Nr 3 223 OCENA ZDOLNOŚCI SZCZEPÓW THERMOMYCES

Nr 3
ZdolnoϾ Thermomyces lanuginosus doROCZN.
biodegradacji
PZH, oleju
2004, 55 NR 3, 223–228
223
KATARZYNA JANDA1, KRYSTYNA PRZYBULEWSKA2
OCENA ZDOLNOŒCI SZCZEPÓW THERMOMYCES LANUGINOSUS
DO BIODEGRADACJI OLEJU RZEPAKOWEGO
THE ESTIMATION OF THE ABILITY OF THERMOMYCES LANUGINOSUS
STRAINS TO THE BIODEGRADATION OF THE RAPE OIL
Katedra Technologii Rolnej i Przechowalnictwa,
Akademia Rolnicza
71-434 Szczecin, ul. S³owackiego 17
Kierownik: prof. dr hab. J. Falkowski
e-mail: [email protected]
1
Katedra Biotechnologii i Mikrobiologii Œrodowiska
Akademia Rolnicza
71-434 Szczecin, ul. S³owackiego 14
Kierownik: prof. dr hab. A. Nowak
2
Materia³ badawczy stanowi³y szczepy termofilnego grzyba Thermomyces lanuginosus wyodrêbnione z ró¿nych œrodowisk naturalnych. Celem pracy by³a ocena
ich zdolnoœci do hydrolizy oleju rzepakowego. Udowodniono, ¿e wszystkie szczepy zdolne by³y do biodegradacji oleju rzepakowego, zaœ najwy¿sz¹ aktywnoœci¹
lipolityczn¹ charakteryzowa³y siê szczepy wyizolowane z ³uskanych orzechów laskowych.
WSTÊP
Zgodnie z ogólnie przyjêt¹ definicj¹ grzyby termofilne s¹ mikroorganizmami, zdolnymi
do wzrostu i rozwoju w przedziale temperatur od 20 do 50°C. Wystêpuj¹ w powietrzu,
w glebach ró¿nych stref klimatycznych, w sk³adowanych masach roœlinnych i wielu innych œrodowiskach [2, 3, 5, 10]. Drobnoustroje te posiadaj¹ zdolnoœæ do biosyntezy wielu
egzoenzymów, co stwarza mo¿liwoœci wykorzystywania ich w przemyœle, farmacji lub
w ochronie œrodowiska [1, 5, 6, 9, 12, 15, 16]. Gatunek Thermomyces lanuginosus zaliczany jest do najczêœciej spotykanych grzybów termofilnych. Posiada najwy¿sz¹ wœród grzybów maksymaln¹ temperaturê wzrostu, wynosz¹c¹ 60-62°C [11]. Szczepy tego gatunku
wyizolowano miêdzy innymi z gleb, kompostowanej materii organicznej, ziaren zbó¿, orzechów i nasion [11]. Dowiedziono, ¿e szczepy Thermomyces lanuginosus zdolne s¹ do biosyntezy wielu egzoenzymów lipolitycznych [4, 11, 17]. Celem niniejszej pracy by³a ocena
zdolnoœci szczepów tego gatunku do rozk³adu oleju rzepakowego. Podjêto ponadto próbê
okreœlenia, czy istniej¹ ró¿nice w poziomie aktywnoœci lipolitycznej wynikaj¹ce z pochodzenia szczepów.
224
K. Janda, K. Przybulewska
Nr 3
MATERIA£ I METODY
Materia³ badawczy stanowi³y 144 szczepy termofilnego grzyba Thermomyces lanuginosus (syn.
Humicola lanuginosa), które wyodrêbniono z biohumusu, pod³o¿a pieczarkowego, kompostu ogrodowego, kompostu liœciowego, z ³uskanych orzechów laskowych oraz z surowego ziarna kawy.
Do badania aktywnoœci lipolitycznej wykorzystano pod³o¿e sta³e wed³ug Kunert i Lysek [13],
zawieraj¹ce substrat t³uszczowy w postaci oleju rzepakowego w iloœci 1,5%. Pod³o¿e na szalkach
Petriego inokulowano fragmentami grzybni powietrznych, pochodz¹cych z zarodnikuj¹cych hodowli. Doœwiadczenie prowadzono w trzech powtórzeniach w temperaturze 55°C przez 144 godziny. Efekt hydrolizy oleju rzepakowego przez egzoenzymy lipolityczne badanych szczepów widoczny by³ jako zmiana zabarwienia po¿ywki wokó³ kolonii z zielonkawe do niebieskogranatowej. Przyczyn¹ tego zjawiska by³y kwasy t³uszczowe, uwolnione przez kompleks eznymów lipolitycznych,
które obni¿a³y wartoœæ pH œrodowiska i prowadzi³y do zmiany zabarwienia po¿ywki hodowlanej
[13, 14].
Ocenê aktywnoœci enzymatycznych przeprowadzano co 24 godziny, mierz¹c œrednice stref hydrolizy substratu oraz œrednice kolonii grzyba. Na podstawie tych pomiarów obliczono indeksy
aktywnoœci enzymatycznej (IA) wyra¿aj¹ce stosunek œrednicy strefy hydrolizy substratu do œrednicy kolonii [7, 8].
Uzyskane wyniki poddano analizie statystycznej za pomoc¹ analizy wariancji. Do obliczenia
najmniejszych istotnych ró¿nic przy p = 0,05 wykorzystano test Tukey`a. Znajomoœæ najmniejszych
istotnych ró¿nic pozwoli³a na utworzenie grup jednorodnych, w obrêbie których znalaz³y siê wartoœci nie ró¿ni¹ce siê istotnie miêdzy sob¹. Wspó³czynniki korelacji oraz równania regresji wyliczono
za pomoc¹ programu statystycznego Statistica.
WYNIKI I ICH OMÓWIENIE
Przeprowadzone badania wykaza³y, ¿e wyodrêbnione szczepy charakteryzowa³y siê zró¿nicowan¹ aktywnoœci¹ lipolityczn¹ (Tab. I).
Najwy¿sz¹ wartoœæ indeksu aktywnoœci lipolitycznej równ¹ 1,19 uzyska³y szczepy wyodrêbnione z orzechów laskowych. Wartoœæ ta ró¿ni³a siê istotnie od wartoœci indeksu aktywnoœci lipolitycznej uzyskanych przez pozosta³e szczepy i stanowi³a odrêbn¹ grupê jednorodn¹. Wartoœci indeksu aktywnoœci lipolitycznej, charakteryzuj¹ce szczepy z pozosta³ych Ÿróde³ stanowi³y grupê jednorodn¹ i nie stwierdzono miêdzy nimi statystycznie istotnych ró¿nic.
Zmiany wartoœci indeksu aktywnoœci lipolitycznej badanych szczepów w czasie szeœciodobowej hodowli na pod³o¿u z olejem rzepakowym przedstawia krzywa na rycinie 1.
Poniewa¿ niezale¿nie od pochodzenia szczepów krzywe mia³y zbli¿ony charakter, w zwi¹zku
z tym tendencje tê przedstawiono w postaci jednej krzywej. Zaprezentowane wartoœci s¹
reprezentatywne dla badanej populacji Thermomyces lanuginosus.
Najwy¿sze wartoœci indeksu aktywnoœci lipolitycznej badane szczepy osi¹ga³y w pierwszej dobie i wartoœæ ta istotnie ró¿ni³a siê istotnie od wartoœci uzyskanych w pozosta³ych
dobach hodowli.
Na podstawie przeprowadzonych badañ stwierdzono, ¿e podczas hodowli wyodrêbnionych szczepów na po¿ywce z dodatkiem oleju rzepakowego tworzy³y one kolonie o zró¿nicowanych œrednicach (Tab. II).
Najwiêksze kolonie o œrednicy 47,92 mm tworzy³y szczepy wyodrêbnione z pod³o¿a
pieczarkowego. Ró¿nica pomiêdzy t¹ wartoœci¹, a wartoœciami uzyskanymi przez pozosta-
ZdolnoϾ Thermomyces lanuginosus do biodegradacji oleju
Nr 3
225
Tabela I. Œrednie wartoœci indeksu aktywnoœci lipolitycznej szczepów Thermomyces lanuginosus hodowanych na pod³o¿u sta³ym z olejem rzepakowym
The average index of the lipolytic activity of the Thermomyces lanuginosus strains incubated on the solid medium with rape oil
:DUWR üLQGHNVX
UyGáRZ\RGU EQLHQLD
DNW\ZQR FL
V]F]HSyZ
*UXS\MHGQRURGQH
1,5 OLSROLW\F]QHM,$
àXVNDQHRU]HFK\ODVNRZH
D
.RPSRVWRJURGRZ\
E
3RGáR HSLHF]DUNRZH
E
%LRKXPXV
E
6XURZH]LDUQRNDZ\
E
.RPSRVWOL FLRZ\
E
³e szczepy by³a statystycznie istotna. Najmniejsze kolonie o œrednicy 35,22 mm tworzy³y
szczepy pochodz¹ce z orzechów laskowych. Wielkoœæ ta tak¿e ró¿ni³a siê istotnie od wartoœci reprezentuj¹cych wielkoœci kolonii pozosta³ych szczepów.
Wartoœci indeksu aktywnoœci lipolitycznej ( IA )
&]DVKRGRZOLGRE\
Ryc. 1. Zmiany wartoœci indeksu aktywnoœci lipolitycznej szczepów Thermomyces lanuginosus
w czasie hodowli na pod³o¿u sta³ym z dodatkiem oleju rzepakowego.
The changes of index of the lipolytic activity of the Thermomyces lanuginosus strains incubated on the solid medium with rape oil.
K. Janda, K. Przybulewska
226
Nr 3
Tabela II. Œrednie œrednice kolonii tworzonych przez badane szczepy na pod³o¿u sta³ym z dodatkiem
oleju rzepakowego
The average diameters of the colonies formed by the investigated strains on the solid
medium with rape oil
UyGáRZ\RGU EQLHQLD
UHGQLFHNRORQLL
*UXS\MHGQRURGQH
PP
1,5 3RGáR HSLHF]DUNRZH
D
.RPSRVWRJURGRZ\
E
%LRKXPXV
E
E
.RPSRVWOL FLRZ\
F
2U]HFK\ODVNRZH
G
V]F]HSyZ
=LDUQRNDZ\
Tabela III. Wspó³czynniki korelacji i równania regresji dotycz¹ce wielkoœci kolonii badanych szczepów oraz wartoœci indeksu aktywnoœci lipolitycznej
The coefficients of correlation and the regression equations applied to the diameters of the
colonies and the index of the lipolytic activity
UyGáRZ\RGU EQLHQLD
V]F]HSyZ
5yZQDQLHUHJUHVML
:VSyáF]\QQLNNRUHODFML
àXVNDQHRU]HFK\ODVNRZH
\ [
U .RPSRVWRJURGRZ\
\ [
U 3RGáR HSLHF]DUNRZH
\ [
U %LRKXPXV
\ [
U 6XURZH]LDUQRNDZ\
\ [
U .RPSRVWOL FLRZ\
\ [
U Poœrednie œrednice kolonii charakteryzowa³y szczepy wyizolowane z kompostu ogrodowego, tworz¹ce kolonie o œrednicy 45,92 mm, szczepy pochodz¹ce z biohumusu, które
tworzy³y kolonie o œrednicy 45,72 mm, szczepy pochodz¹ce z surowego ziarna kawy, tworz¹ce kolonie o œrednicy 45,0 mm. Wymienione wartoœci stanowi³y grupê jednorodn¹ i nie
ró¿ni³y siê istotnie miêdzy sob¹. Szczepy wyodrêbnione z kompostu liœciowego tworzy³y
kolonie o œrednicy 41,61 mm i wartoœæ ta stanowi³a odrêbn¹ grupê jednorodn¹.
We wszystkich przypadkach wykazano istotn¹ statystycznie ujemn¹ korelacjê pomiêdzy wielkoœci¹ kolonii badanych szczepów a ich aktywnoœci¹ lipolityczn¹ (Tab. III).
Badania te potwierdzi³y doniesienia literatury, ¿e na podstawie wielkoœci kolonii grzyba
nie mo¿na wnioskowaæ o jego aktywnoœci lipolitycznej [7, 8]. Otrzymane wyniki wskazuj¹, ¿e w celu dokonania skriningu szczepów Thermomyces lanuginosus w kierunku ich
Nr 3
ZdolnoϾ Thermomyces lanuginosus do biodegradacji oleju
227
aktywnoœci lipolitycznej w obecnoœci oleju rzepakowego, nale¿y oceniæ ich aktywnoœæ
lipolityczn¹ po 24 godzinach inkubacji
WNIOSKI
1. Wszystkie wyizolowane szczepy posiada³y zdolnoœæ do hydrolizy oleju rzepakowego.
2. Najwy¿sz¹ aktywnoœci¹ lipolityczn¹ charakteryzowa³y siê szczepy pochodz¹ce z ³uskanych orzechów laskowych.
3. Niezale¿nie od pochodzenia szczepów najwy¿sze wartoœci indeksu aktywnoœci lipolitycznej osi¹ga³y one w pierwszej dobie hodowli.
4. We wszystkich przypadkach wykazano istotn¹ statystycznie ujemn¹ korelacjê pomiêdzy wielkoœciami kolonii badanych szczepów a wartoœciami ich indeksów aktywnoœci lipolitycznej.
K. J a n d a, K. P r z y b u l e w s k a
THE ESTIMATION OF THE ABILITY OF THERMOMYCES LANUGINOSUS STRAINS
TO THE BIODEGRADATION OF THE RAPE OIL
Summary
The aim of this study was the estimation of the ability the thermophilic fungus Thermomyces
lanuginosus (syn. Humicola lanuginosa) to the biosynthesis lipolytic enzymes. The investigated
material contained 144 strains of this fungus isolated from biohumus, garden compost, leaf compost, mushroom compost, hazelnuts and raw coffee beans. The incubation was conducted at 55°C on
the solid medium with 1,5% rape oil. The study proved, that all tested strains were able to the
hydrolysis of the rape oil. The highest lipolytic activity have the strains isolated from the hazelnuts.
It was found the significant negative correlation between the diameters of the colonies investigated
strains and their lipolytic activity.
PIŒMIENNICTWO
1. Bednarski W., Reps. A. (red.): Biotechnologia ¿ywnoœci. Wyd. Naukowo-Techniczne, Warszawa
2001.
2. Bilaj T.I., Zacharczenko W.A.: Opriebielitiel tiermofilnych gribow. Izd. Naukowa Dumka, Kijew
1987.
3. Bilaj T.I.: Tiermostabilnyje fiermienty gribow. Izd. Naukowa Dumka, Kijew 1979.
4. Bisson S., Christov L., Singh S.: Bleach boosting effects of purified xylanase from Thermomyces
lanuginosus SSBP on bagasse pulp. Process Biochemistry 2002, 37, 567-572.
5. Edwards C.: Microbiology of extreme environments. McGraw-Hill Publ. Company, 1990.
6. Elimer E., Miœkiewicz T., Kwaœnik J.: Mo¿liwoœci wykorzystania ubocznych i odpadowych produktów przemys³u t³uszczowego metod¹ mikrobiologiczn¹. Przem. Ferment. i Owoc. Warz. 1989,
11-12, 8-10.
7. Hornecka D., Ilnicka-Olejniczak O., Solak G.: Selekcja i izolacja wysokowydajnych szczepów
wytwarzaj¹cych enzymy. Cz. IV. Szybka metoda selekcji wysokowydajnych szczepów wytwarzaj¹cych enzymy proteolityczne. Prace Instytutów i Lab. Bad. Przem. Spo¿. 1984, 38, 27-35.
8. Ilnicka-Olejniczak O., Hornecka D., Solak G.: Selekcja i izolacja wysokowydajnych szczepów
wytwarzaj¹cych enzymy. Cz. I. Szybka metoda selekcji wysokowydajnych szczepów wytwarzaj¹cych glukoamylazê. Prace Instytutów i Lab. Bad. Przem. Spo¿. 1983, 37, 47-59.
228
K. Janda, K. Przybulewska
Nr 3
9. Jaeger K.E., Reetz M.T.: Microbial lipases from versatile tools for biotechnology. Tibitech, September 1998, 16, 396-403.
10. Janda K., Falkowski J.: Grzyby termofilne – wystêpowanie, w³aœciwoœci biochemiczne i temperatury kardynalne. Post. Mikrobiol., 2001, 40, 3, 287-310.
11. Janda K., Falkowski J.: Termofilny grzyb Thermomyces lanuginosus: wystêpowanie i w³aœciwoœci. Post. Mikrobiol. 2003, 42, 1, 55-60.
12. Kristjanson J.K.: Thermophilic organisms as a source of thermostable enzymes. Trends in Biotechnology 1989, 7, 349-353.
13. Kunert J., Lysek H.: Lipolytic activity of ovicidial soil fungi. Biologia 1987, 42, 285-290.
14. Lawrence R.C.: Microbial lipases and related esterases. Part. I. Detection, distribution and production of microbial lipases. Part. II. Estimation of lipase activity. Characterizarion of lipases. Recent
work concerning their effect on dairy products. Dairy Sci. Abstr. 1967, 29 (1), 1-8, (2), 59-70.
15. Nigam P., Singh D.: Enzyme and microbial systems involved in starch processing. Enzyme Microb. Technol. 1995, 17, 770-778.
16. Reetz M.T.: Lipases as practical biocatalysts. Curr. Opin. Chem. Biol. 2002, 6, 145-150.
17. Singh S., Pillay B., Prior B.A.: Thermal stability of beta-xylanases produced by different Thermomyces lanuginosus strains. Enz. Microb. Technol. 2000, 26, 502-508.
Otrzymano: 2003.10.27