MECHANIZMY OPORNOŚCI NA ANTYBIOTYKI

Nowiny Lekarskie 2007, 76, 4, 314-321
PAWEŁ SACHA, PIOTR JAKONIUK, PIOTR WIECZOREK, MARCIN ŻÓRAWSKI
MECHANIZMY OPORNOŚCI NA ANTYBIOTYKI β-LAKTAMOWE
IZOLATÓW ESCHERICHIA COLI, KLEBSIELLA PNEUMONIAE, PROTEUS MIRABILIS
I ENTEROBACTER CLOACAE OPORNYCH NA CEFOTAKSYM
MECHANISMS OF RESISTANCE TO β-LACTAM ANTIBIOTICS IN ESCHERICHIA COLI,
KLEBSIELLA PNEUMONIAE, PROTEUS MIRABILIS
AND ENTEROBACTER CLOACAE ISOLATES RESISTANT TO CEFOTAXIME
Zakład Diagnostyki Mikrobiologicznej
Akademia Medyczna w Białymstoku
Kierownik Zakładu: dr hab. med. Piotr Jakoniuk
Streszczenie
Wstęp. Wyniki badań naukowych na świecie wskazują na narastanie oporności na antybiotyki wśród pałeczek Enterobacteriaceae.
Cel. Ocena występowania mechanizmów oporności na antybiotyki β-laktamowe oraz wrażliwości na antybiotyki wśród szczepów P. mirabilis, E.
coli, K. pneumoniae i E. cloacae opornych na cefotaksym.
Materiały i metoda. Przebadano 303 szczepy pałeczek Enterobacteriaceae izolowane z różnych materiałów klinicznych. Do badania wrażliwości na
antybiotyki stosowano metodę dyfuzyjno-krążkową. Do oceny występujących mechanizmów oporności na antybiotyki β-laktamowe stosowano
metodę PCR i MDDT.
Wyniki. Wytwarzanie ESBL było najważniejszym mechanizmem warunkującym oporność na antybiotyki β-laktamowe. Zdolność wytwarzania
ESBL wykryto u 33,7% izolatów Enterobacteriaceae, głównie u E. cloacae (16,8%) i K. pneumoniae (11,9%). Mechanizm AmpC wykazano
u 9,9%, a inne mechanizmy oporności u 7,9% badanych izolatów Enterobacteriaceae. Częstość występowania mechanizmów oporności
w grupie szczepów opornych na cefotaksym wynosiła: ESBL – 60%, ESBL i AmpC – 15,5%, AmpC – 6,7% i 17,8% inne.
Wnioski. Najważniejszym mechanizmem oporności na antybiotyki β-laktamowe badanych pałeczek Enterobacteriaceae było wytwarzanie ESBL
i/lub AmpC enzymów. Nie wykazano obecności enzymów CTX-M wśród szczepów opornych na cefotaksym.
SŁOWA KLUCZOWE: mechanizmy oporności na antybiotyki β-laktamowe, Enterobacteriaceae, wrażliwość na antybiotyki.
Summary
Introduction. Worldwide scientific data show that there is an increasing level of resistance to antibiotics among Enterobacteriaceae rods.
Aim. The aim of this study was to evaluate susceptibility to antibiotics and detection of mechanisms of resistance to β-lactam antibiotics among
P. mirabilis, E. coli, K. pneumoniae, and E. cloacae strains resistant to cefotaxime.
Material and methods. We studied 303 strains of Enterobacteriaceae rods isolated from different clinical samples. Disk – diffusion method
was used to study susceptibility to antibiotics. MDDT and PCR methods were used to detect mechanisms of bacterial resistance to β-lactam
antibiotics.
Results. The major mechanism of resistance to β-lactam antibiotics was production of ESBL. ESBL were detected in 33.7% of Enterobacteriaceae
isolates, especially in E.cloacae (16.8%) and K.pneumoniae (11.9%). AmpC mechanism was detected in 9.9% isolates and other mechanisms in
7.9% isolates of Enterobacteriaceae. Occurrence of mechanisms resistance in cefotaxime-resistant group (R-CTX) respectively: ESBL – 60%,
ESBL and AmpC – 15.5%, AmpC – 6.7% and other 17.8%.
Conclusion. The most important mechanisms of resistance to β-lactam antibiotics in Enterobacteriaceae were production ESBL and/or AmpC
enzymes. Strains producing CTX-M enzymes among of cefotaxime-resistant strains were not found.
KEY WORDS: mechanisms resistance to β-lactam antibiotics, Enterobacteriaceae, susceptibility to antibiotics.
Wstęp
Wśród wielu antybiotyków stosowanych w leczeniu
zakażeń wywołanych przez pałeczki Enterobacteriaceae
nadal najważniejszą grupę stanowią antybiotyki β-laktamowe. Szczególnie chętnie w praktyce klinicznej
korzysta się z cefalosporyn ze względu na ich znakomite
właściwości farmakokinetyczne, szerokie spektrum działania
przeciwbakteryjnego i niewielką toksyczność. Wszystkie te
cechy preferują stosowanie tych leków zarówno u dzieci, jak
i osób dorosłych do zwalczania zakażeń o różnej lokalizacji
[1, 2].
Nadużywanie cefalosporyn III generacji, takich jak
cefotaksym, czy ceftazydym często prowadzi do selekcji
szczepów opornych na większość antybiotyków β-laktamowych (oprócz karbapenemów). Najliczniejszą
grupę z nabytą opornością na cefalosporyny stanowią
gramm-ujemne pałeczki z rodziny Enterobacteriaceae.
Kolonizacja środowiska szpitalnego takimi szczepami
może stanowić istotny czynnik ryzyka, wpływający na
zwiększenie liczby zakażeń szpitalnych stwarzających
poważne trudności terapeutyczne [3, 4].
Należy pamiętać, że antybiotyki cefalosporynowe
stanowią jeden z czynników mutagennych prowadzący
do wytwarzania oporności przez bakterie na antybiotyki
Mechanizmy oporności na antybiotyki β-laktamowe izolatów Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae...
β-laktamowe. Wśród wielu mechanizmów odpowiedzialnych za tego typu oporność u pałeczek Enterobacteriaceae,
na pierwszym miejscu wymienia się β-laktamazy o
rozszerzonym spektrum substratowym (ESBL; ang.
extended-spectrum β-lactamases) [3]. Geny kodujące ich
wytwarzanie mogą być zlokalizowane na chromosomie lub
plazmidach. Możliwość transferu plazmidów wśród różnych
gatunków Enterobacteriaceae stwarza zagrożenia związane
z pojawianiem się szczepów wieloopornych [3–5].
Dynamicznie rozprzestrzeniającą się wśród pałeczek
Enterobacteriaceae grupą ESBL są cefotaksymazy (CTXM) [6, 7]. Dotychczas opisano ponad 60 różnych CTX-M [8]
występujących wśród wielu gatunków bakterii. Doniesienia
o ich występowaniu napływają z odległych regionów świata:
Azja [9], Ameryka Płd. i Płn. [10, 11], Afryka [12]. Również
w Europie odnotowuje się istotny wzrost zainteresowania tą
grupą ESBL [13–16].
W Polsce, pierwsze enzymy z tej grupy opisali w
1998 roku Gniadkowski i wsp. u Citrobacter freundii
(CTX-M-1/MEN-1) i Escherichia coli (CTX-M-3) [17].
Kilka lat później (w 2002 roku), ten sam zespół badawczy opisał obecność CTX-M-3 u innych gatunków
pałeczek Enterobacteriaceae (z rodzaju Klebsiella,
Enterobacter, Serratia, Morganella) izolowanych w 15
szpitalach z różnych regionów Polski [18].
Cel badań
– Ocena częstości występowania różnych mechanizmów
warunkujących oporność E. coli, P. mirabilis, E. cloacae i K.
pneumoniae na antybiotyki β-laktamowe.
– Porównanie aktywności różnych antybiotyków wobec
szczepów opornych na cefotaksym.
– Określenie udziału cefotaksymaz (CTX-M) w
oporności badanych gatunków pałeczek Enterobacteriaceae
na cefalosporyny.
Materiał i metody
Badania dotyczące występowania mechanizmów
oporności na antybiotyki β-laktamowe oraz ocenę
wrażliwości na antybiotyki przeprowadzono na 303
pałeczkach Enterobacteriaceae należących do 4 gatunków:
Escherichia coli (n = 72), Klebsiella pneumoniae (n = 75),
Proteus mirabilis (n = 69) i Enterobacter cloacae (n = 87).
Wszystkie szczepy wyizolowano z materiałów klinicznych
(wymazy z ran, cewniki, dreny itd.) w Zakładzie Diagnostyki
Mikrobiologicznej Akademii Medycznej w Białymstoku
w pierwszych dwóch miesiącach kolejnych lat 2004, 2005
i 2006. Badane gatunki dobierano do badań w podobnych
proporcjach ilościowych (20–29 szczepów/kolejny rok).
Identyfikację do gatunku (po izolacji z materiału
klinicznego) przeprowadzono z zastosowaniem karty GNI
i automatycznego systemu VITEK 1 (bioMérieux, Marcy
l’Etoile, France).
Szczepy po izolacji (z 2004 i 2005 roku) były
przechowywane na kriobankach w temperaturze –32oC.
315
Przed przystąpieniem do badań szczepy rewitalizowano
poprzez 3-krotny pasaż na agarze Columbia (bioMérieux,
Marcy l’Etoile, France) i poddawano ponownej
identyfikacji przy użyciu ID 32E i systemu ATB
(bioMérieux, Marcy l’Etoile, France).
Badanie wrażliwości na antybiotyki wykonano
metodą dyfuzyjno-krążkową na podłożu Muller-Hintona
agar (Oxoid, Basingstoke, UK) postępując zgodnie z zaleceniami CLSI i Krajowego Ośrodka Referencyjnego ds.
Lekowrażliwości Drobnoustrojów [19, 20].
Oceniano wrażliwość na następujące grupy leków:
cefalosporyny (cefotaksym, ceftazydym, cefepim, cefazolina,
cefuroksym), monobaktamy (aztreonam), karbapenemy
(imipenem, meropenem), penicyliny i ich połączenia z inhibitorami (ampicylina, amoksycylina z kwasem
klawulanowym, tikarcylina z kwasem klawulanowym,
piperacylina z tazobaktamem, ampicylina z sulbaktamem),
aminoglikozydy (gentamycyna, netilmycyna, amikacyna)
oraz ciprofloksacynę, tetracyklinę i trimetoprim z
sulfametoksazolem.
W celu kontroli poprawności wykonywanych badań
stosowano szczepy referencyjne Escherichia coli ATCC
25922 i Escherichia coli ATCC 35218.
Mechanizm oporności na antybiotyki β-laktamowe
określano na podstawie uzyskanych wyników w teście
MDDT (ang. Modified Double Disk Test) stosując
metodykę i kryteria opisane przez Pitout i wsp. [21].
Jako szczepy wzorcowe stosowano Klebsiella
pneumoniae ATCC 700603 (ESBL-dodatni) i Pseudomonas
aeruginosa ATCC 27853 (AmpC-dodatni).
Szczepy, u których stwierdzono oporność na cefotaksym
(R-CTX) i wykazano wytwarzanie β-laktamaz z grupy ESBL,
badano techniką PCR na obecność genów warunkujących
wytwarzanie CTX-M. Jako materiał wykorzystano
genomowy DNA, izolowany z 24-godzinnej hodowli (37oC)
bakterii na bulionie TSB (Emmapol, Gdańsk, Polska). Izolację
przeprowadzono posługując się zestawem GeneMatrix
(EURx, Gdańsk, Polska), postępując zgodnie z procedurą opisaną przez producenta.
Do reakcji PCR przygotowywano 25 µl mieszaniny,
zawierającej: 25 pmol każdego ze starterów, 1x bufor
reakcyjny, 2 mM MgCl2, 1µl dNTSs, 0,5U Delta 2 DNA
polimerazy (DNA-Gdańsk II, Gdańsk, Polska) i 2 µl genomowego DNA. Mieszaninę składników reakcji
uzupełniano do końcowej objętości wodą dejonizowaną.
Reakcję PCR przeprowadzono w termocyklerze
Cyclone 96 (PEQLAB Biotechnology, GmbH) w
następujących warunkach: 1) wstępna denaturacja w 94oC,
6 minut; 2) denaturacja w 94oC, 60 sekund; 3) przyłączanie
starterów w 50oC, 40 sekund; 4) wydłużanie nici DNA
w 72oC, 60 sekund; 5) końcowe wydłużanie w 72oC,
6 minut; 6) schłodzenie do 4oC. Etapy 2, 3, 4 powtarzano
cyklicznie 35 razy.
W badaniach zastosowano uniwersalne startery dla
rodziny enzymów CTX-M o sekwencji opisanej przez
316
Paweł Sacha i inni
Sundsfjord i wsp. [22].
Produkty reakcji PCR rozdzielano w czasie 60
minut (napięcie 5V/cm), w 1,6% żelu agarozowym (MP
Biomedicals, France) i barwiono bromkiem etydyny
(MP Biomedicals, France) w buforze TBE. Spodziewana
wielkość produktów dla genu blaCTX-M wynosiła 585 par
zasad (pz). Ich obecność oceniano w transiluminatorze UV
(UVP Ltd., UK), a wielkość uzyskanych produktów po
rozdziale elektroforetycznym porównywano z markerem
MW 100-1000 (DNA-Gdańsk II, Gdańsk, Polska).
Wyniki
Przeprowadzone badania oceniające oporność pałeczek
Enterobacteriaceae na różne antybiotyki przedstawiono w
tabeli 1.
Wykazały one występowanie oporności wobec
antybiotyków β-laktamowych u ponad połowy szczepów
K. pneumoniae (52–69,7%) i E. cloacae (65,5–72,4%).
Pałeczki E. coli i P. mirabilis były bardziej wrażliwe.
Obserwowano niższy odsetek szczepów opornych
na cefalosporyny, od 4,2% (cefoperazon) do 43,5%
(cefazolina). Najniższą aktywność wśród cefalosporyn III
generacji wykazywał cefotaksym (8,3–69,7% szczepów
opornych).
Za wyjątkiem tikarcyliny z kwasem klawulanowym
(TIM), pozostałe badane preparaty antybiotyków β-laktamowych z inhibitorami β-laktamaz (AMC, SAM
i TZP), nie wykazywały zadowalającej aktywności
przeciwbakteryjnej.
Jedynymi antybiotykami β-laktamowymi, wobec
których nie występowała oporność wśród badanych
pałeczek Enterobacteriaceae były karbapenemy (imipenem,
meropenem) i cefepim.
W grupie antybiotyków aminoglikozydowych
najaktywniejszym preparatem była amikacyna (E. coli – 4,2%
i P. mirabilis – 4,3% szczepów opornych). Oporność na
pozostałe (gentamycynę i netylmycynę) wahała się w
zakresie od 8,3% do 68% szczepów i zależała od gatunku.
Zaobserwowano duże zróżnicowanie oporności na
tetracyklinę. Najmniej szczepów opornych wykazano
u pałeczek K. pneumoniae (8%), natomiast inne gatunki,
tj. E. coli, P. mirabilis i E. cloacae były w większości
oporne. Co do pozostałych badanych preparatów
(ciprofloksacyny i trimetoprimu z sulfametoksazolem), to
najmniej opornych szczepów wykazano u E. coli (16,7%
i 25%), a najwięcej (58,6% i 55,2%) u E. cloacae.
Na podstawie wyników powyższych badań, stosując
jako kryterium wrażliwość na cefotaksym, wyłoniono
2 grupy szczepów: R-CTX (oporne na cefotaksym) i SCTX (wrażliwe na cefotaksym). Grupę pierwszą (R-CTX)
stanowiło 135/303 szczepów (44,6%), a grupę drugą
(S-CTX) – 168/303 szczepów (55,4%). Wyniki analizy
wrażliwości na antybiotyki w obu grupach pałeczek
Enterobacteriaceae zestawiono w tabeli 2.
Dane te wskazują na znacznie wyższą oporność
pałeczek z grupy R-CTX wobec stosowanych w badaniach
antybiotyków, a szczególnie aminoglikozydów (wyjątek
szczepy E. coli), cefalosporyn (wyjątek wysoka aktywność
ceftazydymu wobec K. pneumoniae) i połączeń penicylin
z inhibitorami β-laktamaz.
Wyniki badań nad mechanizmami warunkującymi
oporność na antybiotyki β-laktamowe przedstawiono w
tabeli 3. Badaniami objęto szczepy oporne na cefotaksym
(R-CTX).
Z zastosowaniem testu MDDT stwierdzono
występowanie 2 mechanizmów oporności na β-laktamy,
takich jak wytwarzanie enzymów z grupy ESBL i/lub
AmpC. Zdolność tę wykazano u 75,6% (102/135) RCTX szczepów. Najliczniejszą grupę stanowiły pałeczki
wytwarzające tylko ESBL – 81/135 (60%). Większość
szczepów ESBL-dodatnich należała do gatunku E.
cloacae (36/81 – 44,4%) i K. pneumoniae (30/81 – 37%).
Jednoczesne występowanie zdolności wytwarzania ESBL
i AmpC zidentyfikowano u 15 szczepów E. cloacae i 6
szczepów K. pneumoniae. Z kolei zdolność wytwarzania
tylko AmpC wykazano u 9 szczepów z gatunku E. cloacae.
U 17,8% pałeczek Enterobacteriaceae występowały
mechanizmy oporności o innym charakterze aniżeli ESBL
czy AmpC.
Badania wykonane techniką PCR na 102 szczepach
Enterobacteriaceae (81 szczepów wytwarzających ESBL
oraz 21 szczepów, które oprócz zdolności wytwarzania ESBL
wytwarzały także AmpC), nie wykazały obecności genów bla
(cefotaksymaz) w żadnym z testowanych szczepów.
CTX-M
Dyskusja
Występowanie w środowisku szpitalnym szczepów
pałeczek Enterobacteriaceae opornych na antybiotyki
β-laktamowe staje się dość powszechnym zjawiskiem.
Znaczną rolę w ekspansji oporności wśród różnych
gatunków odgrywają antybiotyki należące do cefalosporyn
III-generacji. Nadużywanie takich preparatów jak
cefotaksym „prowokuje” bakterie do wytwarzania
mechanizmów obronnych. Do najczęściej opisywanych
zalicza się obecnie zdolność wytwarzania ESBL [3–5].
Przeprowadzone przez nas badania na puli 303
szczepów Enterobacteriaceae izolowanych z różnych
materiałów klinicznych w latach 2004–2006 wykazały
występowanie dużej grupy szczepów opornych na
cefotaksym (135/303 – 44,6%). Większość wywodziła się
z gatunku K. pneumoniae i E. cloacae (≥ 69% szczepów).
Oporność na inne cefalosporyny u tych gatunków
występowała na zbliżonym poziomie (od 64% do 72,4%).
Ciekawym faktem był brak występowania szczepów
K. pneumoniae opornych na ceftazydym w grupie RCTX (jedynie 6,3% szczepów średnio wrażliwych).
Tego typu szczepy (ESBL-dodatnie) wrażliwe „in vitro”
na ceftazydym (MIC; 2 mg/L) opisywane są również
w literaturze [13].
Aktywność poszczególnych antybiotyków w grupie
26,1
69,0
Proteus mirabilis (69)
Enterobacter cloacae (87)
65,5
21,7
-
8,3
CAZ
69,0
17,4
52,0
4,2
CFP
-
-
-
-
FEP
NB
43,5
64,0
33,3
CZ
72,4
34,8
64,0
25,0
CXM
69,0
-
36,0
-
ATM
-
-
-
-
IPM
-
-
-
-
MEM
NB
52,2
NB
83,3
AM
NB
30,4
64,0
58,3
AMC
Szczepy oporne (%)
69,0
26,1
-
-
TIM
69,0
17,4
52,0
8,3
TZP
NB
39,1
68,0
58,3
SAM
51,7
30,4
64,0
16,7
GM
34,5
26,1
64,0
8,3
NET
21,7 91,3
8,0
48,3 58,6 62,1
4,3
TE
16,7 75,0
CIP
64,0 28,0
4,2
AN
55,2
60,9
64,0
25,0
SXT
Objaśnienia:
NB, nie badano (naturalna oporność)
CTX, cefotaksym; CAZ, ceftazydym; CFP, cefoperazon, FEP, cefepim; CZ, cefazolina; CXM, cefuroksym; ATM, aztreonam; IPM, imipenem; MEM, meropenem; AM, ampicylina; AMC, amoksycylina
z kwasem klawulanowym; TIM, tikarcylina z kwasem klawulanowym; TZP, piperacylina z tazobaktamem; SAM, ampicylina z sulbaktamem; GM, gentamycyna; NET, netylmycyna; AN, amikacyna; CIP,
ciprofloksacyna; TE, tetracyklina; SXT, trimetoprim z sulfametoksazolem
69,7
8,3
CTX
Klebsiella pneumoniae (75)
Escherichia coli (72)
Gatunek (liczba szczepów)
Tab. 1. Oporność na antybiotyki pałeczek Enterobacteriaceae (N = 303)
Table 1. Resistance to antibiotics of Enterobacteriaceae rods (N = 303)
Mechanizmy oporności na antybiotyki β-laktamowe izolatów Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae...
317
6,2
81,8
100
100
77,8
93,7
16,7
-
100
100
100
100
K. pneumoniae (48)
P. mirabilis (18)
E. cloacae (63)
E. coli (66)
K. pneumoniae (27)
P. mirabilis (51)
E. cloacae (24)
100
100
100
100
100
100
100
100
FEP
NB
NB
64,7
100
45,4
NB
-
-
-
CZ
55,6
88,2
100
81,8
-
-
-
-
100
100
100
80,9
-
100
-
-
CXM ATM
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
IPM MEM
NB
64,7
NB
18,2
NB
-
NB
-
AM
NB
94,1
44,4
45,5
NB
-
6,2
-
88,9
88,2
100
-
-
16,7
-
-
AMC TIM
88,9
94,1
100
54,5
-
33,3
12,5
-
TZP
Odsetek szczepów wrażliwych (%)
NB
82,4
77,8
54,5
NB
-
12,5
-
SAM
88,9
94,1
100
81,8
30,0
-
-
100
GM
88,9
100
100
80,9
30,0
-
-
100
NET
77,8
100
100
80,9
35,0
83,3
-
100
AN
77,8
94,1
77,8
63,3
25,0
33,3
68,7
100
CIP
-
17,6
55,6
27,3
10,0
-
75,1
-
TE
88,9
52,9
88,9
63,6
25,0
-
-
-
SXT
Objaśnienia:
(R – CTX), izolaty oporne na cefotaksym; (S – CTX), izolaty wrażliwe na cefotaksym; NB, nie badano (naturalna oporność)
CTX, cefotaksym; CAZ, ceftazydym; CFP, cefoperazon, FEP, cefepim; CZ, cefazolina; CXM, cefuroksym; ATM, aztreonam; IPM, imipenem; MEM, meropenem; AM, ampicylina; AMC, amoksycylina
z kwasem klawulanowym; TIM, tikarcylina z kwasem klawulanowym; TZP, piperacylina z tazobaktamem; SAM, ampicylina z sulbaktamem; GM, gentamycyna; NET, netylmycyna; AN, amikacyna; CIP,
ciprofloksacyna; TE, tetracyklina; SXT, trimetoprim z sulfametoksazolem
(S-CTX)
(R-CTX)
-
E. coli (6)
CFP
CAZ
Gatunek
(liczba szczepów)
Oporność
na cefotaksym
Tab. 2. Porównanie aktywności antybiotyków wobec pałeczek Enterobacteriaceae wrażliwych (S-CTX) i opornych (R-CTX) na cefotaksym
Table 2. Comparison of antibiotics activity between groups Enterobacteriacea rods, susceptible (S-CTX) and resistant (R-CTX) to cefotaxime
318
Paweł Sacha i inni
48
18
63
135
Klebsiella pneumoniae
Proteus mirabilis
Enterobacter cloacae
Razem:
-
-
-
-
-
CTX-M*
ESBL
81 (60,0%)
36 (57,1%)
12 (66,7%)
30 (62,5%)
3 (50,0%)
Inne ESBL
Objaśnienia:
(R-CTX), izolaty oporne na cefotaksym, ESBL – β-laktamazy o szerokim spektrum substratowym; AmpC – cefalosporynaza C;
* CTX-M (cefotaksymazy) – obecność genów warunkujących ich wytwarzanie badano z zastosowaniem techniki PCR;
** - (1) inne β-laktamazy, (2) mutacje receptorów wiążących antybiotyk, (3) spadek zdolności transportu leku do miejsca działania.
6
Liczba szczepów
(R – CTX)
Escherichia coli
Gatunek
21 (15,5%)
15 (23,8%)
-
6 (12,5%)
-
ESBL+AmpC
9 (6,7%)
9 (14,3%)
-
-
-
AmpC
Mechanizm oporności – liczba szczepów (%)
Tab. 3. Mechanizmy oporności na antybiotyki β-laktamowe wśród szczepów Enterobacteriaceae (opornych na cefotaksym)
Table 3. Resistance mechanisms to β-lactam antibiotics were among of Enterobacteriaceae strains (resistant to cefotaxime)
24 (17,8%)
3 (4,8%)
6 (33,3%)
12 (25,0%)
3 (50,0%)
Inne**
Mechanizmy oporności na antybiotyki β-laktamowe izolatów Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae...
319
320
Paweł Sacha i inni
cefalosporyn może być zróżnicowana. Zjawisko to zależy
od rodzajów wytwarzanych β-laktamaz (ESBL). Gonlugur
i wsp. [23] w swoich badaniach otrzymali wyniki świadczące
o wyższej aktywności cefotaksymu (67,9% szczepów
opornych) niż ceftazydymu (71,4% szczepów opornych)
w grupie szczepów ESBL-dodatnich.
W przypadku wykazania zdolności wytwarzania ESBL
i tak należy traktować takie szczepy jako oporne na leczenie
ceftazydymem (i pozostałymi antybiotykami β-laktamowymi).
Wrażliwość na cefotaksym i ceftazydym pozostałych
badanych gatunków (E. coli, P. mirabilis, E. cloacae)
występowała na zbliżonym poziomie.
Antybiotykami, które wykazywały pełną aktywność
wobec wszystkich badanych gatunków (S-CTX i RCTX) były: imipenem, meropenem i cefepim (100%).
Zdecydowana większość szczepów opornych na cefotaksym, wykazywała jednocześnie oporność na antybiotyki
aminoglikozydowe i połączenia penicylin z inhibitorami.
Przeprowadzone przez nas badania wyłoniły liczną
grupę szczepów (135/303) prezentujących jeden lub
kilka mechanizmów oporności na antybiotyki β-laktamowe. Najczęściej (102/135 – 75,6%) była to zdolność
wytwarzania ESBL. Cechę tą obserwowano wśród 58,6%
pałeczek E. cloacae i 48% K. pneumoniae. Pozostałe
gatunki wykazywały tę zdolność na znacznie niższym
poziomie: P. mirabilis – 17,4% i E. coli – 8,3%.
Z danych literaturowych wynika, że wytwarzanie ESBL
przez poszczególne gatunki pałeczek Enterobacteriaceae
uzależnione jest od wielu czynników. Luzzaro i wsp. [24]
stwierdzili u pacjentów szpitalnych najwięcej szczepów
ESBL-dodatnich wśród Providencia > Enterobacter >
Klebsiella, natomiast u pacjentów leczonych ambulatoryjnie
były to gatunki z rodzaju Proteus i Providencia.
Z kolei wyniki badań przeprowadzonych przez Spanu
i wsp. wraz z The Italian ESBL Study Group [25] na liczbie
8015 izolatów z rodziny Enterobacteriaceae wykazały
najwyższy odsetek szczepów ESBL – dodatnich wśród K.
pneumoniae (37,1%) i P. mirabilis (25,7%).
Rezultaty naszych badań, wskazujące na najczęstszą
zdolność wytwarzania ESBL przez E. cloacae i K.
pneumoniae, wynikają prawdopodobnie z lokalnej sytuacji
epidemiologicznej i zastosowanej w badaniach bardziej
wszechstronnej metody detekcji (MDDT) [21] aniżeli
klasyczna (tj. DDST; ang. double disk synergy test) [5]
. Metoda MDDT pozwala na jednoczesne potwierdzenie
zdolności wytwarzania ESBL i/lub AmpC, co z kolei
przyczynia się do bardziej dokładnego zdefiniowania
tych dwóch mechanizmów oporności na antybiotyki
β-laktamowe. Mechanizm oporności, związany z
wytwarzaniem AmpC często „maskuje” obecność ESBL
[3, 5].
W grupie 135 szczepów opornych na cefotaksym
zdolność wytwarzania AmpC wykazaliśmy jedynie wśród
gatunków E. cloacae (24 szczepy) i K. pneumoniae (6
szczepów). Często mechanizm ten występował razem ze
zdolnością wytwarzania ESBL (21/30 szczepów).
Badania związane z poszukiwaniem obecności cefotaksymaz – pomimo zastosowania czułej techniki detekcji
(PCR) i uniwersalnych starterów dla rodziny enzymów
CTX-M – nie dały pozytywnych rezultatów. Świadczy to
o braku występowania tego typu enzymów w lokalnej
populacji szczepów opornych na cefotaksym (i
wytwarzających ESBL). W celu ustalenia udziału CTXM w oporności na antybiotyki β-laktamowe, należałoby
przeprowadzić badania na większej liczbie szczepów.
Poprawna interpretacja wyników oceny wrażliwości na
antybiotyki (antybiogram) powinna opierać się o informacje
uzyskane z rutynowych badań uwzględniających występowanie różnych mechanizmów oporności wśród
badanych szczepów bakteryjnych. Ma to kolosalne
znaczenie w doborze przez lekarza antybiotyku skutecznego
w leczeniu zakażeń szczepami wieloopornymi (np.
wytwarzającymi ESBL i/lub AmpC) i eliminacji ich ze
środowiska szpitalnego.
Wnioski
1. Najczęstszym mechanizmem odpowiedzialnym za
oporność na antybiotyki β-laktamowe wśród badanych
pałeczek Enterobacteriaceae było wytwarzanie ESBL
(33,7%) i/lub AmpC (9,9%).
2. Wśród szczepów ESBL – dodatnich opornych na
cefotaksym nie wykazano zdolności wytwarzania CTXM (cefotaksymaz).
3. Najwyższą oporność (i różnorodność występujących
mechanizmów oporności) na antybiotyki wykazano u
Enterobacter cloacae i Klebsiella pneumoniae.
4. Imipenem i meropenem wykazywały pełną aktywność
(100% szczepów wrażliwych) wobec wszystkich badanych szczepów.
Piśmiennictwo
1. Christian S.S., Christian J.S.: The cephalosporins antibiotics.
Prim. Care Update Ob/Gyns., 1997, 4(5), 168-174.
2. Nicholson K.G.: Cefalosporyny. W: Antybiotyki i chemioterapia. Lambert H.P., O’Grady F.W. (red.). Wydawnictwo Medyczne, Warszawa 1994, 93-138.
3. Bradford P.A.: Extended-spectrum β-lactamases in the 21st
century: characterization, epidemiology, and detection of this
important threat. Clin. Microbiol. Rev., 2001, 14(4), 933-951.
4. Suárez C.J., Lolans K., Villegas M.V., Quinn J.P.: Mechanisms
of resistance to β-lactams in some gram-negative bacteria causing nosomical infections. Expert Rev. Anti. Infect. Ther., 2005,
3(6), 915-922.
5. Livermoore D.M.: β-lactamases in laboratory and clinical resistance. Clin. Microbiol. Rev., 1995, 8(4) 557-584.
6. Bonnet R.: Growing group of extended-spectrum β-lactamases: the CTX-M enzymes. Antimicrob. Agents Chemother., 2004, 48(1), 1-14.
7. Rasmussen J.W., Høiby N.: Cefotaximases (CTX-M-ases), an
expanding family of extended-spectrum β-lactamases. Can. J.
Mechanizmy oporności na antybiotyki β-laktamowe izolatów Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae...
Microbiol., 2004, 50, 137-165.
8. CTX-M-type β-Lactamases. http://www.lahey.org/Studies/
other.asp#table1
9. Kim J., Lim Y.M., Jeong Y.S., Seol S.Y.: Occurrence of CTXM-3, CTX-M-15, CTX-M-14 and CTX-M-9 extended-spectrum β-lactamases in Enterobacteriaceae clinical isolates in
Korea. Antimicrob. Agents Chemother., 2005, 49(4), 15721575.
10. Villegas M.V., Correa A., Perez F., Zuluaga T., Radice M., Gutkind G., Casellas J.M., Ayala J., Lolans K., Quinn J.P. and the
Colombian Nosomical Resistance Study Group.: CTX-12 βlactamase in Klebsiella pneumoniae clinical isolate in Columbia. Antimicrob. Agents Chemother., 2004, 48(2) 629-631.
11. Jones R.N., Jenkins S.G., Hoban D.J., Pfaller M.A., Ramphal
R.: In vitro efficacy of six cephalosporins tested against Enterobacteriaceae isolated at 38 North American medical centers
participating in the SENTRY Antimicrobial Surveillance Program, 1997-1998. Int. J. Antimicrob. Agents.,2000, 15, 111118.
12. Al-Agamy M.H.M, Seif El-Din Ashour M., Wiegand I.: First
description of CTX-M β-lactamase-producing clinical Escherichia coli isolates from Egypt. Int. J. Antimicrob. Agents, 2006,
27, 545-548.
13. Pagani L., Dell’Amico E., Migliavacca R., D’Andrea M.M.,
Giacobone E., Amicosante G., Romero E., Rossolini G.M.:
Multiple CTX-M-type extended-spectrum β-lactamases in nosomical isolates of Enterobacteriaceae from a hospital in Northern Italy. J. Clin. Microbiol.,2003, 41(9), 4264-4269.
14. Sabaté M., Miró E., Navarro F., Vergés C., Aliga R., Mirellis
B., Prats G.: β-lactamases involved in resistance to broad-spectrum cephalosporins in Escherichia coli and Klebsiella spp. clinical isolates collected between 1994 and 1996, in Barcelona
(Spain). J. Antimicrob. Agents Chemother., 2002, 49(6) 989997.
15. Quentin C., Arpin C., Dubois V., André C., Lagrange I., Fischer I., Brochet J.P., Grobost F., Jullin J., Dutilh B., Larribet
G., Noury P.: Antibiotic resistance rates and phenotypes among
isolates of Enterobacteriaceae in French extra-hospital practice.
Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis., 2004, 23, 185-193.
16. Edelstein M., Pimkin M., Edelstein I., Stratchouski L.: Prevalence and molecular epidemiology of CTX-M extended-spectrum β-lactamase-producing Escherichia coli and Klebsiella
pneumoniae in Russian hospitals. Antimicrob. Agents Chemother., 2003, 47(12), 3724-3732.
17. Gniadkowski M., Scheider I., Pałucha A., Jungwirth R., Mikie-
321
wicz B., Bauernfeind A.: Cefotaxime-resistant Enterobacteriaceae isolates from a hospital in Warsaw, Poland: Identification
of a new CTX-M-3 cefotaxime-hydrolizing β-lactamase that is
closely related to the CTX-M-1/MEN-1 enzyme. Antimicrob.
Agents Chemother., 1998, 42(4) 827-832.
18. Baraniak A., Fiett J., Sulikowska A., Hryniewicz W., Gniadkowski M.: Countrywide spread of CTX-M-3 extended-spectrum β-lactamase-producing microorganisms of the family
Enterobacteriaceae in Poland. Antimicrob. Agents Chemother.,
2002, 46(1), 151-159.
19. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance
standards for antimicrobial testing. 16th Informational Supplement. M100-S16.Wayne, PA, CLSI, 2006.
20. Hryniewicz W., Sulikowska A., Szczypa K., Skoczyńska
A., Kadłubowska-Łuczak A., Gniadkowski M.: Rekomendacje doboru testów do oznaczania wrażliwości bakterii na
antybiotyki i chemioterapeutyki. Narodowy Instytut Zdrowia
Publicznego, Warszawa 2006, 1-49.
21. Pitout J.D.D., Reisbig M.D., Venter E.C., Church D.L., Hanson N.D.: Modification of the double-disk tests for detection of
Enterobacteriaceae producing extended-spectrum and AmpC
β-lactamases. J. Clin. Microbiol., 2003, 41(8), 3933- 3935.
22. Sundsfjord A., Simonsen G., Haldorsen B., Haaheim H., Hjelmevoll S.O., Littauer P., Dahl K.H.: Genetic methods for detection of antimicrobial resistance. APMIS, 2004, 815-837.
23. Gonlugur U., Bakici M.Z., Akkurt I., Efeoglu T.: Antibiotic
susceptibility patterns among respiratory isolates of gram-negative bacilli in a Turkish university hospital. BMC Microbiology, 2004, 4, 32.
24. Luzzaro F., Mezzatesta M., Mugnaioli C., Perilli M., Stefani S.,
Amicosante G., Rossolini G.M., Toniolo A.: Trends in production of extended-spectrum β-lactamases among enterobacteria
of medical interest: Report of the Second Italian Nationwide
Survey. J. Clin. Microbiol., 2006, 44(5), 1659-1664.
25. Spanu T., Luzzaro F., Perilli M., Amicosante G., Toniolo A., Fadda G. and The Italian ESBL Study Group:
Occurrence of extended-spectrum β-lactamases in
members of the family Enterobacteriaceae in Italy: implications for resistance to β-lactams and other antimicrobial drugs. Antimicrob. Agents Chemother., 2002, 46(1),
196-202.
Adres do korespondencji:
Zakład Diagnostyki Mikrobiologicznej
ul. Waszyngtona 15a
15-276 Białystok