Analiza ekspresji genów zegara biologicznego w męskim układzie

AUTOREFERAT ROZPRAWY DOKTORSKIEJ
Analiza ekspresji genów zegara biologicznego w męskim układzie
rozrodczym ssaków
mgr Adam Neumann
Zakład Fizjologii Zwierząt, Instytut Zoologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski
Promotor:
dr hab. Piotr Bębas
Recenzenci: prof. dr hab. Ewa Bartnik
prof. dr hab. Barbara Bilińska
Zegar biologiczny to mechanizm, który pozwala organizmom odmierzać upływ
czasu w oparciu o cykliczne zmiany natężenia czynników środowiskowych, głównie światła.
Jego działanie objawia się w formie generowania i kontroli rytmów biologicznych, które
obserwujemy w organizmie na różnych poziomach złożoności – od molekularnej, poprzez
komórkową, w działaniu tkanek i narządów, aż po zmieniający się cyklicznie behawior.
Zgodnie z powszechnie przyjmowaną koncepcją, zegar biologiczny składa się z trzech
elementów – (1) receptorów powiązanych szlakami wejścia z (2) oscylatorem, który (3)
szlakami wyjścia łączy się z efektorami. Pierwszy z elementów odpowiada za odbiór informacji
ze środowiska od tzw. dawcy czasu, najczęściej światła. Informacja ta jest przetwarzana przez
drugi z elementów, czyli oscylator, który na jej podstawie generuje rytmy biologiczne,
równocześnie synchronizując je do zmian zachodzących z środowisku; tym samym
optymalizuje przebieg procesów biologicznych, które odbędą się w okresie doby najbardziej
korzystnym do ich realizacji. Trzeci element zegara biologicznego pełni rolę wykonawczą,
gdyż odpowiada za przekazanie informacji tworzonych w oscylatorze do efektorów, w obrębie
których realizowany jest proces rytmiczny. Zegar biologiczny ssaków to złożony mechanizm,
na który składa się wiele oscylatorów, lokalizowanych w różnych narządach. Oscylator
znajdujący się w mózgu, w jądrach nadskrzyżowaniowych podwzgórza, nazywany jest
oscylatorem centralnym (lub zegarem centralnym), a oscylatory w innych narządach określane
są mianem peryferycznych (lub zegarów peryferycznych). Niezależnie od położenia w
organizmie, mechanizm każdego oscylatora jest bardzo podobny. Tworzy go grupa białek,
które regulują ekspresję własnych genów, zwanych genami zegara biologicznego. Większość z
nich to czynniki wpływające na ekspresję innych genów, zwanych genami kontrolowanymi
przez zegar. Rytmiczna ekspresja genów zegara: Per1, Per2, Cry1, Cry2, Bmal1 i Clock oraz
cykliczne zmiany poziomu kodowanych przez nie białek są podstawowym kryterium
wykorzystywanym do identyfikacji zegarów peryferycznych. Funkcjonowanie centralnego
zegara biologicznego ssaków, jest dobrze udokumentowane, podobnie jak zegarów obecnych
w wątrobie, płucach, nerkach i narządach przewodu pokarmowego. Przedmiotem dyskusji
pozostaje jednak obecność i działanie zegara peryferycznego w narządach męskiego układu
rozrodczego ssaków. W literaturze stawiane są hipotezy, że zegar taki prawdopodobnie może
regulować procesy fizjologiczne charakterystyczne dla tego układu, takie jak różnicowanie oraz
dojrzewanie komórek płciowych i somatycznych, czy produkcja hormonów płciowych, a także
związany z nią metabolizm steroidów. Zaangażowane w regulacje tych procesów są m.in.
receptor androgenowy, białko StAR warunkujące transport steroidów przez błony
mitochondriów i tym samym produkcję testosteronu oraz aromataza – enzym odpowiedzialny
za przekształcanie testosteronu w estrogeny. Dodatkowo, istnieją dane literaturowe wskazujące
na wpływ zmian ekspresji
genów zegara biologicznego (najczęściej jej zaburzenia) na
aktywność czynników odpowiedzialnych za rozwój nowotworów w męskim układzie
rozrodczym ssaków. Także receptor androgenowy pełni istotną rolę w powstawaniu tych
nowotworów. Ponadto, procesem który wpływa zarówno na funkcjonowanie zegara
biologicznego, jaki i przebieg procesów prowadzących do transformacji nowotworowej jest
starzenie organizmu.
Biorąc pod uwagę powyższe fakty, sformułowałem cztery hipotezy badawcze, których
słuszność weryfikowałem podczas badań. Według pierwszej, w narządach męskiego układu
rozrodczego myszy prawdopodobnie zlokalizowany jest oscylator, którego aktywność wyraża
się rytmiczną ekspresją genów zegara biologicznego oraz genów potencjalnie kontrolowanych
przez zegar, których ekspresja jest niezbędna dla prawidłowego funkcjonowania tego układu.
Założyłem, że aktywność tego oscylatora może zmieniać się wraz z wiekiem zwierząt, co
stanowiło treść drugiej z weryfikowanych hipotez. Trzecia hipoteza zakładała istnienie
prawdopodobnego związku między transformacją nowotworową komórek śródmiąższowych
jąder (Leydiga) myszy i działaniem aktywnego w nich oscylatora biologicznego. Z kolei
możliwy wpływ zegara biologicznego oraz efekt, jaki wywiera na jego działanie starzenie
organizmu, podczas regulacji stężenia hormonów płciowych w krwi samców, stanowił treść
czwartej hipotezy.
Słuszność postawionych hipotez określiłem realizując cele, spośród których pierwszym
było ustalenie, czy w narządach męskiego układu rozrodczego (jądrach, najądrzach – głowach,
trzonach i ogonach tych narządów,, nasieniowodach i pęcherzykach nasiennych) myszy
szczepu C57BL/6J w różnym wieku (10, 60 i 105 tygodniowych) zachodzi rytmiczna ekspresja
genów zegara biologicznego (Per1, Per2, Cry1, Cry2, Bmal1 i Clock), genu receptora
androgenowego (AR) i genów kodujących białka związane z metabolizmem steroidów,
aromatazy (Cyp19) i StAR. Do realizacji tego zadania zastosowałem metodę ilościowego
pomiaru liczby kopii transkryptów (qRT-PCR) w puli całkowitego RNA izolowanego z
wymienionych wyżej narządów. Kolejnym celem było zbadanie, czy w hodowanych in vitro
komórkach Leydiga: linii immortalizowanej TM3 i dwóch linii nowotworowych MLTC-1 oraz
I-10, w których indukowałem i synchronizowałem aktywność oscylatora, zachodzi cykliczna
ekspresja genów zegara biologicznego oraz AR, Cyp19 i StAR. Moim celem było także
ustalenie, czy poziom białka receptora androgenowego zmienia się rytmicznie w ciągu doby na
terenie jąder myszy w różnym wieku, w różnych populacjach komórek linii płciowej oraz w
komórkach Leydiga, do czego wykorzystałem metodę immunohistochemiczną. Także w
komórkach Leydiga hodowanych in vitro postanowiłem zbadać dobowe zmiany poziomu
białka receptora androgenowego oraz jego lokalizacji wewnątrzkomórkowej, wykorzystując
metodę immunocytochemiczną i Western Blot. Celem określenia, czy stężenie hormonów
płciowych – testosteronu, 5-α dihydrotestosteronu i estradiolu zmienia się rytmicznie w ciągu
doby w surowicy krwi samców 10, 60 i 105 tygodniowych, wykorzystałem testy ELISA.
Wyniki przedstawione w mojej rozprawie doktorskiej wskazują na rytmiczne
(dobowe) zmiany ekspresji genów zegara biologicznego, receptora androgenowego,
aromatazy i genu StAR w większości narządów męskiego układu rozrodczego myszy. Są
zatem silnym dowodem wskazującym na funkcjonowanie oscylatora biologicznego, w
komórkach budujących te narządy. Wynik ten sugeruje również, że ekspresja genów AR,
Cyp19 i StAR na poziomie transkrypcji może być kontrolowana przez zegar biologiczny.
Jednocześnie nie zaobserwowałem rytmicznych zmian poziomu białka receptora
androgenowego i aromatazy na terenie komórek budujących jądra myszy: w spermatogoniach
spermatocytach, spermatydach, komórkach Leydiga, a także w plemnikach. Z kolei, w
komórkach Leydiga hodowanych in vitro zaobserwowałem cykliczną ekspresję genów Per1,
Per2, Cry1, Bmal1, oraz genów potencjalnie kontrolowanych przez zegar: AR i Cyp19.
Jednak profil dobowej ekspresji, a także jej poziom charakterystyczne dla komórek
nowotworowych (linii MLTC-1 i I-10) różnią się od tych, cechujących komórki
immortalizowane (linii TM3), co może wskazywać na wpływ transformacji nowotworowej na
działanie endogennego oscylatora biologicznego w komórkach Leydiga myszy. Także poziom
białka receptora androgenowego, zmienia się rytmicznie w komórkach TM3, MLTC-1 oraz I10, a profil tych zmian jest inny w komórkach immortalizowanych i nowotworowych, co
może wskazywać na wpływ transformacji nowotworowej na ten proces – prawdopodobnie
pośrednio, poprzez efekt jaki ona wywiera na oscylator molekularny, aktywny w tych
komórkach. Zaobserwowałem także niewielkie dobowe różnice między ilością białka
receptora androgenowego na terenie cytoplazmy i w jądrach komórkowych badanych przeze
mnie komórek Leydiga hodowanych in vitro.
Starzenie zwierząt ma wpływ na ekspresję genów zegara biologicznego, receptora
androgenowego, aromatazy i StAR w większości narządów męskiego układu rozrodczego, co
ma wyraz w spadku amplitudy rytmów wyrażonych zmianami ilości transkryptów tych genów
(aż do zaniku oscylacji), a także w zmniejszeniu całkowitego ich poziomu podczas doby.
Starzenie samców ma niewielki wpływ na zmiany poziomu białek receptora androgenowego i
aromatazy w jądrach (w gonadach zwierząt 60 tygodniowych stwierdzono wyższy poziom
receptora androgenowego, a poziom aromatazy w jądrach u myszy z każdej badanej grupy
wiekowej był podobny). Ponadto w swojej pracy wskazuję, że w surowicy badanych myszy
występują rytmy zmian stężeń hormonów płciowych: testosteronu, 5-α dihydrotestosteronu i
estradiolu, których dobowe profile zmieniają się z wiekiem zwierząt. Poziom 5-α
dihydrotestosteronu najwyższy jest u osobników 60 tygodniowych, a najniższy u 10
tygodniowych, z kolei poziom testosteronu w surowicy najwyższy jest u zwierząt 10
tygodniowych i z wiekiem spada. Z kolei stężenie estradiolu wzrasta z wiekiem zwierząt.
Podsumowując, w swojej rozprawie doktorskiej przedstawiłem argumenty
wskazujące, że na terenie męskiego układu rozrodczego myszy funkcjonuje zegar
biologiczny, którego aktywność wyraża się rytmiczną ekspresją genów zegara biologicznego,
a także genów potencjalnie kontrolowanych przez zegar: AR, Cyp19, StAR, kluczowych dla
prawidłowego funkcjonowania tego układu. Także w warunkach in vitro, w komórkach
Leydiga zaobserwowałem rytmiczną ekspresję genów zegara biologicznego i genów
potencjalnie przez niego kontrolowanych, jak również rytmiczne zmiany poziomu białka
receptora androgenowego, co wskazuje na funkcjonowanie zegara biologicznego w tych
komórkach. Starzenie wywiera wpływ na funkcjonowanie zegara biologicznego obecnego na
terenie męskiego układu rozrodczego myszy, a także na potencjalnie kontrolowane przez
niego procesy, takie jak produkcja hormonów płciowych.