pobierz

Acta Haematologica Polonica 2011, 42, Nr 1, str. 63–73
PRACA POGLĄDOWA – Review Article
MAŁGORZATA ZAJĄC, KRZYSZTOF GIANNOPOULOS
Znaczenie ekspresji nukleofosminy i jej mutacji w ostrej białaczce
szpikowej
Nucleophosmin and its mutations in acute myeloid leukemia
Samodzielna Pracownia Hematoonkologii Doświadczalnej
Kierownik: dr hab. Krzysztof Giannopoulos
STRESZCZENIE
Nukleofosmina (NPM) jest fosfoproteiną, wykazującą stałą aktywność ruchową między jądrem, a cytoplazmą. Od
czasu pierwszej publikacji Faliniego, opisującej mutacje jej genu (NPM1), jako najczęściej występującą aberrację
u chorych na ostrą białaczką szpikową z prawidłowym kariotypem (AML-NK), wiedza na temat NPM została znacznie pogłębiona. Zmutowana postać NPM występuje u około 30% pacjentów chorych na AML. Mutacje NPM są zazwyczaj znajdowane w eksonie 12 genu, prowadząc do ektopowej, cytoplazmatycznej ekspresji białka NPM z powodu wytworzenia dodatkowego motywu NES (nuclear export signal) i utraty reszt tryptofanowych. W 2008 roku
AML z mutacją nukleofosminy została tymczasowo dodana do klasyfikacji WHO jako nowa jednostka nosząca charakterystyczne cechy genetyczne, patologiczne i kliniczne. Szczególne znaczenie ma fakt, że mutacje NPM1 bez
współistniejącej mutacji FLT3-ITD (FMS-like tyrosine kinase 3- internal tandem duplication) identyfikują grupę chorych AML-NK z korzystnym rokowaniem.
SŁOWA KLUCZOWE: Nukleofosmina – Ostra białaczka szpikowa – Mutacje NPM – Leukemogeneza
SUMMARY
Nucleophosmin (NPM) is a phosphoprotein, which demonstrates a constant shuttling activity between the nucleus
and cytoplasm. Since the first publication of Falini et al., in which mutations in NPM1 gene have been described as
the most often genomic aberration occurring in patients with acute myeloid leukemia with normal karyotype (AMLNK), knowledge of the NPM has been significantly deepened. Mutated form of NPM (NPMmut) occurs in
approximately 30% of AML patients. Mutations are typically found in exon 12 of the gene, leading to ectopic,
cytoplasmic expression of the NPM protein due to generation an additional NES (nuclear localization signal) motif
and loss of tryptophans residues. In 2008, the AML with NPM mutations were added to the WHO classification as a
new entity bearing the distinctive genetic, pathological and clinical features. Of particular importance is the fact that
mutations in NPM1 without concominant FMS-like tyrosine kinase 3-internal tandem duplication (FLT3-ITD)
mutations identifies a group of AML-NK patients with favorable prognosis.
KEY WORDS: Nucleophosmin – AML – NPM mutations – Leukemogenesis
Ostra białaczka szpikowa (AML) jest jednym z najczęstszych typów białaczek występujących
u ludzi dorosłych. Charakteryzuje się niekorzystnym rokowaniem, a długotrwałe remisje osiągane są
tylko w około 30% przypadków. Kariotyp dostarcza najważniejszych informacji rokowniczych,
niemniej jednak u 40–50% chorych nie występują żadne aberracje chromosomowe (NK– normal
karyotype). Niedawno u pacjentów AML-NK odkryto pierwszy molekularny marker mający znaczenie
prognostyczne; mutacja dla genu NPM1 została opisana, jako charakterystyczna dla dużej grupy
pacjentów z AML-NK.
64
M. ZAJĄC, K. GIANNOPOULOS
Struktura genu i białka nukleofosminy
Gen NPM1 zawiera 12 eksonów i w organizmie ludzkim znajduje się w chromosomie 5, prążku 35
ramienia długiego (5q35) [1]. Wyodrębniono 3 alternatywne warianty obróbkowe (Rycina 1), które
kodują odpowiednio 3 izoformy białka NPM: B23.1 (NP_002511.1), B23.2 (NP_954654.1) oraz B23.3.
(NP_001032827.1). Izoforma B23.1 zawierająca eksony 1–9 i 11–12 (NM_002520.6) składa się z 294
aminokwasów. Jest to białko powszechnie występujące w organizmie ludzkim, jej lokalizacja w
komórce jest ograniczona do jąderka [2]. Izoforma B23.2 zawierająca eksony 1–10 (NM_199185.3) jest
skróconą formą B.23.1, w której brakuje ostatnich 35 aminokwasów końca karboksylowego
(zawierających domenę odpowiedzialną za wiązanie w jąderku). Ekspresja białka B23.2 w zdrowych
tkankach ludzkich jest bardzo mała. Analiza immunohistochemiczna wykazała ekspresję B23.2
w nukleoplazmie [3]. Najsłabiej została scharakteryzowana izoforma B23.3, zawierająca 265
aminokwasów, w transkrypcie której brak jest eksonów 8 i 10 (NM_001037738.2).
A. Dziki typ genu NPM1
B. Wariant 1 odpowiadający białku B23.1 (294aa)
C. Wariant 2 odpowiadający białku B23.2 (259aa)
D. Wariant 3 odpowiadający białku B23.3 (265aa)
Ryc. 1. Schemat budowy ludzkiego genu NPM1
Fig. 1. A schematic representation of the human NPM1 gene
Rysunek obrazuje schemat budowy ludzkiego genu NPM1. Prostokąty oznaczają eksony. Zakreskowane eksony nie występują
w danych wariantach obróbkowych. A) Dziki typ genu NPM1, złożony z 12 eskonów, B) najczęstszy typ wariantu obróbkowego, nie posiadający w swojej strukturze eksonu 10, odpowiadający białku B23.1, C) wariant obróbkowy, odpowiadający
białku B23.2, z brakującymi eksonami 11 i 12, D) wariant obróbkowy nie posiadający eksonów 8 i 10, odpowiadający białku
B23.3.
Łańcuch polipeptydowy NPM zawiera charakterystyczne domeny (Rycina 2), które odpowiedzialne
są za jej różnorodne funkcje [4]. Hydrofobowy koniec aminowy (N-koniec) zawiera region odpowiedzialny za oligomeryzację cząsteczki i jej aktywność opiekuńczą względem białek, kwasów nukleinowych i histonów [5, 6]. W fizjologicznych warunkach zarówno nieaktywne, jak i proliferujące komórki
w około 95% posiadają NPM w formie oligomeru [7]. Aktywność opiekuńcza zależy także od pierwszej z dwóch kwaśnych domen, zlokalizowanych w środkowej części białka [4]. Domeny te są również
istotne dla wiązania histonów [6]. Karboksylowy C-koniec przejawia aktywność rybonukleazową
i zawiera region podstawowy zaangażowany w wiązanie kwasów nukleinowych [4]. Oprócz tego obejmuje on krótkie aromatyczne odcinki z dwiema cząsteczkami tryptofanu w pozycji 288 i 290, które są
niezbędne dla utrzymania prawidłowej jąderkowej lokalizacji NPM [8]. Przyłączanie się NPM do jąderka i innych wewnątrzkomórkowych obszarów jest również uwarunkowane przez kilka miejsc fosforylacji dla kinaz cyklinozależnych (CDK1), umieszczonych w obszarze końca karboksylowego. Fosforylacja usprawnia też ruchliwość NPM pomiędzy jąderkiem, a nukleoplazmą [9]. Dwuczęściowy sygnał
NLS (nuclear localization signal) i dwie domeny NES (nuclear export signal) odgrywają kluczową rolę
w regulowaniu nukleocytoplazmatycznego ruchu NPM [10].
Znaczenie ekspresji nukleofosminy i jej mutacje w OBS
65
Ryc. 2. Struktura i funkcjonalne domeny NPM
Fig. 2. Structure and functional domains of NPM
Zaczynając od hydrofobowego N-końca, NPM posiada dwie domeny sygnału eksportu jądrowego NES (nuclear export signal), po których występuje domena wiążąca metale. Centralny odcinek białka składa się z dwóch kwaśnych domen oraz
dwóch domen sygnału lokalizacji jądrowej NLS (nuclear localization signal). Karboksylowy koniec-C złożony jest z regionu
podstawowego oraz regionu aromatycznego, który zawiera dwie reszty tryptofanowe i jest swoisty dla izoformy B23.1.
Funkcje NPM
NPM jest powszechnie występującą, wysoce konserwatywną fosfoproteiną o masie cząsteczkowej
37kDa. W warunkach fizjologicznych jej występowanie ograniczone jest przede wszystkim do jąderka,
ale wykazuje też stałą zdolność kursowania między jądrem, a cytoplazmą [11, 12]. Mobilność NPM
oraz jej wewnętrzna aktywność RNA-zy [13] sprawia, że bierze ona udział w wielu procesach komórkowych. Odgrywa ona kluczową rolę w przetwarzaniu posttranskrypcyjnym rRNA (rybosomalny RNA)
i składaniu rybosomów [13], przyczyniając się tym samym do stymulacji wzrostu i proliferacji komórki. Podstawową rolą NPM jest pośrednictwo w jądrowym eksporcie rybosomalnego białka L5/5S rRNA
przez mechanizm zależny od CRM-1 [14]. Kolejną funkcją NPM jest zdolność do wiązania kwasów
nukleinowych [15], przetwarzanie cząsteczek pre-RNA [16] i rola białka opiekuńczego, blokującego
agregację białek w jąderku podczas tworzenia rybosomów [17]. NPM utrzymuje stabilność genomu
[18], kontroluje mechanizmy naprawy DNA [19] i duplikację centrosomów podczas mitozy [20]. Inaktywacja NPM prowadzi do nieograniczonej duplikacji centrosomów i niestabilności genomu [21]. NPM
chroni więc przed hiperamplifikacją centrosomów, a w konsekwencji przed zwiększonym ryzykiem
transformacji nowotworowej. NPM reguluje również odpowiedź apoptotyczną na stres i stymulację
bodźcami onkogennymi [22].
NPM oddziałuje z wieloma białkami komórkowymi, między innymi z supresorami nowotworowymi: białkami p53 i ARF. Najważniejszy, uniwersalny supresor nowotworowy p53 jest białkiem zapobiegającym proliferacji i przeżyciu komórek noszących nieodwracalne zniszczenia genetyczne lub charakteryzujących się wysoką niestabilnością genomu [23]. NPM może modulować aktywność i stabilność p53. Bodźce wywołujące stres komórkowy niszczą jąderkową integralność NPM i powodują jej
przemieszczenie do nukleoplazmy, prowadząc do jednoczesnej aktywacji p53 [24]. Ponadto NPM
wzmacnia stabilność p53 przez wiązanie się i hamowanie MDM2 [25].
NPM jest konieczna dla odpowiedniej, jąderkowej lokalizacji, jak i stabilności ARF [26]. W warunkach fizjologicznych NPM wraz z ARF zlokalizowane są w jąderku, gdzie formują kompleksy
o dużej masie cząsteczkowej [27]. NPM chroni ARF przed degradacją: poprzez związek z NPM, ARF
przyjmuje stabilną strukturę uniemożliwiającą degradację w proteasomie [28]. W odpowiedzi na stres
komórkowy NPM i ARF ulegają przemieszczeniu do nukleoplazmy, współzawodnicząc o miejsce wią-
66
M. ZAJĄC, K. GIANNOPOULOS
zania z MDM2, co powoduje silną aktywację p53 [29]. ARF może blokować cykl komórkowy przez
interakcje z NPM i MDM2 [29].
Charakterystyka mutacji NPM1
Gen NPM1 ulega translokacji w różnych typach chłoniaków. Powstałe w ten sposób chimeryczne
geny tworzą białka fuzyjne: NPM-ALK, NPM-MLF1 i NPM-RARα, które wiążą się z prawidłową postacią NPMwt (NPM wild type), prowadząc do jej nieprawidłowej cytoplazmatycznej lokalizacji [30].
W ostatnim czasie zwrócono uwagę na występowanie mutacji NPM1 u chorych na AML również skutkujące zmianą lokalizacji NPM [31].
Mutacja NPM1 wydaje się być swoista dla AML i nie obserwowano jej w innych nowotworach
[31]. Sporadycznie została wykryta w przewlekłych mieloproliferacjach (MPN - myeloproliferative
neoplasms), które szybko ulegały progresji w AML i prawdopodobnie reprezentowały wczesne stadia
AML głównie M4 lub M5 ze znacznym różnicowaniem monocytowym [31]. Niewiele informacji jest
również dostępnych na temat mutacji NPM1 w zespołach mielodysplastycznych (MDS), gdzie wykryto
jej obecność jedynie w 5,2% przypadków (2/38 chorych) [32]. Ostatnie badania dużej grupy chorych
z MDS wykazały jej obecność na poziomie 4% [33]. Mutacja NPM1 była ograniczona do grupy RAEB
(refractory anemia with excess blasts). Przypadki klasyfikowane jako MDS/MPN miały największą
częstość mutacji NPM1 (15%), co może sugerować rolę NPM w patogenezie przewlekłych nowotworów mieloproliferacyjnych. Izolowana mutacja NPM1 nie powodowała transformacji MDS do ostrej
białaczki szpikowej, natomiast współwystępowanie mutacji FLT3-ITD (FMS-like tyrosine kinase 3internal tandem duplication) powodowało transformację blastyczną [33].
Występujące w AML mutacje NPM1 są heterozygotyczne, więc allel dzikiego typu jest zachowany.
Mutacje NPM1 ograniczają się przede wszystkim do eksonu 12 z kilkoma rzadkimi mutacjami w eksonie 9, 10 i 11 [34, 35, 36]. Zidentyfikowano około 50 wariantów mutacji [37]. Najczęściej występująca
mutacja, nazwana mutacją A jest duplikacją tetranukleotydu TCTG i stanowi 75% do 80% przypadków
[31]. Mutacje B i D są obserwowane odpowiednio u około 10% i 5%, pozostałe mutacje są bardzo
rzadkie [31].
Mutacje NPM1 występują u około 7,5% dzieci z AML [38] i najczęściej są to mutacje inne niż typu
A [39]. Częstość występowania mutacji NPM1 wzrasta u dorosłych stanowiąc 25–35% wszystkich chorych na AML. U pacjentów z prawidłowym kariotypem (AML-NK) ich obecność waha się w granicach
45,7–63,8% [40]. Znacznie rzadsze jest występowanie mutacji we wtórnej postaci AML po MPN/MDS
oraz w AML związanej z leczeniem [31].
Mutacje NPM1 zmieniają mobilność NPM
Jądrowo-cytoplazmatyczna aktywność NPM stanowi podstawę jej prawidłowego działania, reguluje
między innymi procesy biogenezy rybosomów, czy duplikacji centrosomów [14, 21]. Proces ten zależy
od dwóch funkcjonalnych domen: NLS oraz motywów NES. NLS powoduje przemieszczenie NPM
z cytoplazmy do nukleoplazmy, skąd przy udziale domeny wiążącej jąderko (zawierającej dwie reszty
tryptofanowe w pozycji 288 i 290) przechodzi do jąderka. Motywy NES oddziałują z kolei z receptorowym białkiem CRM1, przez co odpowiadają za eksport NPM do cytoplazmy [10].
Chociaż NPMwt jest białkiem przemieszczającym się między jąderkiem, a cytoplazmą, jej ekspresja ograniczona jest do jąderka. Wszystkie mutacje NPM1 skutkują przesunięciem ramki odczytu, prowadząc do zmian w obrębie karboksylowego końca tego białka, a w konsekwencji odpowiadają za jej
nieprawidłową cytoplazmatyczną lokalizacją w komórkach białaczkowych [41]. Zmiany spowodowane
przez mutację powodują: 1) pojawienie się nowego motywu NES, który wzmacnia eksport zależny od
CRM1 oraz 2) utratę reszt tryptofanowych w pozycji 288 i 290 (lub samej reszty 290), obniżających
zdolność wiązania się NPM do jąderka. Badania Faliniego i wsp. [41] ujawniły, że powyższe zmiany są
Znaczenie ekspresji nukleofosminy i jej mutacje w OBS
67
niezbędne dla zakłócenia ruchu NPM w komórkach białaczkowych. Zmutowana postać NPM (NPMmut) ma utrudnioną zdolność wiązania do jąderka z powodu częściowej lub całkowitej utraty reszt tryptofanowych. W konsekwencji znaczna część białka wędruje do nukleoplazmy, gdzie jest bardziej podatna na wiązanie do CRM1 przez dodatkowy motyw NES, generowany przez mutację. W tych okolicznościach poprzez oddziaływanie NES z CRM1, eksport białka jest bardziej skuteczny niż osłabiony
import, skutkując akumulacją NPMmut w cytoplazmie [10].
Związek NPM1 z kariotypem i innymi mutacjami
U chorych na AML mutacje NPM1 są ściśle związane z występowaniem prawidłowego kariotypu
i w zasadzie nie występują u chorych z powtarzającymi się aberracjami genetycznymi [42, 43, 44].
Występowanie nieprawidłowości chromosomowych u chorych na AML z mutacją NPM1 są znacznie
rzadsze (14%) i prawdopodobnie są wtórne ponieważ: i) wykazują podobieństwo względem typu i częstości występowania z wtórnymi zmianami chromosomowymi w grupie AML z powtarzającymi się
nieprawidłowościami genetycznymi, ii) komórki z nieprawidłowym kariotypem reprezentują klony
w populacji komórek z prawidłowym kariotypem, iii) nieprawidłowości te występowały częściej
w czasie nawrotu w grupie chorych AML-NK [40]. Zaobserwowano, że mutacje FLT3-ITD występują
dwa razy częściej w przypadkach AML-NK noszących mutacje NPM1 niż w przypadku jej braku [31,
43, 44]. MLL-PTD (mixed lineage leukemia – partial tandem duplication) rzadko współwystępują
z NPMmut [31]. Dodatkowo Dohner i Schnittger [43, 44] wykazali, że nie ma różnic w występowaniu
mutacji genów CEBPA (CCAAT/enhancer binding protein alpha), KIT i NRAS (neuroblastoma RAS
viral oncogene homolog) między pacjentami ze zmutowaną NPM1 i bez jej mutacji.
Ostatnie doniesienia wykazały również, że przypadki NPMmut są często związane z mutacjami genu IDH1 (isocitrate dehydrogenase 1) [45]. Marcucci i wsp. [46] stwierdzili, że mutacje IDH1 mogą
pogarszać rokowanie u chorych, u których stwierdza się korzystny genotyp NPM1+/FLT3-ITD-. Wyniki te nie zostały jednak potwierdzone w innych badaniach, gdzie niekorzystny efekt IDH1 występował głównie u chorych na AML bez mutacji NPM1 [47].
Charakterystyka kliniczna chorych posiadających mutacje NPM1
Występowanie mutacji NPM1 u chorych AML-NK pokazuje szerokie spektrum morfologiczne.
Najczęściej występują w typie M4 i M5 według klasyfikacji FAB [40]. Ponad 95% komórek NPMmut
nie posiada na swej powierzchni markera komórek hematopoetycznych CD34 ani CD133 [31]. Inna
charakterystyczną cechą tych mutacji jest zaangażowanie w rozwój kilku linii: mieloidalnej, monocytoidalnej, erytroidalnej i megakariocytowej, ale nie limfoidalnej, niezależnie od innych, dodatkowych
zmian genetycznych [40]. Zmutowana forma NPM jest związana z wyższą liczbą białych krwinek [43],
wyższą liczbą płytek krwi, wyższą liczbą blastów w szpiku kostnym [43, 44], która wzrasta wraz ze
współistniejącą mutacją FLT3-ITD [44] oraz zwiększoną aktywnością dehydrogenazy mleczanowej
[44]. Oprócz tego wykazano, że mutacje NPM korelują z częstszym występowaniem przerostu dziąseł
i limfadenopatią [43] oraz płcią żeńską [43, 44].
Chorych na AML z mutacją NPM1 cechuje lepsza odpowiedź na chemioterapię. Schneider i wsp.
[48] wykazali, że obecność mutacji NPM1 jest niezależnym korzystnym czynnikiem prognostycznym
dla osiągnięcia całkowitej remisji. Wrażliwość na chemioterapię jest prawdopodobnie związana ze
zmianą lokalizacji NPM do cytoplazmy. Niektórzy autorzy sugerują, że delokalizacja NPM może wiązać się z hamowaniem czynnika NF-kappaB przez cytoplazmatyczną formę NPM [49].
Wiele badań potwierdziło dobrą odpowiedź na leczenie w grupie pacjentów AML-NK wykazujących mutacje NPM1 [31 ,42, 43]. Dohner i wsp. [43] zaobserwowali najlepsze wyniki leczenia w grupie
chorych NPM1+/FLT3-ITD–, podczas gdy pacjenci noszący obie mutacje wykazywali znacznie słabszą
odpowiedź. Wyodrębniono więc nową grupę pacjentów NPM1+/FLT3-ITD– z korzystnym rokowaniem
M. ZAJĄC, K. GIANNOPOULOS
68
[42, 43, 44]. W grupie młodszych chorych (≤ 60 lat) wykazano około 60% prawdopodobieństwo uzyskania 5-letniego przeżycia [43]. Grupa chorych mających mutacje NPM1 bez współistniejącej mutacji
FLT3-ITD nie osiągała korzyści z przeszczepienia allogenicznych komórek macierzystych krwi [43,
50]. Charakterystyka mutacji NPM1 u chorych na AML została podsumowana w Tabeli 1.
Tabela 1. Charakterystyczne cechy ostrej białaczki szpikowej z mutacją genu nukleofosminy1 (NPM1)
Table 1. Characteristic features of acute myeloid leukemia with mutations of nucleophosmin1 (NPM1)
Charakterystyka kliniczna, immunofentotypowa i cytogenetyczna
chorych na ostrą białaczkę szpikową z mutacją NPM1
1.
występuje u 1/3 chorych na ostrą białaczkę szpikową
2.
ściśle związana z prawidłowym kariotypem
3.
zwykle występuje w podtypie M4 i M5 wg klasyfikacji FAB
4.
14% pacjentów posiada nieprawidłowości chromosomowe
5.
wyższa liczba białych krwinek, płytek krwi, blastów w szpiku kostnym
6.
częstsze występowanie limfadenopatii, przerostu dziąseł
7.
brak ekspresji CD34, CD133
8.
częściej występuje u kobiet
9.
dobre rokowanie przy braku współistniejącej mutacji FLT3-ITD.
(FMS-like tyrosine kinase 3- internal tandem duplication)
Rola mutacji NPM1 w procesie leukemogenezy
NPM została zakwalifikowana do nowej grupy genów, które funkcjonują zarówno jako onkogeny,
jak i nowotworowe geny supresorowe w zależności od: poziomu ekspresji, oddziaływania z innymi
cząsteczkami oraz przedziałów komórkowych w jakich się znajduje [51]. Z jednej strony, ekspresja
NPM wzrasta w odpowiedzi na stymulację mitogenami, a jej zwiększoną ilość wykrywa się w intensywnie proliferujących oraz nowotworowych komórkach. Z drugiej strony przez swoje oddziaływanie
z ARF NPM reprezentuje supresor nowotworowy, a utrata ekspresji lub funkcji NPM może przyczyniać
się do nowotworzenia [40]. Jak wspomniano wcześniej gen NPM1 koduje białko, które chociaż występuje w jąderku na stałym poziomie, posiada zdolność do ruchu między jądrem, a cytoplazmą [11]. Za
niezbędny dla leukemogenezy uważa się moment zmiany lokalizacji NPM do cytoplazmy [40, 52].
Wzrost eksportu białka do cytoplazmy prawdopodobnie zakłóca różnorodne sygnały komórkowe przez:
i) utratę funkcji (również NPMwt oddziałuje ze zmutowaną formą i jest przenoszony do cytoplazmy,
przez co nie spełnia swoich funkcji) oraz ii) nabywanie nowych funkcji (zmutowane białko NPM ulega
akumulacji w cytoplazmie, przez co może oddziaływać z innymi białkami) (Rycina 3) [53].
Bonetti i wsp. [54] opisywali, że NPM reguluje stabilność białka onkogennego c-Myc przez swoje
działanie na białko FBW7γ, część E3 ligazy zaangażowaną w ubikwitynację i proteasomalną degradację c-MYC. NPM wiąże się bezpośrednio z FBW7γ i służy jako białko opiekuńcze, które zapewnia mu
prawidłowe składanie, jąderkową lokalizację i ochrania je przed degradacją. Efekt NPM wywierany na
FBW7γ jest znaczący dla regulacji białka c-MYC, które w przypadku braku NPM zwiększa swoją ekspresję oraz ulega stabilizacji. Zmutowana NPM oddziałuje z FBW7γ i przemieszcza je do cytoplazmy
przez co sprzyja jego degradacji. W konsekwencji wzrasta poziom białka c-MYC [54]. W związku
z tym NPMmut podnosi aktywność proliferacyjną i może przyczyniać się do leukemogenezy.
Znaczenie ekspresji nukleofosminy i jej mutacje w OBS
69
Supresor nowotworowy ARF, pozytywny regulator odpowiedzi p53 na stymulację onkogenami ściśle oddziałuje z NPM. Zdolność ARF do stabilizowania p53 jest zmniejszona, gdy ARF znajduje się
w obecności NPMmut i w tych okolicznościach skutkuje to obniżonym poziomem p53, jak również
obniżoną zdolnością ARF do indukowania końca cyklu komórkowego. Cytoplazmatyczna lokalizacja
NPM może więc przyczynić się do rozwoju AML przez inaktywację ARF [27].
Kolejnym interesującym działaniem NPMmut jest jej zdolność do wiązania i hamowania kaspaz 6
i 8 w cytoplazmie komórek białaczkowych. Cytoplazmatyczna NPM swoiście hamuje aktywność proteaz związanych z apoptozą – kaspaz 6 i 8 przez bezpośrednie oddziaływanie z ich aktywnymi formami,
ale nie z niedojrzałymi prokaspazami. Zakłócenia przekazywania sygnału w drodze kaspaz przez
NPMmut mogą przyczyniać się do przeżycia komórek białaczkowych, pozwalając na ich akumulację
[55].
Nieprawidłowa aktywacja czynnika transkrypcyjnego NF-kappaB, znanego ze swojej antyapoptotycznej aktywności, została opisana w blastach białaczkowych, opornych na chemioterapię [56]. Cilloni
i wsp. [49] wykazali, że NPMmut odgrywa podstawową rolę w usprawnianiu śmierci komórek AML
przez oddziaływanie z NF-kappaB. Interesujący jest fakt, że aktywność NF-kappaB nie wykazuje różnic w grupach NPM1+/FLT3-ITD+ i NPM1+/FLT3-ITD– [49], wspierając tym samym hipotezę, że
obecność mutacji genu NPM1 jest związana z wyższą wrażliwością na chemioterapię, bez względu na
stan mutacji FLT3-ITD [48].
Ryc. 3. Hipotetyczny mechanizm prowadzący do nowotworzeni z udziałem mutacji NPM1
Fig. 3. Hypothetical mechanism leading to leukemogenesis involving the NPM1 mutation
oznacza potencjalną, nieznaną cząsteczkę lub sygnał, który współdziałając ze zmutowanym białkiem NPM (NPMmut)
może przyczyniać się do powstania białaczki
Mutacje NPM1 jako pierwotne zaburzenie prowadzące do AML
Istnieje kilka dowodów sugerujących, że mutacja NPM1 jest głównym czynnikiem powodującym
zmiany genetyczne [53]. Z wyjątkiem nielicznych przypadków zespołów mielodysplastycznych [32,
33], mutacja NPM1 pojawia się u 1/3 pacjentów z AML [31]. Mutacje NPM1 wykluczają się wzajemnie
z innymi nowotworami szpiku [57] oraz z innymi powtarzalnymi aberracjami genetycznymi [58] z wyjątkiem rzadkich przypadków podwójnych mutacji NPM1 i CEBPA [57]. Nieliczne nieprawidłowości
70
M. ZAJĄC, K. GIANNOPOULOS
chromosomowe (inne niż typowe) występują u około 14% pacjentów AML z mutacją NPM1 i są uważane za zmiany wtórne [40]. Mutacja NPM1 zwykle ulega ekspresji w całej populacji komórek białaczkowych [31], wskazując swoją kluczową rolę w transformacji nowotworowej. Jest ona stabilna podczas
trwania choroby [59], jej obecność jest wykrywana w czasie nawrotu nawet wiele lat po rozpoznaniu
[60]. Utrata mutacji jest niezwykle rzadka i czasami związana jest ze zmianą kariotypu [59]. Oprócz
tego u chorych noszących mutację NPM1 i współistniejącą FLT3-ITD, zauważono, że występowanie
mutacji NPM1 wyprzedza FLT3-ITD [42].
Jako pierwotna, genetyczna zmiana, mutacja NPM1 definiuje grupę AML z charakterystycznym
profilem ekspresji genów (obejmującym negatywną regulację CD34, CD133 i pozytywną regulację
genów HOX) [61] i swoistą sygnaturą mikroRNA (obejmującą pozytywną regulację miR-10a i miR10b) [61]. Cechy mutacji NPM1 u chorych AML-NK wykazują znaczne podobieństwo do cech pierwotnego zaburzenia np.: t(8;21), wskazując tym samym na pierwotne pochodzenie mutacji NPM1. Podobną charakterystykę wykazuje jedynie podwójna mutacja CEBPA u chorych na AML, w odróżnieniu
od innymi mutacji występujących w AML-NK uważanych za cechy wtórne [52]. Za przykład mogą
posłużyć mutacje FLT3-ITD i FLT3-TKD (tyrosine kinase domain), które są mniej stabilne i mogą zostać utracone podczas nawrotu. Niestabilność została również udowodniona mutacjom NRAS i WT1
(Wilms tumor 1 gene). Biorąc pod uwagę cechy poszczególnych mutacji takie jak: odsetek chorych
z daną mutacją, odmienną sygnaturę profilu ekspresji genów, charakterystyczny profil mikroRNA, swoistość występowania u chorych na AML, mutacja NPM1 wydaje się być najważniejszym zaburzeniem
prowadzącym do zmian genetycznych u około 60% chorych AML-NK [52]. Poza pierwotnymi zmianami genetycznymi, również wtórne wydają się odgrywać rolę w patogenezie białaczki. Brane są pod
uwagę mutacje dotyczące FLT3-ITD, FLT3-D835, NRAS, IDH1 oraz nieprawidłowości chromosomowe, które współdziałają z mutacją NPM1.
Wykrywanie mutacji NPM1
Ektopowa ekspresja NPM w cytoplazmie komórek białaczkowych jest najbardziej charakterystyczną cechą chorych AML ze zmutowaną NPM1. Z tego też względu w klasyfikacji WHO wprowadzono
synonim dla AML z mutacją NPM1 – NPM cytoplazmatycznie pozytywna AML (AML NPMc+) [52].
Barwienie immunohistochemiczne było pierwotną metodą, która ujawniła nieprawidłowe przemieszczenia NPM u chorych z AML [31]. Metoda ta w wysokim stopniu przewiduje mutacje NPM1
i może posłużyć jako zamiennik molekularnej analizy [62]. Wciąż jednak istnieją rozbieżności pomiędzy cytoplazmatyczną lokalizacją, a stanem mutacji spowodowane czynnikami technicznymi, takimi
jak sposób utrwalenia próbki czy jej odwapnienie [63].
Od chwili wykrycia mutacji NPM1 opisano wiele metod, mających na celu jej szybką i czułą detekcję.
Jedną z najczęściej używanych metod wykrycia mutacji jest analiza fragmentów (GeneScan), pozwalająca na jednoczesne oznaczenie współistniejących mutacji np. FLT3-ITD [43]. Z drugiej strony
analiza krzywych topnienia [44] czy D-HPLC (denaturing high performance liquid chromatography)
[64] wyłaniają się jako kolejne techniki skriningowe, wymagające, tak jak w przypadku analizy GeneScanem szczegółowej charakteryzacji i identyfikacji wykrytych mutacji. Opisane zostały również
takie metody jak ASO-RT-PCR (allele specific oligonucleotide real time polimerase chain reaction)
czy bardziej czuła semi-nested ASO-PCR, pozwalające na oznaczenie określonych mutacji, za pomocą
swoistych dla allelu starterów [65].
Interesującą technikę pozwalającą na wzmocnienie sygnału przez zahamowanie amplifikacji dzikiego typu genu, zaproponowali Thiede i wsp. wykorzystując zmodyfikowane nukleotydy LNA (locked
nucleic acid) [66]. Wciąż jednak najczulszą metodą pozostaje qRT-PCR (quantitative real time polymerase chain reaction), która jest w stanie wykryć mutację na poziomie 1:100 000 komórek [67].
Znaczenie ekspresji nukleofosminy i jej mutacje w OBS
71
PODSUMOWANIE
W ostatnich latach wiedza na temat mutacji NPM1 została znacznie pogłębiona. Reprezentuje ona
jedną z najczęściej występujących genetycznych zmian u chorych na AML. Mimo wielu badań opisujących zmienione funkcje zmutowanej formy NPM oraz interakcje z innymi cząsteczkami, jej wpływ na
proces leukemogenezy wciąż pozostaje niejasny. Z powodu licznych charakterystycznych cech noszonych przez chorych z tą mutacją, została ona dodana do podgrupy „AML z powtarzającymi się aberracjami genetycznymi”, jako nowa jednostka w klasyfikacji WHO. Coraz więcej dowodów sugeruje, że
mutacje NPM1 mogą być pierwotnymi zaburzeniami leżącymi u podłoża AML. Ostatnie doniesienia
informują, że mutacje te bez współistniejącej FLT3-ITD mają istotną wartość prognostyczną u chorych
AML-NK. Wydaje się, że mutacje NPM1 posiadają zarówno znaczenie rokownicze, jak i odgrywają
ważną rolę, jako czynniki predykcyjne odpowiedzi na leczenie.
PIŚMIENNICTWO
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
Chang JH, Olson MO. Structure of the gene for rat nucleolar protein B23. J Biol Chem. 1990; 265: 18227-18233.
Wang D, Umekawa H, Olson MO. Expression and subcellular locations of two forms of nucleolar protein B23 in rat
tissues and cells. Cell Mol Biol Res. 1993; 39: 33-42.
Dalenc F, Drouet J, Ader I, i wsp. Increased expression of a COOH-truncated nucleophosmin resulting from alternative
splicing is associated with cellular resistance to ionizing radiation in HeLa cells. Int J Cancer. 2002; 100: 662-668.
Hingorani K, Szebeni A, Olson MO. Mapping the functional domains of nucleolar protein B23. J Biol Chem. 2000; 275:
24451-24457.
Szebeni A, Olson MO. Nucleolar protein B23 has molecular chaperone activities. Protein Sci. 1999; 8: 905-912.
Okuwaki M, Matsumoto K, Tsujimoto M, Nagata K. Function of nucleophosmin/B23, a nucleolar acidic protein, as a
histone chaperone. FEBS Lett. 2001; 506: 272-276.
Chan PK, Chan FY, Nucleophosmin/B23 (NPM) oligomer is a major and stable entity in HeLa cells. Biochim Biophys
Acta. 1995; 1262: 37-42.
Nishimura Y, Ohkubo T, Furuichi Y, Umekawa H. Tryptophans 286 and 288 in the C-terminal region of protein B23.1 are
important for its nucleolar localization. Biosci Biotechnol Biochem. 2002; 66: 2239-2242.
Negi SS, Olson MO. Effects of interphase and mitotic phosphorylation on the mobility and location of nucleolar protein
B23. J Cell Sci. 2006; 119: 3676-3685.
Falini B, Bolli N, Liso A, i wsp. Altered nucleophosmin transport In acute myeloid leukaemia with mutated NPM1: molecular basis and clinical implications. Leukemia. 2009; 23: 1731-1743.
Borer RA, Lehner CF, Eppenberger HM, Nigg EA. Major nucleolar proteins shuttle between nucleus and cytoplasm. Cell.
1989; 56: 379-390.
Yun, JP, Chew EC, Liew CT, i wsp. Nucleophosmin/B23 is a proliferate shuttle protein associated with nuclear matrix. J.
Cell Biochem. 2003; 90: 1140-1148.
Herrera JE, Savkur R, Olson MO. The ribonuclease activity of nucleolar protein B23. Nucleic Acids Res. 1995; 23: 39743979.
Yu Y, Maggi LB Jr, Brady SN, i wsp. Nucleophosmin is essential for ribosomal protein L5 nuclear export. Mol Cell Biol.
2006; 26: 3798-3809.
Wang D, Baumann A, Szebeni A, Olson MO. The nucleic acid binding activity of nucleolar protein B23.1 resides in its
carboxyl-terminal end. J Biol Chem. 1994; 269: 30994-30998.
Savkur RS, Olson MO. Preferential cleavage in pre-ribosomal RNA by protein B23 endoribonuclease. Nucleic Acids Res.
1998; 26: 4508-4515.
Szebeni A, Olson MO. Nucleolar protein B23 has molecular chaperone activities. Protein Sci. 1999; 8: 905-912.
Colombo E, Bonetti P, Lazzerini Denchi E, i wsp. Nucleophosmin is required for DNA integrity and p19Arf protein
stability. Mol Cell Biol. 2005; 25: 8874-8886.
Lee SY, Park JH, Kim S, Park EJ, Yun Y, Kwon J. A proteomics approach for the identification of nucleophosmin and
heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C1/C2 as chromatin-binding proteins in response to DNA double-strand breaks.
Biochem J. 2005; 388: 7-15.
Okuda M. The role of nucleophosmin in centrosome duplication. Oncogene. 2002; 21: 6170-6174.
Budhu AS, Wang XW. Loading and unloading: orchestrating centrosome duplication and spindle assembly by Ran/Crm1.
Cell Cycle. 2005; 4: 1510-1514.
Ye K. Nucleophosmin/B23, a multi-functional protein that can regulate apoptosis. Cancer Biol Ther. 2005; 4: 918-23.
72
M. ZAJĄC, K. GIANNOPOULOS
23. Levine AJ. p53, the cellular gatekeeper for growth and division. Cell. 1997; 88: 323-331.
24. Kurki S, Peltonen K, Laiho M. Nucleophosmin, HDM2 and p53: players in UV damage incited nucleolar stress response.
Cell Cycle. 2004; 3: 976-979.
25. Kurki S, Peltonen K, Latonen L, i wsp. Nucleolar protein NPM interacts with HDM2 and protects tumor suppressor protein p53 from HDM2-mediated degradation. Cancer Cell. 2004; 5: 465-475.
26. Colombo E, Martinelli P, Zamponi R, i wsp. Delocalization and destabilization of the Arf tumor suppressor by the leukemia-associated NPM mutant. Cancer Res. 2006; 66: 3044-3050.
27. Bertwistle D, Sugimoto M, Sherr CJ. Physical and functional interactions of the Arf tumor suppressor protein with nucleophosmin/B23. Mol Cell Biol. 2004; 24: 985-996.
28. Goldberg AL. Protein degradation and protection against misfolded or damaged proteins. Nature. 2003; 426: 895-899.
29. Lee C, Smith BA, Bandyopadhyay K, Gjerset RA. DNA damage disrupts the p14ARF-B23 (nucleophosmin) interaction
and triggers a transient subnuclear redistribution of p14ARF. Cancer Res. 2005; 65: 9834-9842.
30. Falini B, Nicoletti I, Bolli N, i wsp. Translocations and mutations involving the nucleophosmin (NPM1) gene in lymphomas and leukemias. Haematologica. 2007; 92: 519-532.
31. Falini B, Mecucci C, Tiacci E, i wsp. Cytoplasmic nucleophosmine in acute myelogenous leukemia with normal karyotype. N. Eng. J. Med. 2005; 352: 245-266.
32. Zhang Y, Zhang M. NPM1 mutations in myelodysplastic syndromes and acute myeloid leukemia with normal karyotype.
Leuk Res. 2007; 31: 109-111.
33. Bains A. FLT3 and NPM1 mutations in myelodysplastic syndromes: Frequency and potential value for predicting progression to acute myeloid leukemia, Am J Clin Pathol. 2011; 135: 62-69.
34. Mariano AR. Cytoplasmic localization of NPM in myeloid leukemias is dictated by gain-of-function mutations that create
a functional nuclear export signal. Oncogene. 2006; 25: 4376-4380.
35. Oelschlaegel U, Koch S, Mohr B, I wsp. Rapid flow cytometric detection of aberrant cytoplasmic localization of nucleophosmin (NPMc) indicating mutant NPM1 gene in acute myeloid leukemia. Leukemia. 2010; 24: 1813-1816.
36. Albieno E. A novel mutation in the ex 11 of nucleophosmin (NPM1) gene leads to a truncated form of the protein lacking
the C-terminal NES-motif. Haematologica. 2006; 91: 237.
37. Rau R, Brown P. Nucleophosmin (NPM1) mutations in adult in adult and childhood acute myeloid leukaemia: towards
definition of a new leukaemia entity. Hematol Oncol. 2009; 27: 171-181.
38. Cazzaniga G, Lo Nigro L, Cifola I, i wsp. Simultaneous occurrence of acute myeloid leukemia with mutated nucleophosmin (NPM1). Leukemia. 2009; 23: 199-203.
39. Thiede C, Creutzig E, Reinhardt D, Ehninger G, Creutzig U. Different types of NPM1 mutations in children and adults:
evidence for an effect of patient age on the prevalence of the TCTG-tandem duplication in NPM1-exon 12. Leukemia.
2007; 21: 366-367.
40. Falini B, Nicoletti I, Martelli MF, Mecucci C. Acute myeloid leukemia carrying cytoplasmic/mutated nucleophosmin
(NPMc+ AML): biological and clinical features, Blood. 2007, 109: 874-885.
41. Falini B, Bolli N, Shan J, i wsp. Both carboxy-terminus NES motif and mutated tryptophan(s) are crucial for aberrant
nuclear export of nucleophosmin leukaemic mutants in NPMc+ AML. Blood. 2006; 107: 4514-4523.
42. Thiede C, Koch S, Creutzig E. Prevalence and prognostic impact of NPM1 mutations in 1485 adult patients with acute
myeloid leukemia (AML). Blood. 2006; 107: 4011-4020.
43. Dohner K, Schlenk RF, Habdank M, i wsp. Mutant nucleophosmin (NPM1) predicts favorable prognosis in younger
adults with acute myeloid leukemia and normal cytogenetics: interactions with other gene mutations. Blood. 2005; 106:
3740-3746.
44. Schnittger S, Schoch C, Kern W, i wsp. Nucleophosmin gene mutations are predictors of favorable prognosis in acute
myelogenous leukemia with normal karyotype. Blood. 2005; 106: 3733-3739.
45. Mardis ER, Ding L, Dooling DJ, i wsp. Recurring mutations found by sequencing an acute myeloid leukemia genome. N
Engl J Med. 2009; 361: 1058-1066.
46. Marcucci G, Maharry K, Wu YZ, i wsp. IDH1 and IDH2 gene mutations identify novel molecular subsets within de novo
cytogenetically normal acute myeloid leukemia: a cancer and leukemia group B study. J Clin Oncol. 2010; 28: 2348-2355.
47. Schnittger S, Haferlach C, Ulke M, Alpermann T, Kern W, Haferlach T. IDH1 mutations are detected in 6.6% of 1414
AML patients and are associated with intermediate risk karyotype and unfavorable prognosis in adults younger than 60
years and unmutated NPM1 status. Blood. 2010; 116: 5486-5496.
48. Schneider F, Hoster E, Unterhalt M, i wsp. NPM1 but not FLT3-ITD mutations predict early blast cell clearance and CR
rate in patients with normal karyotype AML (NK-AML) or high-risk myelodysplastic syndrome (MDS). Blood. 2009;
113: 5250-5253.
49. Cilloni D, Messa F, Rosso V, i wsp. Increase sensitivity to chemotherapeutical agents and cytoplasmatic interaction between NPM leukemic mutant and NF-kappaB in AML carrying NPM1 mutations. Leukemia. 2008; 22: 1234-1240.
Znaczenie ekspresji nukleofosminy i jej mutacje w OBS
73
50. Schlenk RF, Dohner K, Krauter J, i wsp. Mutations and Treatment Outcome in Cytogenetically Normal Acute Myeloid
Leukemia. N Eng J Med 2008; 358: 1909-1918.
51. Grisendi S, Mecucci C, Falini B, Pandolfi PP. Nucleophosmin and cancer. Nat Rev Cancer. 2006; 6: 493-505.
52. Bolli N, Nicoletti I, De Marco MF, i wsp. Born to be exported: COOH-terminal nuclear export signals of different
strength ensure cytoplasmic accumulation of nucleophosmin mutants. Cancer Res. 2007; 67: 6230-6237.
53. Falini B, Martelli MP, Bolli N, i wsp. Acute myeloid leukemia with mutated mucleophosmin (NPM1): is it a distinct
entity? Blood. 2010; 117: 1109-1120.
54. Bonetti P, Davoli T, Sironi C, Amati B, Pelicci PG, Colombo E. Nucleophosmin and its AML-associated mutant regulate
c-Myc turnover through Fbw7 gamma. J Cell Biol. 2008; 182: 19-26.
55. Leong SM, Tan BX, Ahmad BB, i wsp. Mutant nucleophosmin deregulates cell death and myeloid differentiation through
excessive caspase-6 and -8 inhibition. Blood. 2010; 116: 3286-3296.
56. Guzman ML, Neering SJ, Upchurch D, i wsp. Nuclear factor-κB is constitutively activated in primitive human acute
myelogenous leukemia cells. Blood. 2001; 98: 2301-2307.
57. Falini B, Sportoletti P, Martelli MP. Acute myeloid leukemia with mutated NPM1: diagnosis, prognosis and therapeutic
perspectives. Curr Opin Oncol. 2009; 21: 573-581.
58. Falini B, Mecucci C, Saglio G, i wsp. NPM1 mutations and cytoplasmic nucleophosmin are mutually exclusive of recurrent genetic abnormalities: a comparative analysis of 2562 patients with acute myeloid leukemia. Haematologica. 2008;
93: 439-442.
59. Chou WC, Tang JL, Lin LI, i wsp. Nucleophosmin mutations in de novo acute myeloid leukemia: the age-dependent
incidences and the stability during disease evolution. Cancer Res. 2006; 66: 3310-3316.
60. Meloni G, Mancini M, Gianfelici V, Martelli MP, Foa R, Falini B. Late relapse of acute myeloid leukemia with mutated
NPM1 after eight years: evidence of NPM1 mutation stability. Haematologica. 2009; 94: 298-300.
61. Becker H, Marcucci G, Maharry K, i wsp. Favorable prognostic impact of NPM1 mutations in older patients with cytogenetically normal de novo acute myeloid leukemia and associated gene- and microRNA-expression signatures: a Cancer
and Leukemia Group B study. J Clin Oncol. 2010; 28: 596-604.
62. Falini B, Martelli MP, Bolli N, i wsp. Immunohistochemistry predicts nucleophosmin (NPM) mutations in acute myeloid
leukemia. Blood. 2006; 108: 1999-2005.
63. Konoplev S, Huang X, Drabkin HA, i wsp. Cytoplasmic localization of nucleophosmin in bone marrow blasts of acute
myeloid leukemia patients is not completely concordant with NPM1 mutation and is not predictive of prognosis. Cancer.
2009; 115: 4737-4744.
64. Ammatuna E, Noguera NI, Zangrilli D, i wsp. Rapid detection of nucleophosmin (NPM1) mutations in acute myeloid
leukemia by denaturing HPLC. Clin Chem. 2005; 51: 2165-2167
65. Ottone T, Ammatuna E, Lavorgna S, i wsp. An allele-specific RT-PCR assay to detect type A mutation of the nucleophosmin-1 gene I acute myeloid leukemia. J Mol Diagn. 2008; 10: 212-216.
66. Thiede C, Creutzig E, Illmer T, i wsp. Rapid and sensitive typing of NPM1 mutations using LNA-mediated PCR clamping. Leukemia. 2006; 20: 1897-1899.
67. Gorello P, Cazzaniga G, Alberti F, i wsp. Quantitative assessment of minimal residual disease in acute myeloid leukemia
carrying nucleophosmin (NPM1) gene mutations. Leukemia. 2006; 20: 1103-1108.
Praca wpłynęła do Redakcji 11.03.2011 r. i została zakwalifikowana do druku 22.04.2011 r.
Adres Autora:
Samodzielna Pracownia Hematoonkologii Doświadczalnej
Uniwersytetu Medycznego w Lublinie
ul. Chodźki 4a
20-093 Lublin
tel. 81 756 48 12
fax 81 756 48 13
[email protected]