm2-mediated ubiquitination and degradation of p53. Proc Natl Acad Sci USA 100: 12009-12014
9. Knappskog S, Lonning PE (2012) Effects of the MDM2 promoter
SNP285 and SNP309 on Sp1 transcription factor binding and cancer
risk. Transcription 2: 207-210
32.Cheng Q, Chen L, Li Z, Lane WS, Chen J (2009) ATM activates p53 by
regulating MDM2 oligomerization and E3 processivity. EMBO J 28:
3857-3867
10.Kubbutat MH, Jones SN, Vousden KH (1997) Regulation of p53 stability by Mdm2. Nature 387: 299-303
33.Fahraeus R, Olivares-Illana V (2013) MDM2’s social network. Oncogene 33: 4365-4376
11.Thut CJ, Goodrich JA, Tjian R (1997) Repression of p53-mediated
transcription by MDM2: a dual mechanism. Genes Dev 11: 1974-1986
34.Oliner JD, Kinzler KW, Meltzer PS, George DL, Vogelstein B (1992)
Amplification of a gene encoding a p53-associated protein in human
sarcomas. Nature 358: 80-83
12.Gajjar M, Candeias MM, Malbert-Colas L, Mazars A, Fujita J, Olivares-Illana V, Fahraeus R (2012) The p53 mRNA-Mdm2 interaction
controls Mdm2 nuclear trafficking and is required for p53 activation
following DNA damage. Cancer Cell 21: 25-35
13.Wawrzynow B, Zylicz A, Wallace M, Hupp T, Zylicz M (2007) MDM2
chaperones the p53 tumor suppressor. J Biol Chem 282: 32603-32612
14.Tang J, Qu LK, Zhang J, Wang W, Michaelson JS, Degenhardt YY, El-Deiry WS, Yang X (2006) Critical role for Daxx in regulating Mdm2.
Nat Cell Biol 8: 855-862
15.Milne D, Kampanis P, Nicol S, Dias S, Campbell DG, Fuller-Pace F,
Meek D (2004) A novel site of AKT-mediated phosphorylation in the
human MDM2 onco-protein. FEBS Lett 577: 270-276
16.Zhou BP, Liao Y, Xia W, Zou Y, Spohn B, Hung MC (2001) HER-2/
neu induces p53 ubiquitination via Akt-mediated MDM2 phosphorylation. Nat Cell Biol 3: 973-982
17.Yang HY, Wen YY, Lin YI, Pham L, Su CH, Yang H, Chen J, Lee
MH (2007) Roles for negative cell regulator 14-3-3sigma in control of
MDM2 activities. Oncogene 26: 7355-7362
18.Walker JE, Saraste M, Runswick MJ, Gay NJ (1982) Distantly related
sequences in the alpha- and beta-subunits of ATP synthase, myosin,
kinases and other ATP-requiring enzymes and a common nucleotide
binding fold. EMBO J 1: 945-951
19.Poyurovsky MV, Jacq X, Ma C, Karni-Schmidt O, Parker PJ, Chalfie
M, Manley JL, Prives C (2003) Nucleotide binding by the Mdm2 RING
domain facilitates Arf-independent Mdm2 nucleolar localization. Mol
Cell 12: 875-887
20.Barak Y, Gottlieb E, Juven-Gershon T, Oren M (1994) Regulation of
mdm2 expression by p53: alternative promoters produce transcripts
with nonidentical translation potential. Genes Dev 8: 1739-1749
21.Fang S, Jensen JP, Ludwig RL, Vousden KH, Weissman AM (2000)
Mdm2 is a RING finger-dependent ubiquitin protein ligase for itself
and p53. J Biol Chem 275: 8945-8951
22.Meek DW (2004) The p53 response to DNA damage. DNA Repair
(Amst) 3: 1049-1056
23.Eischen CM, Lozano G (2014) The Mdm Network and Its Regulation
of p53 Activities: A Rheostat of Cancer Risk. Hum Mutat 35: 728-737
24.Linke K, Mace PD, Smith CA, Vaux DL, Silke J, Day CL (2008) Structure of the MDM2/MDMX RING domain heterodimer reveals dimerization is required for their ubiquitylation in trans. Cell Death Differ
15: 841-848
25.Giglio S, Mancini F, Gentiletti F, Sparaco G, Felicioni L, Barassi F,
Martella C, Prodosmo A, Iacovelli S, Buttitta F, Farsetti A, Soddu S,
Marchetti A, Sacchi A, Pontecorvi A, Moretti F (2005) Identification of
an aberrantly spliced form of HDMX in human tumors: a new mechanism for HDM2 stabilization. Cancer Res 65: 9687-9694
26.Kawai H, Wiederschain D, Kitao H, Stuart J, Tsai KK, Yuan ZM (2003)
DNA damage-induced MDMX degradation is mediated by MDM2. J
Biol Chem 278: 45946-45953
27.Pan Y, Chen J (2003) MDM2 promotes ubiquitination and degradation
of MDMX. Mol Cell Biol 23: 5113-5121
28.Marine JC (2011) MDM2 and MDMX in cancer and development. Curr
Top Dev Biol 94: 45-75
29.Wade M, Wang YV, Wahl GM (2010) The p53 orchestra: Mdm2 and
Mdmx set the tone. Trends Cell Biol 20: 299-309
30.Badciong JC, Haas AL (2002) MdmX is a RING finger ubiquitin ligase capable of synergistically enhancing Mdm2 ubiquitination. J Biol
Chem 277: 49668-49675
Postępy Biochemii 61 (1) 2015
35.Denaro N, Lo Nigro C, Natoli G, Russi EG, Adamo V, Merlano MC
(2011) The Role of p53 and MDM2 in Head and Neck Cancer. ISRN
Otolaryngol 2011: 931813
36.Girod SC, Cesarz D, Fischer U, Krueger GR (1995) Detection of p53
and MDM2 protein expression in head and neck carcinogenesis. Anticancer Res 15: 1453-1457
37.Liu J, Zheng Y, Lei D, Liu D, Xu F, Jin T, Cao X, Zhao X, Yu X, Pan X
(2012) MDM2 309T>G polymorphism and risk of squamous cell carcinomas of head and neck: a meta-analysis. Asian Pac J Cancer Prev
12: 1899-1903
38.Dworakowska D, Jassem E, Jassem J, Peters B, Dziadziuszko R, Zylicz M, Jakobkiewicz-Banecka J, Kobierska-Gulida G, Szymanowska
A, Skokowski J, Roessner A, Schneider-Stock R (2004) MDM2 gene
amplification: a new independent factor of adverse prognosis in non-small cell lung cancer (NSCLC). Lung Cancer 43: 285-295
39.Momand J, Jung D, Wilczynski S, Niland J (1998) The MDM2 gene
amplification database. Nucleic Acids Res 26: 3453-3459
40.Lundgren K, Montes de Oca Luna R, McNeill YB, Emerick EP, Spencer
B, Barfield CR, Lozano G, Rosenberg MP, Finlay CA (1997) Targeted
expression of MDM2 uncouples S phase from mitosis and inhibits
mammary gland development independent of p53. Genes Dev 11:
714-725
41.Ma Y, Yuan R, Meng Q, Goldberg ID, Rosen EM, Fan S (2000) P53-independent down-regulation of Mdm2 in human cancer cells treated
with adriamycin. Mol Cell Biol Res Commun 3: 122-128
42.Brekman A, Singh KE, Polotskaia A, Kundu N, Bargonetti J (2011) A
p53-independent role of Mdm2 in estrogen-mediated activation of
breast cancer cell proliferation. Breast Cancer Res 13: R3
43.Mulay SR, Thomasova D, Ryu M, Anders HJ (2012) MDM2 (murine
double minute-2) links inflammation and tubular cell healing during
acute kidney injury in mice. Kidney Int 81: 1199-1211
44.Thomasova D, Mulay SR, Bruns H, Anders HJ (2013) p53-independent
roles of MDM2 in NF-kappaB signaling: implications for cancer therapy, wound healing, and autoimmune diseases. Neoplasia 14: 10971101
45.Conradt L, Henrich A, Wirth M, Reichert M, Lesina M, Algul H,
Schmid RM, Kramer OH, Saur D, Schneider G (2012) Mdm2 inhibitors
synergize with topoisomerase II inhibitors to induce p53-independent
pancreatic cancer cell death. Int J Cancer 132: 2248-2257
46.Jones SN, Hancock AR, Vogel H, Donehower LA, Bradley A (1998)
Overexpression of Mdm2 in mice reveals a p53-independent role for
Mdm2 in tumorigenesis. Proc Natl Acad Sci USA 95: 15608-15612
47.Maetens M, Doumont G, Clercq SD, Francoz S, Froment P, Bellefroid
E, Klingmuller U, Lozano G, Marine JC (2007) Distinct roles of Mdm2
and Mdm4 in red cell production. Blood 109: 2630-2633
48.Wade M, Li YC, Wahl GM (2013) MDM2, MDMX and p53 in oncogenesis and cancer therapy. Nat Rev Cancer 13: 83-96
49.Manfredi JJ (2010) The Mdm2-p53 relationship evolves: Mdm2 swings
both ways as an oncogene and a tumor suppressor. Genes Dev 24:
1580-1589
50.Gu L, Zhang H, He J, Li J, Huang M, Zhou M (2012) MDM2 regulates
MYCN mRNA stabilization and translation in human neuroblastoma
cells. Oncogene 31: 1342-1353
51.Fu W, Ma Q, Chen L, Li P, Zhang M, Ramamoorthy S, Nawaz Z, Shimojima T, Wang H, Yang Y, Shen Z, Zhang Y, Zhang X, Nicosia SV,
Pledger JW, Chen J, Bai W (2009) MDM2 acts downstream of p53 as
49
an E3 ligase to promote FOXO ubiquitination and degradation. J Biol
Chem 284: 13987-14000
73.Symington LS, Gautier J (2011) Double-strand break end resection and
repair pathway choice. Annu Rev Genet 45: 247-271
52.Miwa S, Uchida C, Kitagawa K, Hattori T, Oda T, Sugimura H, Yasuda
H, Nakamura H, Chida K, Kitagawa M (2006) Mdm2-mediated pRB
downregulation is involved in carcinogenesis in a p53-independent
manner. Biochem Biophys Res Commun 340: 54-61
74.Liu J, Doty T, Gibson B, Heyer WD (2010) Human BRCA2 protein
promotes RAD51 filament formation on RPA-covered single-stranded
DNA. Nat Struct Mol Biol 17: 1260-1262
53.Kulikov R, Winter M, Blattner C (2006) Binding of p53 to the central
domain of Mdm2 is regulated by phosphorylation. J Biol Chem 281:
28575-28583
54.Dias SS, Milne DM, Meek DW (2006) c-Abl phosphorylates Hdm2 at
tyrosine 276 in response to DNA damage and regulates interaction
with ARF. Oncogene 25: 6666-6671
55.Sionov RV, Coen S, Goldberg Z, Berger M, Bercovich B, Ben-Neriah
Y, Ciechanover A, Haupt Y (2001) c-Abl regulates p53 levels under
normal and stress conditions by preventing its nuclear export and ubiquitination. Mol Cell Biol 21: 5869-5878
56.Dimitriadi M, Poulogiannis G, Liu L, Backlund LM, Pearson DM, Ichimura K, Collins VP (2008) p53-independent mechanisms regulate the
P2-MDM2 promoter in adult astrocytic tumours. Br J Cancer 99: 11441152
57.Steinman HA, Burstein E, Lengner C, Gosselin J, Pihan G, Duckett CS,
Jones SN (2004) An alternative splice form of Mdm2 induces p53-independent cell growth and tumorigenesis. J Biol Chem 279: 4877-4886
58.Zhang Z, Zhang R (2005) p53-independent activities of MDM2 and
their relevance to cancer therapy. Curr Cancer Drug Targets 5: 9-20
59.Bouska A, Lushnikova T, Plaza S, Eischen CM (2008) Mdm2 promotes
genetic instability and transformation independent of p53. Mol Cell
Biol 28: 4862-4874
60.Melo AN, Eischen CM (2012) Protecting the genome from mdm2 and
mdmx. Genes Cancer 3: 283-290
61.Carrillo AM, Bouska A, Arrate MP, Eischen CM (2014) Mdmx promotes genomic instability independent of p53 and Mdm2. Oncogene doi:
10.1038/onc.2014.27
62.McNeil EM, Melton DW (2012) DNA repair endonuclease ERCC1-XPF
as a novel therapeutic target to overcome chemoresistance in cancer
therapy. Nucleic Acids Res 40: 9990-10004
63.Shiloh Y (2001) ATM and ATR: networking cellular responses to DNA
damage. Curr Opin Genet Dev 11: 71-77
64.Korwek Z, Alster O (2014) Rola szlaku indukowanego uszkodzeniami DNA w apoptozie i starzeniu komórkowym. Postepy Biochem 60:
248 - 262
65.Hartlerode AJ, Scully R (2009) Mechanisms of double-strand break repair in somatic mammalian cells. Biochem J 423: 157-168
66.Czornak K, Chughtai S, Chrzanowska KH (2008) Mystery of DNA repair: the role of the MRN complex and ATM kinase in DNA damage
repair. J Appl Genet 49: 383-396
67.Lee JH, Paull TT (2007) Activation and regulation of ATM kinase activity in response to DNA double-strand breaks. Oncogene 26: 77417748
68.Alt JR, Bouska A, Fernandez MR, Cerny RL, Xiao H, Eischen CM
(2005) Mdm2 binds to Nbs1 at sites of DNA damage and regulates
double strand break repair. J Biol Chem 280: 18771-18781
69.Escribano-Diaz C, Orthwein A, Fradet-Turcotte A, Xing M, Young JT,
Tkac J, Cook MA, Rosebrock AP, Munro M, Canny MD, Xu D, Durocher D (2013) A cell cycle-dependent regulatory circuit composed
of 53BP1-RIF1 and BRCA1-CtIP controls DNA repair pathway choice.
Mol Cell 49: 872-883
70.Kaidi A, Weinert BT, Choudhary C, Jackson SP (2010) Human SIRT6
promotes DNA end resection through CtIP deacetylation. Science 329:
1348-1353
71.Johnson RD, Jasin M (2000) Sister chromatid gene conversion is a
prominent double-strand break repair pathway in mammalian cells.
EMBO J 19: 3398-3407
72.Garcia V, Phelps SE, Gray S, Neale MJ (2011) Bidirectional resection of
DNA double-strand breaks by Mre11 and Exo1. Nature 479: 241-244
50
75.Bell JC, Plank JL, Dombrowski CC, Kowalczykowski SC (2012) Direct
imaging of RecA nucleation and growth on single molecules of SSB-coated ssDNA. Nature 491: 274-278
76.Yang H, Li Q, Fan J, Holloman WK, Pavletich NP (2005) The BRCA2
homologue Brh2 nucleates RAD51 filament formation at a dsDNA-ssDNA junction. Nature 433: 653-657
77.Jensen RB, Carreira A, Kowalczykowski SC (2010) Purified human
BRCA2 stimulates RAD51-mediated recombination. Nature 467: 678683
78.Holthausen JT, van Loenhout MT, Sanchez H, Ristic D, van Rossum-Fikkert SE, Modesti M, Dekker C, Kanaar R, Wyman C (2011) Effect
of the BRCA2 CTRD domain on RAD51 filaments analyzed by an ensemble of single molecule techniques. Nucleic Acids Res 39: 6558-6567
79.Larsen NB, Hickson ID (2013) RecQ Helicases: Conserved Guardians
of Genomic Integrity. Adv Exp Med Biol 767: 161-184
80.Svendsen JM, Harper JW (2010) GEN1/Yen1 and the SLX4 complex:
Solutions to the problem of Holliday junction resolution. Genes Dev
24: 521-536
81.Rigatti MJ, Verma R, Belinsky GS, Rosenberg DW, Giardina C (2011)
Pharmacological inhibition of Mdm2 triggers growth arrest and promotes DNA breakage in mouse colon tumors and human colon cancer
cells. Mol Carcinog 51: 363-378
82.Goodarzi AA, Jeggo PA (2013) The repair and signaling responses to
DNA double-strand breaks. Adv Genet 82: 1-45
83.Calsou P, Frit P, Humbert O, Muller C, Chen DJ, Salles B (1999) The
DNA-dependent protein kinase catalytic activity regulates DNA end
processing by means of Ku entry into DNA. J Biol Chem 274: 7848-7856
84.Mayo LD, Turchi JJ, Berberich SJ (1997) Mdm-2 phosphorylation by
DNA-dependent protein kinase prevents interaction with p53. Cancer
Res 57: 5013-5016
85.DeFazio LG, Stansel RM, Griffith JD, Chu G (2002) Synapsis of DNA
ends by DNA-dependent protein kinase. EMBO J 21: 3192-3200
86.Goodarzi AA, Yu Y, Riballo E, Douglas P, Walker SA, Ye R, Harer
C, Marchetti C, Morrice N, Jeggo PA, Lees-Miller SP (2006) DNA-PK
autophosphorylation facilitates Artemis endonuclease activity. EMBO
J 25: 3880-3889
87.Williams GJ, Hammel M, Radhakrishnan SK, Ramsden D, Lees-Miller
SP, Tainer JA (2014) Structural insights into NHEJ: Building up an integrated picture of the dynamic DSB repair super complex, one component and interaction at a time. DNA Repair (Amst) 17: 110-120
88.Dobbs TA, Tainer JA, Lees-Miller SP (2010) A structural model for regulation of NHEJ by DNA-PKcs autophosphorylation. DNA Repair
(Amst) 9: 1307-1314
89.Gama V, Gomez JA, Mayo LD, Jackson MW, Danielpour D, Song K,
Haas AL, Laughlin MJ, Matsuyama S (2009) Hdm2 is a ubiquitin ligase of Ku70-Akt promotes cell survival by inhibiting Hdm2-dependent
Ku70 destabilization. Cell Death Differ 16: 758-769
90.Pichiorri F, Suh SS, Rocci A, De Luca L, Taccioli C, Santhanam R, Zhou
W, Benson DM, Jr., Hofmainster C, Alder H, Garofalo M, Di Leva G,
Volinia S, Lin HJ, Perrotti D, Kuehl M, Aqeilan RI, Palumbo A, Croce
CM (2010) Downregulation of p53-inducible microRNAs 192, 194, and
215 impairs the p53/MDM2 autoregulatory loop in multiple myeloma
development. Cancer Cell 18: 367-381
91.Zhang T, Prives C (2001) Cyclin a-CDK phosphorylation regulates
MDM2 protein interactions. J Biol Chem 276: 29702-29710
92.Kulikov R, Boehme KA, Blattner C (2005) Glycogen synthase kinase
3-dependent phosphorylation of Mdm2 regulates p53 abundance. Mol
Cell Biol 25: 7170-7180
93.Inuzuka H, Tseng A, Gao D, Zhai B, Zhang Q, Shaik S, Wan L, Ang XL,
Mock C, Yin H, Stommel JM, Gygi S, Lahav G, Asara J, Xiao ZX, Kaelin
WG, Jr., Harper JW, Wei W (2010) Phosphorylation by casein kinase
www.postepybiochemii.pl
I promotes the turnover of the Mdm2 oncoprotein via the SCF(beta-TRCP) ubiquitin ligase. Cancer Cell 18: 147-159
97.Nag S, Qin J, Srivenugopal KS, Wang M, Zhang R (2013) The MDM2-p53 pathway revisited. J Biomed Res 27: 254-271
94.Gotz C, Kartarius S, Scholtes P, Nastainczyk W, Montenarh M (1999)
Identification of a CK2 phosphorylation site in mdm2. Eur J Biochem
266: 493-501
98.Panier S, Durocher D (2013) Push back to respond better: regulatory
inhibition of the DNA double-strand break response. Nat Rev Mol Cell
Biol 14: 661-672
95.Allende-Vega N, Dias S, Milne D, Meek D (2005) Phosphorylation of
the acidic domain of Mdm2 by protein kinase CK2. Mol Cell Biochem
274: 85-90
99.Ciccia A, Elledge SJ (2010) The DNA damage response: making it safe
to play with knives. Mol Cell 40: 179-204
96.Sionov RV, Moallem E, Berger M, Kazaz A, Gerlitz O, Ben-Neriah
Y, Oren M, Haupt Y (1999) c-Abl neutralizes the inhibitory effect of
Mdm2 on p53. J Biol Chem 274: 8371-8374
Multifunctionality of MDM2 protein and its role
in genomic instability of cancer cells
Marta Małuszek1,2, 
Institute of Biochemistry and Biophysics, Polish Academy of Sciences, 5a Pawinskiego St., 02-106 Warsaw, Poland;
International Institute of Molecular and Cell Biology in Warsaw, 4 Ksiecia Trojdena St., 02-109 Warsaw, Poland
1
2

e-mail: [email protected]
Key words: scaffold protein, hub protein, DNA double-strand breaks repair, oncogene, transformation process, tumor suppressor
ABSTRACT
Numerous studies have revealed that MDM2 oncoprotein is upregulated in different types of cancer. Additionally, it was demonstrated that
in some cases, MDM2 may inhibit the neoplastic transformation process. In other words, MDM2 protein can be considered as an oncogene or
as a tumor suppressor depending on the appropriate cellular context. MDM2 functions on different levels in the cell, which is a consequence
of its complex structure, a plethora of interacting partners and regulation through numerous postranslational modifications. Thus, an alteration of the delicate balance in MDM2 activity can influence transformation and cancer development. Genomic instability is a hallmark of
cancer, which inversely correlates to the activity of DNA damage response. In the case of not transformed cells MDM2 inhibits double strand
brakes (DSBs) repair, hence stimulating carcinogenesis. In cancer cells MDM2 stimulates cytostatic-induced DSBs repair, thus leading to
chemoresistance.
Postępy Biochemii 61 (1) 2015
51