Streszczenie pracy

Justyna Mazurek
Rozprawa doktorska: Podłoże genetyczne lekooporności u komensalnych Escherichia coli
izolowanych od zdrowych zwierząt, w trakcie prewencyjnej antybiotykoterapii i po jej
zakończeniu.
Streszczenie pracy
Antybiotykooporność u bakterii jest globalnym problemem zdrowia publicznego.
Zakłady hodowli trzody chlewnej należą do szczególnych środowisk, w których efekt
ekonomiczny i cykl produkcyjny wymuszają periodyczne stosowanie antybiotyków. Zatem
komensalna flora jelitowa trzody chlewnej jest istotnym rezerwuarem cech opornych. W
dążeniu do pełnego zrozumienia zagrożeń wynikających z możliwości transferu bakterii
opornych, od produktów spożywczych pochodzenia zwierzęcego do człowieka, istotne jest
poznanie zróżnicowania i stopnia rozpowszechnienia genetycznych determinant oporności na
antybiotyki wśród komensalnych Escherichia coli od trzody chlewnej.
Materiał do badań pochodził z zakładu hodowli trzody chlewnej, w którym młode
zwierzęta po odstawieniu od matki podlegały programowi leczenia metafilaktycznego.
Program ten realizowany był w okresie ok. 50 dni i obejmował antybiotykoterapię złożoną z
amoksycykliny, trimetoprimu, i sulfonamidów. Próbki kału pobrano od 4 grup warchlaków,
na różnym etapie realizacji programu metafilaktyki oraz od dwóch grup dorosłych zwierząt
(loch i macior) będących 10 i 18 tygodni po zakończonej metafilaktyce. Od każdego z
badanych zwierząt pobrano jedną próbkę. Próbki posiewano na podłoża selekcyjne a
następnie identyfikowano biochemicznie E. coli. Po identyfikacji wybierano losowo jedną
reprezentatywny izolat dla osobnika. Utworzono zbiór liczący łącznie 382 izolaty. W
pierwszym etapie badań przeprowadzono analizy wrażliwości szczepów na 11 antybiotyków.
Dla każdego z testowanych antybiotyków oznaczono minimalne stężenia hamujące wzrost
badanych szczepów (MIC) i w oparciu o epidemiologiczne wartości odcięcia (ang. cut-off)
określono liczbę opornych E. coli. Oporność na antybiotyki wykazano zarówno wśród
szczepów od zwierząt w trakcie antybiotykoterapii jak i po jej zakończeniu, i dotyczyła ona
najczęściej: sulfametoksazolu, trimetoprimu, ampicyliny oraz streptomycyny i tetracykliny.
Oporność na cefalosporyny i chinolony występowała z niską częstością. Większość szczepów
(81%) wykazywała wielolekooporność. W kolejnym etapie badań, wykorzystując metodę
PCR, poszukiwano 26 genów związanych z zidentyfikowaną opornością fenotypową. Wśród
382 szczepów stwierdzono obecność
genu oporności na ampicylinę: blaTEM-1, a jego
rozpowszechnienie korelowało z częstością fenotypowej oporności na ten antybiotyk.
Wykryto obecność dwóch genów oporności na streptomycynę: aadA1 oraz strA/B. Gen
aadA1 występował częściej, a liczne szczepy niosły oba geny. Zidentyfikowano cztery geny
oporności na tetracyklinę tetA, tetB, tetC, tetM. Najczęściej identyfikowanym genem był gen
tetA, następnie tetC i tetB. W licznych szczepach występowały dwa geny jednocześnie.
Wykryto cztery geny związane z opornością na trimetoprim: dfrA1, dfrA5, dfrA7, dfrA12.
Gen dfrA1 przeważał liczebnie nad pozostałymi genami dfrA wśród szczepów od
warchlaków.
W
licznych
szczepach
od
każdej
grupy
zwierząt
stwierdzono
współwystępowanie od 2 do 3 genów dfrA. Oporności na sulfametoksazol była związana z
genami: sul1, sul2, sul3. Gen sul3 był równomiernie rozpowszechniony wśród szczepów w
każdej grupie zwierząt, a sul1 występował częściej wśród E. coli od warchlaków, niż u
dorosłych zwierząt. Liczne szczepy od zwierząt w trakcie antybiotykoterapii zawierały więcej
niż jeden gen sul. W nielicznych szczepach od warchlaków stwierdzono obecność genów
oporności na chinolony: qnrS i qnrB.
W kolejnym etapie badań identyfikowano obecność integronów klasy 1 i 2.
Stwierdzano występowanie zarówno pełnych integronów klasy 1 jak i ich fragmentów
(nietypowe integrony klasy 1- bez kaset genowych i/lub genów końca 3’). Pełne integrony
klasy 1 częściej występowały u szczepów od warchlaków i zawierały 4 zestawy kaset
genowych: dfrA1-aadA1; aadA1; dfrA12-aadA2; dfrA7. Nietypowe integrony klasy 1 były
identyfikowane częściej wśród szczepów od zwierząt po zakończeniu metafilaktyki. W
integronach klasy 2 zidentyfikowano dwa zestawy kaset genowych: dfrA1-sat2-aadA1 oraz
estX- sat2-aadA1. Szczepy niosące oba typy integronów częściej pochodziły od zwierząt w
trakcie antybiotykoterapii.
W dalszych badaniach obejmujących analizy transpozonów, regionów wspólnych
ISCR (ang. common region) i plazmidów, zbiór szczepów ograniczono do 58
E. coli
reprezentatywnych zarówno pod względem obecności wielu determinant oporności
fenotypowej i genotypowej jak i pod względem pochodzenia od zwierząt będących w trakcie i
po zakończeniu programu metafilaktyki. Obecność transpozonów 7 (Tn7) i 21 (Tn21) oraz
regionów wspólnych ISCR identyfikowano w oparciu o metodykę wykorzystującą reakcje
PCR. Częstość występowania Tn21 była wyższa niż Tn7 w obu grupach zwierząt (p=0,0001
oraz p=0,0140). Ponadto, zarównoTn21 jak i Tn7 występowały częściej u szczepów od
zwierząt po zakończeniu antybiotykoterapii. Spośród poszukiwanych 3 typów regionów
wspólnych ISCR1, ISCR2, ISCR3 wykazano obecność regionu ISCR2. Występował on
częściej u szczepów od zwierząt w trakcie antybiotykoterapii niż po jej zakończeniu (p=
0,0017).
Plazmidy charakteryzowano określając ich wielkość, przynależność do grupy
niezgodności oraz zdolność do transferu koniugacyjnego. Stwierdzono występowanie
plazmidów o zróżnicowanej wielkości (100 - 1.5 kpz). U szczepów od zwierząt w trakcie
antybiotykoterapii najczęściej identyfikowano od 2 do 4 plazmidów, a 1 lub 2 plazmidy
charakteryzowały większość E. coli od zwierząt po antybiotykoterapii. W zbiorze 58
szczepów zidentyfikowano 11 typów replikonów odpowiadających plazmidowym grupom
niezgodności Inc: FIA, FIB, FIC, FIIA oraz K, HI1, I1, Y, P, T, B/O. Do najczęściej
identyfikowanych należały replikony plazmidowe należące do grupy niezgodności F: w tym
FIB,
FIIA,
następnie
K
oraz
I1.
W
poszczególnych
szczepach
stwierdzano
współwystępowanie replikonów różnych grup niezgodności. Wykazano występowanie 31
różnych złożeń replikonów świadczących o licznych zdarzeniach rekombinacji między
plazmidami. Większość spośród charakteryzowanych plazmidów wykazywała zdolność do
koniugacyjnego transferu. Dowodzi to, że w większości były to plazmidy koniugacyjne i
mobilizowane, ponieważ w komórkach transkoniugantów stwierdzano profile plazmidowe w
niewielkim stopniu uproszczone w porównaniu do profili zidentyfikowanych w komórkach
szczepów dawców. Dla wszystkich otrzymanych transkoniugantów określono wartości MIC
antybiotyków, zbadano obecność genów oporności, oraz integronów klasy1 i 2, a takżeTn7 i
Tn21 i regionu ISCR2. Integrony klasy 1 i 2, a także Tn7 i Tn21 oraz ISCR2 były
przekazywane do szczepu biorcy E. coli J53 NalR z wysoką efektywnością. Wysoką
efektywność transferu wykazano dla oporności na sulfametoksazol, tetracyklinę, ampicylinę i
streptomycynę. W przypadku oporności na trimetoprim efektywność przenoszenia genów
dfrA, w wyniku koniugacji, była niższa w porównaniu do genów związanych z opornością na
inne rozpatrywane antybiotyki. Często obserwowano, że transkoniugant był wrażliwy na
trimetoprim chociaż w jego komórkach stwierdzono obecność genów dfrA, zarówno
związanych ze strukturą integronu klasy1 i/lub 2, jak i występujących poza integronami.
Dowodziło to, że oporność wykazana w komórkach dawców była związana z genami innymi
niż badane, umiejscowionymi na plazmidzie niepodlegającym transferowi koniugacyjnemu
lub na chromosomie. W komórkach transkoniugantów opornych na trimetoprim stwierdzano
częste występowanie kasety drfA1 w strukturze integronów klasy 1 i/lub 2 oraz różne złożenia
genów dfrA poza strukturami integronowymi. W celu określenia, które z genów dfrA są
związane z fenotypem oporności wykonano analizy transkrypcji na poziomie cDNA z
wykorzystaniem Real-Time PCR dla transkoniugantów, a następnie szczepów dawców.
Wyniki wykazały, że oporność na trimetoprim jest związana z genami dfrA12, dfrA5 lub
dfrA7 umiejscowionymi poza strukturami integronów. Brak zdolności do ekspresji kasety
genowej drfA1 w strukturze integronowej był dość nieoczekiwany tym bardziej, że takie
właśnie struktury powszechnie uważane są za podstawowe dla ekspresji fenotypu oporności
na trimetoprim u szczepów od zwierząt. Analizy ekspresji rozszerzono o geny dfrA
występujące u szczepów dawców i wyniki były analogiczne do uzyskanych dla
transkoniugantów. Przeprowadzono też analizy sekwencji DNA regionów promotorowych dla
kaset genowych integronów klasy 1 u badanych szczepów. Ujawniły one występowanie
słabych promotorów Pc oraz promotora pomocniczego P2 defektywnego pod względem
sekwencji bazowej GGG, co może tłumaczyć brak transkrypcji kaset genowych w tych
integronach.