Analiza sekwencji promotorów

2014-03-26
Analiza sekwencji promotorów
1
2014-03-26
TFy tworzą zawiły układ regulacyjny, na
który składają się różne oddziaływania
białko–białko poprzez wytworzenie PĘTLI
Specyficzne
TFy
Ogólne TFy
Benfey, Weigel 2001
Regulacja transkrypcyjna za
pośrednictwem elementów CIS
• Założenie1: Fragmenty DNA różnią się jedynie
sekwencją.
• Założenie2: Promotory muszą zawierać pełną
informację do specyfikacji regulacji genów.
• Jak zidentyfikować sekwencje odpowiedzialne za
regulacje genów?
2
2014-03-26
Częstość występowania wybranych elementów cis
i współczynnik wzbogacenia sekwencji
Cis element
Sequence
Proposed
Function
Number of
genes
% of all
genes
Enrichment
factor
-YACT-
Mesophyll
specific
22262*
~100%*
0.80
-CACGTG-
G-box, Phy 5620
regulated
21%
5.63
-AAAG-
Binds
Dof1&2
17620*
~ 100%*
0.6
-GATA-
Light
regulated
27186*
~ 100%*
1.0
-ACGTGTC-
ABA
regulated
2501
9%
3.6
-RCCGAC-
Cold
regulated
3588
13%
1.3
-AAAAAAA-
Nonregulatory
22700*
~ 100%
2.1
Zintegrowany algorytm dla
wyszukiwania biologicznie
aktywnych CRE
Dane z analiz
opóźnienia migracji
w żelu
Prawdopodobny
CRE
Genomowa
baza danych
Mikromacierze
Wyszukiwanie
wszystkich
promotorów z
danym CRE
Ma
CRE?
T
Test dla regulacji
genu przez
faktor X
Wyszukiwanie
promotorów z
mikromacierzy
N
Reg?
Lista
genów v.
lista
CRE
T
N
Lista
rejest.
genów
Aktyny
CRE
3
2014-03-26
Integracja informacji z
genomowych baz danych
z danymi z analizy
mikromacierzy DNA
•Lewa strona: dane
genomowe o pozycji i
orientacji
identyfikowanego CRE
•Prawa strona: dane z
mikromacierzy DNA o
poziomie ekspresji genów
posiadających dany CRE,
podczas traktowania
różnymi czynnikami
Giesler et al., 2006 Plant J. 45: 384-398
Założenie: Obecność aktywnego CE w
promotorze jest skorelowana z ekspresją
• Obecność prawdziwego CE
powinna zwiększyć
prawdopodobieństwo regulacji
genu, nawet jeśli ekspresja zależy
od wielu innych czynników.
ABA regulation of ABRE genes
% of genes >2-fold ind/sup
• Hipoteza zerowa: Losowa grupa
genów jest indukowana lub
hamowana w takim samym
stopniu jak średnia w genomie.
Iabre Iavg
Sabre Savg
Giesler et al., 2006
4
2014-03-26
Co przemawia za funkcjonalnością
potencjalnego elementu cis?
1.
2.
3.
4.
Odległość od TSS
Reakcja na bodźce
Specyficzność sekwencji
Specyficzność orientacji
1. Odległość od TSS
Liczba genów
Zagęszczenie sekwencji elementu cis w sąsiedztwie TSS.
Odległość od TSS
•
•
Silny efekt odległości od TSS
na aktywność
Efektywne odległości od TSS
mogą być bardzo różne
– ABRE -1000bp
– DRE -400bp
Giesler et al., 2006
Liczba genów o indukcji >2-krotnej
ABA
Cold
Novel element
Peroxide
Odległość od TSS (co 200pz)
5
2014-03-26
Nowe elementy
Znane elementy
2. Reakcja na bodźce
• Na niebiesko zaznaczono korelację istotną
• Funkcjonalny element powinien charakteryzować się
specyficznym zbiorem bodźców, na które reaguje.
Giesler et al., 2006
3. Specyficzność sekwencji
In silicio mutageneza
 Na polimorfizm
sekwencji elementów
wpływają naturalnie
pojawiające się
punktowe mutacje,
podobnie jak na ich
działanie.
 DRE element jest
efektywny w dwóch
orientacjach GCCGAC
lub ACCGAC, ale nie
jako CCCGAC lub
TCCGAC
Giesler et al., 2006 Plant J. 45: 384-398
6
2014-03-26
Novel elements
4. Specyficzność orientacji
Na niebiesko
zaznaczono
korelację istotną dla
efektu odwrotnego
przy odwróconej
orientacji elementu
(supresja zamiast
indukcji lub na
odwrót).
Giesler et al., 2006
Potwierdzenie doświadczalne
Przykładowa strategia:
• Fragmenty promotorów
– Fragmenty o dł. ok 100pz natywnego promotora z
domniemanym elementem cis w środku
• Sztuczne promotory
– 2-4 powtórzeń domniemanego elementu cis
• Test na kulturach tkankowych A. thaliana
7
2014-03-26
Potwierdzenie doświadczalne
• Fragment promotora::gen reporterowy (GUS)
• Element cis: NRXe2 (TGACGTCA)
• (100pz z elementem pośrodku)
W zawiesinie:
K
In silico:
ABA
H2O2
SA
Chłód
ABA
H2O2
SA
Chłód
-
++++
+
-
Giesler et al., 2006
Poprawna adnotacja promotora
•
•
•
•
Elementy cis korelujące z ekspresją genomu
Efektywna odległość od TSS
Efektywna orientacja
Efektywne rozmieszczenie od powtórzeń i
elementów towarzyszących
8