Pełny tekst - Wydawnictwa NIZP-PZH

Nr 3
AktywnoϾ thermomyces lanuginosusROCZN.
na tributyrynie
PZH 2005, 56 NR 3, 267–273
267
KATARZYNA JANDA, ANNA STOLARSKA1
BADANIA AKTYWNOŒCI LIPOLITYCZNEJ
THERMOMYCES LANUGINOSUS NA TRIBYTYRYNIE
A STUDY OF THE THERMOMYCES LANUGINOSUS LIPOLYTIC
ACTIVITY ON TRIBUTYRIN
Katedra Mikrobiologii i Biotechnologii Œrodowiska
Pracownia Technologii Rolnej i Przechowalnictwa
1
Katedra Fizjologii Roœlin
Akademia Rolnicza
ul. S³owackiego 17, 71-434 Szczecin
e mail: [email protected]
Kierownik: prof. dr hab. A. Nowak
Celem pracy by³o porównanie aktywnoœci lipolitycznej szczepów termofilnego grzyba Thermomyces lanuginosus, wyizolowanych z surowego ziarna kawy,
³uskanych orzechów laskowych, pod³o¿a pieczarkowego, biohumusu, kompostu
ogrodowego i kompostu liœciowego. Aktywnoœæ lipolityczn¹ szczepów grzybowych testowano przy u¿yciu tributyryny. Wszystkie badane szczepy zdolne by³y
do hydrolizy tego substratu. Najwy¿sz¹ aktywnoœci¹ lipolityczn¹ charakteryzowa³y siê szczepy wyizolowane z surowego ziarna kawy.
S³owa kluczowe: aktywnoœæ lipolityczna, Thermomyces lanuginosus, tributyryna
Key words: lipolytic activity, Thermomyces lanuginosus, tributyrin
WSTÊP
Drobnoustroje s¹ bogatym, potencjalnym Ÿród³em enzymów. Szczególn¹ grupê stanowi¹ grzyby termofilne, wystêpuj¹ce we wszystkich strefach klimatycznych i posiadaj¹ce
zdolnoœæ do biosyntezy wielu kompleksów enzymatycznych [5, 10]. Termostabilne enzymy
grzybów termofilnych znajduj¹ zastosowanie w wielu ga³êziach przemys³u. Wykorzystuje
siê je do otrzymywania wolnych kwasów t³uszczowych z naturalnych trójglicerydów, które
z kolei stosowane s¹ w medycynie lub jako dodatki do pasz. Enzymy lipolityczne mog¹ byæ
wykorzystywane w utylizacji odpadów przemys³u t³uszczowego oraz jako dodatki do detergentów [11, 14, 15].
Thermomyces lanuginosus Tsiklinskaya jest grzybem termofilnym powszechnie wystêpuj¹cym w przyrodzie [1, 8]. Grzyb ten ma zdolnoœæ do biosyntezy ksylanaz, proteaz, amylaz, celulaz i lipaz [7]. Dotychczasowe badania enzymatyczne T. lanuginosus prowadzone
by³y z wykorzystaniem szczepów pochodz¹cych z pojedynczych Ÿróde³. W niniejszej pracy
porównano aktywnoœæ lipolityczn¹ szczepów powy¿szego gatunku wyizolowanych z wielu
naturalnych Ÿróde³. Aktywnoœæ lipolityczn¹ tych szczepów testowano na po¿ywce sta³ej
zawieraj¹cej 1% tributyryny.
268
K. Janda, A. Stolarska
Nr 3
MATERIA£ I METODY
Ocenie aktywnoœci lipolitycznej poddano ³¹cznie 144 szczepy T. lanuginosus, które wyizolowano z surowego ziarna kawy (50 szczepów), ³uskanych orzechów laskowych (6 szczepów), pod³o¿a
pieczarkowego (42 szczepy), biohumusu (26 szczepów), kompostu ogrodowego (14 szczepów)
i kompostu liœciowego (6 szczepów). W badaniach aktywnoœci lipolitycznej powy¿szych szczepów
wykorzystano po¿ywkê TBA (Tributyrin Agar) o sk³adzie: Bactopepton (Difco) – 5 g, ekstrakt dro¿d¿owy (Difco) – 3 g, tributyryna (Sigma Aldrich) – 10 g, Bactoagar (Difco) – 15g, woda destylowana –
1000 ml [3]. Najpierw sk³adniki po¿ywki rozpuszczono na gor¹co, potem dodano tributurynê, po¿ywkê zmiksowano, poddano sterylizacji i rozlano do standardowych szalek Petriego. Koñcowe pH
po¿ywki wynosi³o 6,5.
Do posiewów na szalki z po¿ywk¹ TBA wykorzystywano piêciodobowe, zarodnikuj¹ce hodowle
szczepów T. lanuginosus na po¿ywce PDA (Potato Dextrose Agar) z dodatkiem 0,3% ekstraktu
dro¿d¿owego. Wed³ug Jensena i in. [8] po¿ywka ta stwarza optymalne warunki dla wzrostu i zarodnikowania badanego grzyba. Dla ka¿dego szczepu posiewy wykonano w trzech powtórzeniach. Hodowlê prowadzono w 55°C przez 10 dni. Powy¿sza temperatura mieœci siê w przedziale temperatur
optymalnych dla wzrostu T. lanuginosus. Ocenê aktywnoœci lipolitycznej prowadzano co 24 godziny, mierz¹c przy pomocy linijki œrednice stref hydrolizy substratu, widoczne jako przejaœnienie po¿ywki wokó³ kolonii. Mierzono równie¿ œrednice kolonii grzyba. Pomiary wykonywane by³y z dok³adnoœci¹ do 1 mm. Dla kolejnych dni hodowli obliczono wartoœci wskaŸnika aktywnoœci lipolitycznej, wyra¿aj¹ce stosunek œrednicy strefy hydrolizy substratu do œrednicy kolonii [4]. Obliczono
równie¿ dzienne przyrosty œrednicy kolonii i strefy przejaœnienia.
Wyniki poddano analizie statystycznej przy u¿yciu programu Statistica 5.1 w œrodowisku Windows. Dla kolejnych dni hodowli i grup szczepów (wyizolowanych z ró¿nych Ÿróde³) obliczono
œrednie i odchylenia standardowe wskaŸnika aktywnoœci lipolitycznej, dziennego przyrostu œrednicy
kolonii i strefy przejaœnienia. Istotnoœæ ró¿nic pomiêdzy grupami szczepów okreœlono przy pomocy
testu prosta ANOVA. Test ten wykorzystano równie¿ do oceny istotnoœci ró¿nic w analizie danych
dla wszystkich badanych szczepów.
WYNIKI
Zmiany wskaŸnika aktywnoœci lipolitycznej (œrednie i odchylenia standardowe) szczepów T. lanuginosus, wyizolowanych z ró¿nych naturalnych Ÿróde³ w czasie hodowli na
po¿ywce zawieraj¹cej 1% tributyryny przedstawiono w Tabeli I. Najwy¿sze wartoœci wskaŸnika aktywnoœci lipolitycznej stwierdzono dla szczepów wyizolowanych z surowego ziarna
kawy. Wartoœci te ros³y do trzeciego dnia hodowli, a nastêpnie stopniowo mala³y. W porównaniu ze szczepami wyizolowanymi z surowego ziarna kawy, pozosta³e grupy szczepów
charakteryzowa³y siê znacz¹co ni¿szymi wartoœciami wskaŸnika aktywnoœci lipolitycznej.
Wœród tych pozosta³ych grup najwy¿sze wartoœci tego wskaŸnika stwierdzono dla szczepów wyizolowanych z ³uskanych orzechów laskowych. W tej grupie szczepów stosunkowo
wysoka wartoœæ wskaŸnika w pierwszym dniu, znacz¹co zmala³a w drugim dniu hodowli.
Jednak¿e od trzeciego do szóstego dnia utrzymywa³y siê wartoœci wskaŸnika aktywnoœci
lipolitycznej porównywalne z wartoœci¹ w pierwszym dniu hodowli. Powy¿ej szóstego dnia
hodowli wartoœci te uleg³y stopniowemu zmniejszeniu. Wy¿ej opisane zmiany wskaŸnika
aktywnoœci lipolitycznej by³y istotne statystycznie. Z kolei ró¿nice w wartoœciach wskaŸnika aktywnoœci lipolitycznej pomiêdzy grupami szczepów wyizolowanych z pod³o¿a pieczarkowego, biohumusu, kompostu ogrodowego i kompostu liœciowego by³y statystycznie
nieistotne.
Nr 3
AktywnoϾ thermomyces lanuginosus na tributyrynie
269
Ta b e l a I . Zmiany wskaŸnika aktywnoœci lipolitycznej szczepów Thermomyces lanuginosus w czasie hodowli na po¿ywce sta³ej z trójbutyryn¹
The lipolytic activity index changes during the Thermomyces lanuginosus growth on
the tributyrin-containing medium
:VND QLNDNW\ZQR FLOLSROLW\F]QHM UHGQLHLRGFKVWDQGGODV]F]HSyZ
Z\L]RORZDQ\FK]H UyGHá
']LH áXVNDQH SRGáR H
KRGRZOL VXURZH]LDUQD RU]HFK\
NRPSRVW NRPSRVW
ELRKXPXV RJURGRZ\
SLHF]DUNRZH
OL FLRZ\
NDZ\
ODVNRZH
“ “ “ “ “ “
“ “ “ “ “ “
“ “ “ “ “ “
“ “ “ “ “ “
“ “ “ “ “ “
“ “ “ “ “ “
“ “ “ “ “ “
“ “ “ “ “ “
“ “ “ “ “ “
“ “ “ “ “ “
Na Ryc. 1 zilustrowano ogóln¹ tendencjê zmian wskaŸnika aktywnoœci lipolitycznej (œrednie i odchylenia standardowe dla wszystkich szczepów). Do trzeciego dnia hodowli obser-
Ryc. 1.
Zmiany wskaŸnika aktywnoœci lipolitycznej Thermomyces lanuginosus w czasie hodowli
na po¿ywce z tributyryn¹ (œrednie i odchylenia standardowe dla wszystkich szczepów).
The lipolytic activity index changes during the Thermomyces lanuginosus growth on the
tributyrin-containing medium (means and standard deviations for all strains).
270
K. Janda, A. Stolarska
Nr 3
Ryc. 2.
Zmiany dziennego przyrostu œrednicy strefy przejaœnienia wokó³ kolonii Thermomyces
lanuginosus w czasie hodowli na po¿ywce z tributyryn¹ (œrednie i odchylenia standardowe dla wszystkich szczepów).
The daily clearing zone increase changes during the Thermomyces lanuginosus growth on
the tributyrin-containing medium (means and standard deviations for all strains).
Ryc. 3.
Zmiany dziennego przyrostu œrednicy kolonii Thermomyces lanuginosus w czasie hodowli na po¿ywce z tributyryn¹ (œrednie i odchylenia standardowe dla wszystkich szczepów).
The daily growth rate changes during the Thermomyces lanuginosus growth on the tributyrin-containing medium (means and standard deviations for all strains).
Nr 3
AktywnoϾ thermomyces lanuginosus na tributyrynie
271
wowano wzrost wartoœci tego wskaŸnika. Wysokie wartoœci wskaŸnika utrzymywa³y siê od
trzeciego do pi¹tego dnia, by ulec stopniowemu zmniejszeniu w koñcowej fazie hodowli.
Z kolei dzienne przyrosty œrednicy strefy przejaœnienia (Ryc. 2) mia³y tendencjê wzrostow¹
w przeci¹gu ca³ego okresu hodowli. Wzrost ten mia³ jednak przebieg skokowy, tzn. po
ka¿dym du¿ym przyroœcie œrednicy strefy przejaœnienia, w nastêpnym dniu przyrost ten by³
znacz¹co mniejszy. Zmiany te by³y najlepiej widoczne dla szczepów wyizolowanych z surowego ziarna kawy. Wszystkie badane grupy szczepów charakteryzowa³y siê zbli¿onymi
zmianami dziennego przyrostu œrednicy kolonii. Na Ryc. 3 zilustrowano ogóln¹ tendencjê
tych zmian. Wartoœæ dziennego przyrostu œrednicy kolonii wyraŸnie zmniejszy³a siê w drugim dniu, od trzeciego do szóstego dnia mia³a tendencjê wzrostow¹, a powy¿ej szóstego
dnia – utrzymywa³a siê na zbli¿onym poziomie. Wy¿ej przedstawione zmiany by³y statystycznie istotne.
DYSKUSJA
Szczepy wyizolowane z surowego ziarna kawy charakteryzowa³y siê bardzo wysok¹ aktywnoœci¹ lipolityczn¹ na tributyrynie. Stosunkowo wysok¹ aktywnoœæ lipolityczn¹ wykazywa³y równie¿ szczepy wyizolowane z ³uskanych orzechów laskowych; w niniejszej pracy
potwierdzono wiêc wniosek wyci¹gniêty wczeœniej przez Jandê i Falkowskiego [6]. Ogólnie mo¿na wnosiæ, ¿e szczepy wyizolowane z surowców roœlinnych wykazywa³y aktywnoœæ
lipolityczn¹ znacz¹co wy¿sz¹ od aktywnoœci szczepów wyizolowanych z pod³o¿a pieczarkowego, biohumusu i kompostów. Wiadomo, ¿e ziarno kawy i orzechy charakteryzuj¹ siê
bogatym sk³adem chemicznym. Du¿y udzia³ w puli zwi¹zków organicznych tych surowców
maj¹ substraty t³uszczowe, g³ównie trójglicerydy [12, 16]. Z kolei komposty, biohumus
i pod³o¿e pieczarkowe maj¹ sk³ady chemiczne znacznie ró¿ni¹ce siê od sk³adu surowców
roœlinnych, jak równie¿ stwarzaj¹ zupe³nie odmienne warunki œrodowiskowe dla drobnoustrojów. W dojrza³ych kompostach dominuj¹ kwasy humusowe, a substancje t³uszczowe
pochodz¹ g³ównie od bakterii i grzybów [9, 13]. Wydaje siê, ¿e t¹ odmiennoœci¹ sk³adu
chemicznego i warunków œrodowiskowych mo¿na wyt³umaczyæ ró¿nice w aktywnoœci lipolitycznej badanych szczepów. Na podstawie sk³adu chemicznego trudno jednak wyjaœniæ
ró¿nice w aktywnoœci lipolitycznej pomiêdzy szczepami wyizolowanymi z surowych ziaren
kawy i ³uskanych orzechów laskowych.
W doœwiadczeniu zaobserwowano hamowanie wzrostu T. lanuginosus w drugim dniu
hodowli. W tym dniu stwierdzono równie¿ wzrost wskaŸnika aktywnoœci lipolitycznej
i obni¿enie dziennego przyrostu œrednicy strefy przejaœnienia. Wiadomo, ¿e produktami
hydrolizy tributyryny s¹ gliceryna i kwas mas³owy. Gliceryna jest inhibitorem wielu enzymów grzybowych [2], a kwas mas³owy wykazuje toksyczne w³aœciwoœci wobec grzybów,
zw³aszcza wobec grzybów strzêpkowych [17]. W œwietle dostêpnych danych mo¿na postawiæ hipotezê, ¿e obni¿enie wartoœci dziennego przyrostu œrednicy kolonii i dziennego przyrostu strefy przejaœnienia w drugim dniu hodowli mog³o byæ wynikiem hamuj¹cego wp³ywu produktów hydrolizy tributyryny. W kolejnych dniach wzrost szczepów by³ jednak coraz szybszy, ale wzrost œrednicy strefy przejaœnienia mia³ skokowy przebieg. Mo¿e to oznaczaæ, ¿e szczepy T. lanuginosus w jakimœ stopniu zaadaptowa³y siê do wysokich stê¿eñ
gliceryny i kwasu mas³owego; te produkty hydrolizy tributyryny nie mia³y ju¿ wp³ywu na
wzrost szczepów, mia³y natomiast znacz¹cy wp³yw na ich aktywnoœæ lipolityczn¹. WskaŸnik aktywnoœci lipolitycznej nie ukazuje jednak powy¿szych zmian.
K. Janda, A. Stolarska
272
Nr 3
Ze wzglêdu na wysok¹ aktywnoœæ lipolityczn¹ szczepy izolowane z surowych ziaren
kawy i ³uskanych orzechów laskowych mog¹ byæ wykorzystane do ró¿nych celów aplikacyjnych. Mo¿na wiêc mówiæ o du¿ym potencjale biotechnologicznym tych szczepów. Nie
ulega równie¿ w¹tpliwoœci, ¿e badania skriningowe aktywnoœci enzymatycznej grzybów
izolowanych z ró¿nych naturalnych Ÿróde³ maj¹ du¿e znaczenie z biotechnologicznego punktu
widzenia.
K. Janda, A. Stolarska
A STUDY OF THE THERMOMYCES LANUGINOSUS LIPOLYTIC ACTIVITY
ON TRIBUTYRIN
Summary
The study was to compare the lipolytic activity of Thermomyces lanuginosus wild strains on the
medium containing 1-% tributyrin. The strains were isolated from raw coffee beans, shelled hazelnuts, mushroom compost, biohumus, garden compost and leaf compost. The incubation was carried
out at 55°C for ten days. The lipolytic activity index was the hydrolysis zone diameter/colony diameter ratio. Daily growth rates and daily clearance zone increase were also analyzed. All strains tested
hydrolyzed tributyrin. The highest lipolytic activity index values were found in the strains isolated
from raw coffee beans. Relatively high lipolytic activity index values were also found in the strains
isolated from shelled hazelnuts. The highest lipolytic activity indices were observed between the 3rd
and 5th day of incubation. It was hypothesized that the products of the tributyrin hydrolysis considerably affected both fungal growth and lipolytic activity. The T. lanuginosus strains isolated from raw
coffee beans and shelled hazelnuts have a great biotechnological potential.
PIŒMIENNICTWO
1. Cooney D.G., Emerson R.: Thermophilic fungi. An account of their biology, activities and classification. W.H. Freeman and Company. San Francisco & London, 1964.
2. Gradišnik-Grapulin M., Legiša M.: Comparison of specific metabolic characteristics playing
a role in citric acid exretion between some strains of the genus Aspergillus. Journal of Biotechnology 1996, 45, 265-270.
3. Harrigan W.F., McCance M.E.: Laboratory methods in food and dairy microbiology. Academic
Press. London, 1976.
4. Ilnicka-Olejniczak O., Hornecka D., Solak G.: Selekcja i izolacja wysokowydajnych szczepów
wytwarzaj¹cych enzymy. Cz. I. Szybka metoda selekcji wysokowydajnych szczepów wytwarzaj¹cych glukoamylazê. Prace Instytutów i Lab. Bad. Przem. Spo¿. 1983, 37, 47-59.
5. Janda K., Falkowski J.: Grzyby termofilne – wystêpowanie, w³aœciwoœci biochemiczne i temperatury kardynalne. Post. Mikrobiol. 2001, 40, 287-310.
6. Janda K., Falkowski J.: Badanie aktywnoœci lipolitycznej szczepów termofilnego grzyba Thermomyces lanuginosus (syn. Humicola lanuginosa) na pod³o¿u p³ynnym. Acta Scientiarum Polonorum, Biologia, 2002, 1, 43-48.
7. Janda K., Falkowski J.: Termofilny grzyb Thermomyces lanuginosus – wystêpowanie i w³aœciwoœci. Post. Mikrobiol. 2003, 42, 55-66.
8. Jensen B., Wiebe M.G., Robson G.D., Trinci A.P.J., Olsen J.: Growth kinetics of the thermophilic
fungus Thermomyces lanuginosus. Mycol. Res. 1993, 97, 665-669.
9. Kaiser J.: Modelling composting as a microbial ecosystem: a simulation approach. Ecological
Modelling 1996, 91, 25-37.
Nr 3
AktywnoϾ thermomyces lanuginosus na tributyrynie
273
10. Mouchacca J.: Thermophilic fungi: biodiversity and taxonomic status. Cryptogamie, Mycol.
1997, 18, 19-69.
11. Pandey A., Benjamin S., Soccol C.R., Nigam P., Krieger N., Soccol V.T.: The realm of microbial
lipases in biotechnology. Review. Biotechnol. Appl. Biochem. 1999, 29, 119-131.
12. Patarroyo M.E.: Chemistry of coffee. The Coffee and Health Seminar. Cartagena (www.ico.org/
event/cofhealth/cofhealth.htm), 2003.
13. C.: Regulation of lipid accumulation in oleaginous microorganisms. Biochemical Society Transactions 2002, 30, 1047-1050.
14. Reetz M.T.: Lipases as practical biocatalysts. Current Opinion in Chemical Biology 2002, 6, 145150.
15. Sharma C., Chisti Y., Banerjee U.C.: Production, purification, characterization and applications
of lipases. Biotechnol. Adv. 2001, 19, 627-662.
16. Vigli G., Phillippidis A., Spyros A., Dais P.: Classification of edible oils by employing 31P and 1H
NMR spectroscopy in combination with multivariate statistical analysis. A proposal for the detection of seed oil adulteration in virgin olive oils. J. Agric. Food Chem. 2003, 51, 5715-5722.
17. Woolford M.K.: The antimicrobial spectra of organic compounds with respect to their potential as
hay preservatives. Grass and Forage Science 1984, 39, 75-79.
Otrzymano: 2004.12.28