QUANTA LiteTM CCP (Cyclic Citrullinated

QUANTA Lite® CCP 3.1 IgG/IgA ELISA
704550
Do diagnostyki in vitro
Złożoność CLIA: Wysoka
Przeznaczenie
QUANTA LiteTM CCP 3.1 IgG/IgA ELISA jest półilościowym testem immunoabsorpcji enzymozależnej
(immunoenzymatycznym) do wykrywania przeciwciał IgG i IgA anty-CCP3 (cykliczny cytrulinowany
peptyd 3) w surowicach pacjentów lub osoczach z dodatkiem cytrynianu lub wersenianu (EDTA).
Obecność tych przeciwciał, gdy rozpatrywać w połączeniu z innymi badaniami laboratoryjnymi i wynikami
badań klinicznych jest pomocna w diagnostyce reumatoidalnego zapalenia stawów (RZS), w tym RZS
rozpoznawanego ciągu 2 lat od wystąpienia objawów.
Podsumowanie i wyjaśnienie testu
Reumatoidalne zapalenie stawów (RZS) jest jedną z najczęstszych autoimmunologicznych chorób
układowych występujących u koło 0,5% ludności świata.1 Rozpoznanie zależy przede wszystkim
od objawów klinicznych. Do niedawna jedynym testem serologicznym stosowanym rutynowo było
określenie obecności czynnika reumatoidalnego (RF), znajdującego się u około 50% -90% pacjentów. 1,2
Jednakże czynnik reumatoidalny RF występuje także u osób z zakażeniami, innymi chorobami
autoimmunologicznymi i u niektórych osób zdrowych.1,2
Ważne w leczeniu tego schorzenia jest to, aby leczenie chorych z RZS podjąć tak szybko, jak to tylko
możliwe. 3 Wiadomo już od wielu lat, że u osób z RZS stwierdza się obecność autoprzeciwciał
przeciwjądrowych zwanych także autoprzeciwciałami anty-keratynowymi. Niedawno odkryto, że
przeciwciała te rozpoznają determinantę antygenową, która zawiera cytrulinę - deimidowaną postać
argininy.4,5 Peptyd o budowie cyklicznej zawierający cytrulinę, zwany CCP (Cyclic Citrullinated Peptide)
okazał się być lepszy od innych metod diagnostycznych takich jak przeciwciała przeciwjądrowe czy
czynnik reumatoidalny RF przy odróżnianiu chorych z RZS od innych chorych.6,7 W przeglądzie
piśmiennictwa8, 68% chorych na RZS posiada przeciwciała anty-CCP, podczas gdy średnio 5% bez
rozpoznanego RZS posiada dodatnie przeciwciała anty CPP.
Test wykonywany metodą ELISA z pierwotnie opisaną sekwencją CCP5nie był szeroko dopuszczony
do obrotu ze względu na niską czułość. Jednakże test anty-CCP drugiej generacji (nazwany przez
niektóre firmy tzw. CCP2) jest powszechnie dostępny i pokazuje doskonałą wydajność w stosunku
do metody z zastosowaniem pierwotnego peptydu. 9 INOVA Diagnostics nazywa ten test drugiej
generacji CCP IgG ELISA. Co ważne, anty-CCP stwierdzono u pacjentów z wczesnym RZS8, co czasem
pozwala na przewidywanie przyszłości rozwoju RZS lepiej niż RF.4,7 Przeciwciała u niektórych pacjentów
z RZS, które są negatywne dla anty-CCP2 reagują z innymi białkami cytrulinowanymi,6,7 sugerując tym
samym, że istnieją dodatkowe determinanty antygenowe, które nie występują w drugiej generacji
sekwencji antygenów CCP. W roku 2005, zostały udostępnione zestawy wykorzystujące 3 generację
antygenu (CCP3). Te 3 generacji zestawy peptydu okazały się być około 5% bardziej czułe porównaniu
z zestawami wykorzystującymi antygen CCP2 antygenu i równie specyficzne.10 Antygen zastosowany
w zestawie QUANTA Lite® CCP 3.1 zawiera nowszy 3 generacji peptyd CCP3. Zestaw ten wykorzystuje
także koniugat, który oprócz zwykłych przeciwciał wykrywa także przeciwciała IgA. Czułość jest większa,
niż zestawu CCP 3 ze względu na to, że niektórzy pacjenci z RZS w przypadku braku IgG posiadają
przeciwciała IgA z CCP 3. 11 Dodatkowa przewaga CCP 3.1 ELISA są oznaczone kolorami dołki
separatystyczne i możliwość korzystania z surowicy lub osocza pacjenta .
Zasada badania
Antygen stosowany w QUANTA Lite® CCP 3.1 IgG/IgA ELISA jest syntetycznym, cyklicznym
cytrulinowanym peptydem, który jak stwierdzono posiada czułość i specyficzność w wykrywaniu
przeciwciał u chorych na RZS. Ten antygen jest związany z powierzchnią płytki z mikrodołkami.
Uprzednio wstępnie rozcieńczone kontrole i rozcieńczone próbki pacjenta są dodawane do oddzielnych
dołków, dzięki czemu wszelkie CCP IgG i / lub obecne przeciwciała IgA wiążą się z unieruchomionym
antygenem. Niezwiązana próbka jest wypłukana, a enzymatycznie znakowany koniugat anty-IgG / IgA
jest dodawany do każdego dołka. Druga inkubacja pozwala na to, żeby enzymatycznie znakowana
ludzka anty-IgG i / lub IgA związała się z przeciwciałami pacjenta, które przyczepiają się do mikrodołków.
Po wypłukaniu wszelkich niezwiązanych przeciwciał przeciw-ludzkich IgG/IgA znakowanych enzymem,
aktywność pozostałego enzymu bada się dodając substrat chromogeniczny i mierząc intensywność
powstałej barwy. Badanie może zostać ocenione spektrofotometrycznie, poprzez zmierzenie
i porównanie intensywności barwy, która powstaje w dołkach z próbkami od pacjenta z barwą dołków
kontrolnych.
Odczynniki
1.
2.
3.
4.
Polistyrenowa płytka ELISA z mikrodołkami pokryta oczyszczonym syntetycznie antygenem CCP
3 (12-1 x 8 dołków), z uchwytem w opakowaniu foliowym zawierającym środek osuszający
Ujemna kontrola ELISA , 1 fiolka buforu zawierająca środek konserwujący i surowicę ludzką bez
ludzkich przeciwciał na CCP, wstępnie rozcieńczone, 1,2 ml
Słabo dodatnie CCP 3.1 IgG / IgA ELISA, 1 fiolka bufor u zawierająca środek konserwujący
i ludzkie przeciwciała w surowicy CCP, wstępnie rozcieńczone, 1,2 ml
Wysoko dodatnie/kalibrator CCP 3.1 IgG / IgA ELISA, 1 fiolka buforu zawierająca środek
konserwujący i ludzkie przeciwciała w surowicy CCP, rozcieńczone, 1,2 ml
1
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
Kalibrator B CCP 3.1 IgG / IgA ELISA B, 1 fiolka buforu zawierająca środek konserwujący
i ludzkie przeciwciała w surowicy CCP, wstępnie rozcieńczone, 1,2 ml
Kalibrator C, CCP 3.1 IgG / IgA ELISA, 1 fiolka buforu zawierająca środek konserwujący i ludzkie
przeciwciała w surowicy CCP, wstępnie rozcieńczone, 1,2 ml
Kalibrator D, CCP 3.1 IgG / IgA ELISA, 1 fiolka buforu zawierająca środek konserwujący i ludzkie
przeciwciała w surowicy CCP, wstępnie rozcieńczone, 1,2 ml
Kalibrator E, CCP 3.1 IgG / IgA ELISA, 1 fiolka buforu zawierająca środek konserwujący i ludzkie
przeciwciała w surowicy CCP, wstępnie rozcieńczone, 1,2 ml
Rozcieńczalnik do próbek HRP, 1 fiolka – zabarwienie różowe, zawiera sól fizjologiczną
buforowaną TRIS, Tween 20, stabilizatory białka i konserwant, 50 ml
Koncentrat do płukania o wysokiej specyficzności, 1 fiolka z 10x koncentratem - oznakowanym
kolorem czerwonym zawierającym roztwór soli fizjologicznej buforowanej Tris-i Tween 20,
100 ml. Instrukcje dotyczące rozcieńczania można znaleźć w sekcji Metody.
HRP CCP 3.1 IgG / IgA koniugatu (kozi), anty-IgG / IgA, 1 fiolka - oznakowana kolorem żółtym
zawierająca bufor, stabilizatory białka i środek konserwujący, 10 ml
Chromogen TMB, 1 fiolka zawierająca stabilizatory, 10 ml
Roztwór zatrzymujący HRP, kwas siarkowy 0,344M, 1 fiolka – bezbarwny, 10 ml
Ostrzeżenia
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
OSTRZEŻENIE: Ten produkt zawiera substancję chemiczną (chloramfenikol 0,02%)
w rozcieńczalniku do próbek, kontrolach i koniugacie, która według stanu Kalifornii wywołuje raka.
Wszystkie materiały pochodzenia ludzkiego używane w przygotowywaniu kontroli dla tego
produktu zostały przetestowane i na podstawie metod zatwierdzonych przez FDA stwierdzono że
nie zawierają przeciwciał przeciwko HIV, HBsAg i HCV. Jednak żadna metoda testowania nie
może całkowicie zagwarantować braku obecności HIV, HBV, HCV lub innych czynników
zakaźnych. Dlatego, nisko dodatnie CCP 3.1 IgG / IgA ELISA, wysoko dodatnie/kalibratory CCP
3.1 IgG / IgA ELISA i kontrole ujemne ELISA powinny być traktowane w taki sam sposób jak
materiały potencjalnie zakaźne.12
Jako konserwant stosowany jest azydek sodu. Azydek sodu jest trucizną i może być toksyczny w
przypadku połknięcia lub wchłonięcia przez skórę lub oczy. Azydek sodu może wchodzić w
reakcję z ołowianą lub miedzianą instalacją wodociągową, tworząc potencjalnie wybuchowe
azydki metali. Jeśli do usuwania odczynników używane są zlewy, należy przepłukiwać je dużą
ilością wody, aby nie dopuścić do gromadzenia się azydku.
Koniugat HRP zawiera rozcieńczoną trującą/korozyjną substancję chemiczną, która może być
toksyczna w przypadku spożycia w dużej ilości. Aby uniknąć potencjalnych oparzeń
chemicznych, należy unikać kontaktu ze skórą i oczami.
Chromogen TMB zawiera środek drażniący, w który może być szkodliwy w przypadku wdychania,
spożycia lub wchłonięcia przez skórę. Aby uniknąć urazów, należy unikać wdychania, spożycia
lub kontaktu ze skórą i oczami.
Roztwór zatrzymujący HRP składa się z rozcieńczonego roztworu kwasu siarkowego. Unikać
wystawienia na działanie zasad, metali lub innych związków, które mogą wchodzić w reakcje
z kwasami. Kwas siarkowy jest trucizną i ma właściwości korozyjne. W razie połknięcia może być
toksyczny. Aby uniknąć oparzeń chemicznych, należy unikać kontaktu ze skórą i oczami.
Podczas pracy z dostarczonymi odczynnikami należy stosować odpowiednie środki ochrony
osobistej.
Rozlane odczynniki należy natychmiast usunąć. Należy przestrzegać wszystkich krajowych
i lokalnych przepisów w zakresie utylizacji odpadów.
Środki ostrożności
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Ten produkt jest przeznaczony do zastosowań diagnostycznych in vitro.
Zastąpienie składników dostarczonych w tym systemie innymi składnikami może skutkować
osiągnięciem niespójnych wyników.
Niepełne lub nieprawidłowe płukanie i niewystarczające usunięcie płynu z płytek z dołkami ELISA
wpłynie negatywnie na precyzję badań i/lub spowoduje wysoki poziom tła.
Dostosowanie tego badania do stosowania ze zautomatyzowanymi analizatorami próbek oraz
innymi urządzeniami do pracy z płynami, w całości lub w części, może skutkować rozbieżnością
wyników w stosunku do badań przeprowadzanych ręcznie. Obowiązkiem każdego laboratorium
jest potwierdzenie, że wyniki testów uzyskanych na podstawie zautomatyzowanych badań
mieszczą się w akceptowalnych limitach.
Na wyniki analizy wpływa wiele różnych czynników. Obejmują one temperaturę początkową
odczynników, temperaturę otoczenia, dokładność i powtarzalność techniki pipetowania,
dokładność płukania i usuwania płynu z dołków płytek ELISA, fotometr użyty do analizy wyników
oraz czasy trwania inkubacji podczas badania. Uzyskanie dokładnych i powtarzalnych wyników
wymaga staranności i precyzji.
Zalecane jest ścisłe przestrzeganie procedury testowej.
Niepełne zamknięcie na zamek błyskawiczny etui z lock woreczek zawierającego mikrodołki płytki
i środek osuszający spowoduje degradację antygenu i kiepską dokładność.
Dwukrotne lub wielokrotne użycie koniugatu HRP z jednej butelki w pewnym okresie czasu może
spowodować niedopuszczalnie niski poziom absorbancji. Aby nie dopuścić do takiej sytuacji
istotne jest przestrzeganie wszystkich zaleceń dotyczących procedur pracy z koniugatem HRP.
2
9.
Zanieczyszczenie chemiczne koniugatu HRP może być spowodowane nieprawidłowym
czyszczeniem lub płukaniem sprzętu lub narzędzi. Pozostałości typowych laboratoryjnych
substancji chemicznych, takich jak formalina, substancja wybielająca, etanol lub detergent,
z czasem spowoduje degradację koniugatu HRP. Po użyciu chemicznych substancji
czyszczących/dezynfekujących dokładnie wypłukać cały sprzęt i wszystkie narzędzia.
Warunki przechowywania
1.
2.
3.
Przechowywać wszystkie odczynniki zestawu w temperaturze 2–8°C. Nie zamrażać. Odczynniki
są trwałe do daty ważności, pod warunkiem, że są przechowywane i używane zgodnie
z instrukcjami.
Nieużyte płytki z mikrodołkami pokrytymi antygenem powinny być starannie zamknięte w torebce
foliowej z osuszaczami i przechowywane w temperaturze 2–8°C.
Rozcieńczony bufor do płukania zachowuje trwałość przez 1 tydzień w temperaturze 2–8°C.
Pobieranie próbek
Gdy próbki dały identyczne wyniki, procedura ta powinna być wykonana zarówno z próbką surowicy lub
osocza krwi z cytrynianem lub próbką osocza z wersenianem (EDTA). Nie powinno być stosowane
osocze z litem i heparyną, ponieważ mogą one przynieść wyniki inne niż surowica. Dodanie azydku lub
innych konserwantów do próbek analitycznych może mieć negatywny wpływ na wyniki. Nie używać
próbek zawierających widoczne zanieczyszczenia, skażonych bakteryjnie lub podgrzanych. Należy
unikać całkowicie zhemolizowanej lub lipemicznej surowicy albo próbek.
Po zebraniu, surowica powinna być oddzielona od skrzepu lub osocze powinno być przechowywane
w sposób opisany poniżej. Dokument NCCLS H18-A3 zaleca następujące warunki przechowywania
próbek: 1) Przechowywać próbki w temperaturze pokojowej nie dłużej niż 8 godzin. 2) Jeżeli test nie
zostanie zakończony w ciągu 8 godzin, próbki należy przechowywać w lodówce w temperaturze 2–8° C.
3) Jeżeli test nie zostanie zakończony w ciągu 48 godzin, lub do wysłania próbki, należy zamrozić
do temperatury -20 ° C lub niższej. Zamrożone próbki po rozmrożeniu i przed badaniem muszą zostać
dobrze wymieszane.
Badanie
Dostarczone materiały
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
płytka z mikrodołkami CCP 3.1 IgG/IgA ELISA (12-1 x 8 dołków), wraz z uchwytem
1,2 ml wstępnie rozcieńczona kontrola negatywna ELISA
1,2 ml wstępnie rozcieńczone słabo dodatnie CCP 3.1 IgG/IgA ELISA
1,2 ml wstępnie rozcieńczone CCP 3.1 IgG/IgA wysoce dodatnie ELISA/Kalibrator A
1,2 ml wstępnie rozcieńczone CCP 3.1 IgG/IgA ELISA Kalibrator B
1,2 ml wstępnie rozcieńczone CCP 3.1 IgG/IgA ELISA Kalibrator C
1,2 ml wstępnie rozcieńczone CCP 3.1 IgG/IgA ELISA Kalibrator D
1,2 ml wstępnie rozcieńczone CCP 3.1 IgG/IgA ELISA Kalibrator E
50 ml rozcieńczalnika do próbek HRP
100 ml koncentratu do przemywania o wysokiej specyficzności, koncentrat 10x
10 ml HRP CCP 3.1 IgG / IgA koniugatu (kozi), ludzki anty-IgG / IgA
10 ml chromogenu TMB
10 ml roztworu zatrzymującego HRP, kwas siarkowy 0,344M
Wymagane materiały nie dołączone do zestawu
Mikropipety na 5, 100, 200–300 i 500 µl
Jednorazowe końcówki mikropipet
Probówki do roztworów próbek pochodzących od pacjenta, 4 ml objętości
Woda destylowana lub dejonizowana
1L pojemnik na rozcieńczony koncentrat do płukania o wysokiej specyficzności
Czytnik płytek z mikrodołkami umożliwiający pomiar gęstości optycznej przy 450 nm (i przy 620 nm dla
odczytów przy dwóch długościach fali)
Sposób przygotowania
Przed rozpoczęciem
1.
2.
3.
4.
Doprowadzić wszystkie odczynniki i próbki do temperatury pokojowej (20–26oC) i dobrze
wymieszać.
Rozcieńczyć wysokiej specyficzności koncentrat do płukania 01:10 poprzez dodanie zawartości
butelki wysokiej specyficzności koncentratu do płukania do 900 ml butelki z wodą destylowaną
lub dejonizowaną Jeśli cała płytka nie zostanie uruchomiona w tym okresie, można przygotować
mniejsze ilości przez dodanie 10,0 ml koncentratu do 90 ml wody destylowanej lub dejonizowanej
do każdego z 16 dołków, które będą wykorzystane. Rozcieńczony bufor zachowuje trwałość
przez 1 tydzień w temperaturze 2–8oC.
Przygotować roztwór 1:101 każdej próbki pobranej od pacjenta, dodając 5 µl próbki do 500 µl
rozcieńczalnika do próbek HRP. Rozcieńczone próbki muszą być użyte w ciągu 8 godzin
od przygotowania. NIE ROZCIEŃCZAĆ słabo dodatniego CCP 3.1 IgG/IgA ELISA, wysoko
dodatniego CCP 3.1 IgG/IgA oraz ujemnej kontroli ELISA.
Oznaczanie obecności lub braku przeciwciał anty-CCP 3.1 przeciwciał stosując jednostki
umowne wymaga dwóch dołków dla każdego z trzech kontroli i jednego lub dwóch dołków dla
każdej próbki pacjenta. Zalecane jest wykonanie duplikatów próbek.
3
5.
W razie potrzeby, wyniki mogą być oceniane ilościowo za pomocą 5-punktowej krzywej
wzorcowej. Dla punktów A do E 5-punktowej krzywej wzorcowej, należy użyć WSTĘPNIE
ROZCIEŃCZONYCH CCP 3.1 kalibratorów od A do E bezpośrednio z fiolki. Pięciopunktowa
krzywa wzorcowa ma następujące wartości:
Punkt
Jednostki
A
Wstępnie rozcieńczony Kalibrator A CCP 3.1 IgG/IgA
250,0
B
Wstępnie rozcieńczony Kalibrator B CCP 3.1 IgG/IgA
125,0
C
Wstępnie rozcieńczony Kalibrator C CCP 3.1 IgG/IgA
62,5
D
Wstępnie rozcieńczony Kalibrator D CCP 3.1 IgG/IgA
31,25
E
Wstępnie rozcieńczony Kalibrator E CCP 3.1 IgG/IgA
15,62
Procedura badania
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
WSZYSTKIE
ODCZYNNIKI
PRZED
ROZPOCZĘCIEM
BADANIA
MUSZĄ
BYĆ
DOPROWADZONE DO TEMPERATURY POKOJOWEJ (20–26°C). Umieścić wymaganą liczbę
mikrodołków/pasków w uchwycie. Natychmiast umieścić nieużywane płytki w torebce
foliowej zawierającej osuszacz i dobrze ją zamknąć, aby ograniczyć kontakt z parą wodną.
Dodać 100 μl zrozcieńczonej wstępnie CCP 3.1 IgG / IgA ELISA słabo dodatniej, CCP 3.1 IgG /
IgA ELISA wysoko dodatniej, w razie potrzeby kalibratory od B do E,ujemna kontrola ELISA
i rozcieńczone próbki pacjentów do dołków. Przykryć dołki i inkubować przez 30 minut
w temperaturze pokojowej na równej powierzchni. Czas inkubacji rozpoczyna się po dodaniu
ostatniej próbki.
Etap płukania: Odessać całkowicie zawartość każdego dołka. Wlać 200–300 µl rozcieńczonego
buforu HRP do płukania do wszystkich dołków, a następnie odessać. Powtórzyć tę sekwencję
jeszcze dwukrotnie, aby łącznie przeprowadzić trzy płukania. Odwrócić płytkę i postukać w nią na
materiale pochłaniającym w celu usunięcia pozostałości płynu po ostatnim płukaniu. Ważne jest,
aby całkowicie opróżnić każdy dołek po każdym etapie płukania. Zachować tę samą sekwencję
odsysania, jak w przypadku dodawania próbki.
Dodać 100μl koniugatu HRP CCP 3.1 IgG / IgA do każdego dołka. Koniugat powinien być usunięty
z butelek z zastosowaniem standardowych warunków aseptycznych oraz zalecanych technik
laboratoryjnych. Pobrać z butelki jedynie wymaganą do analizy ilość koniugatu. ABY UNIKNĄĆ
POTENCJALNEGO ZANIECZYSZCZENIA BAKTERYJNEGO I/LUB CHEMICZNEGO, NIE WOLNO
Z POWROTEM WLEWAĆ NIEUŻYTEGO KONIUGATU DO BUTELKI. Inkubować dołki przez
30 minut jak w etapie 2.
Etap płukania: Powtórzyć etap 3.
Dodać 100 µl chromogenu TMB do każdego dołka i inkubować w ciemności przez 30 minut
w temperaturze pokojowej.
do każdego dołka dodać 100 µl roztworu zatrzymującego HRP. Zachować tę samą sekwencję
i czas dodawania roztworu zatrzymującego HRP, jak w przypadku chromogenu TMB. Delikatnie
postukać płytkę palcem, aby dokładnie wymieszać zawartość dołków.
Odczytać absorbancję (gęstość optyczną) każdego dołka przy długości fali 450 nm w ciągu jednej
godziny od zatrzymania reakcji. Jeśli wymagane są pomiary bichromatyczne, referencyjną
długością fali może być długość 620 nm.
Kontrola jakości
1.
2.
3.
4.
CCP 3.1 IgG / IgA ELISA słabo dodatnie, CCP 3.1 IgG / IgA ELISA wysoko dodatnie i ujemna
kontrola ELISA powinna być prowadzona z każdą partią próbek w celu zapewnienia, aby
wszystkie odczynniki i procedury działały poprawnie.
Warto zauważyć, słabo dodatnie CCP 3.1 IgG / IgA ELISA, wysoko dodatnie CCP 3.1 IgG / IgA
ELISA i ujemne kontrolne ELISA są wstępnie rozcieńczone, nie kontrolują one metod
proceduralnych związanych z rozcieńczeniem próbek.
Dodatkowe kontrole mogą być przebadane zgodnie z wytycznymi lub wymaganiami lokalnych
i/lub krajowych przepisów lub organów normalizacyjnych. Dodatkowe odpowiednie surowice
kontrolne można przygotować, dzieląc połączone próbki surowicy ludzkiej i przechowując je
w temperaturze < -20°C.
Aby wyniki badania mogły być uznane jako ważne, muszą zostać spełnione wszystkie poniższe
kryteria. Jeśli jakiekolwiek kryterium nie będzie spełnione, badanie powinno być traktowane jako
nieważne i powinno zostać powtórzone.
a.
Absorbancja wstępnie rozcieńczonej wysoko dodatniej CCP 3.1 IgG / IgA ELISA musi być
większa od absorbancji wstępnie rozcieńczonej słabo dodatniej CCP 3.1 IgG / IgA ELISA,
która musi być większa niż absorbancja rozcieńczonej kontroli ujemnej ELISA.
b.
Wstępnie rozcieńczona wysoko dodatnia CCP 3.1 IgG / IgA ELISA musi posiadać gęstość
optyczną (OD) większą niż 1,0, podczas gdy absorbancja wstępnie rozcieńczonej ujemnej
kontroli ELISA nie może przekraczać wartości 0,2.
c.
Absorbancja słabo dodatniej CCP 3.1 IgG / IgA ELISA musi być większa niż dwukrotna
wartość ujemnej kontroli ELISA lub powinna przekraczać 0,25.
d.
Ujemna kontrola ELISA i wysoko dodatnia CCP 3.1 IgG / IgA ELISA są przeznaczone
do monitorowania znacznego braku działania odczynnika. Wysoko dodatni CCP 3.1 IgG /
IgA ELISA nie zapewnia dokładności przy wartości odcięcia testu.
e.
W celu zapoznania się z dodatkowymi wytycznymi użytkownik powinien zapoznać się
z dokumentem CLSI (NCCLS) C24-A3 dotyczącymi stosowania odpowiednich procedur
kontroli jakości.
4
Półilościowa analiza wyników — metoda wskaźnikowa
W pierwszej kolejności jest określana średnia gęstość optyczna każdego zestawu duplikatów.
Reaktywność dla każdej próbki może być obliczona przez podzielenie średniej gęstości optycznej przez
średnią słabo dodatniej gęstości optycznej CCP 3.1 IgG / IgA ELISA. Wynik jest pomnożony przez liczbę
jednostek przypisanych do słabo dodatniego CCP 3.1 IgG / IgA ELISA znalezioną na etykiecie.
Gęstość optyczna próbki
Wartość próbki = –––––––––––––––––––––––––– x słabo dodatnia CCP 3.1 IgG/IgA ELISA
(jednostki)
CCP 3.1 IgG / IgA ELISA słabo
(jednostki)
dodatnia gęstość optyczna OD
Reaktywność w sposób nieliniowy zależy od ilości obecnych przeciwciał. Wzrosty i spadki stężeń
przeciwciał u pacjenta będą odzwierciedlone w analogicznym wzroście lub spadku reaktywności, jednak
zmiana ta nie jest proporcjonalna (tzn. podwojenie stężenia przeciwciał nie oznacza podwojenia
reaktywności).
Opcjonalna metoda obliczeń: Półilościowe wyniki za pomocą krzywej
wzorcowej
Obliczanie wyników z opcjonalną krzywą wzorcową
1.
Należy określić wartość średnią dla odczytów wszystkich duplikatów.
2.
Nanieść średnią absorbancję (gęstość optyczną) próbek na krzywej wzorcowej w odniesieniu
do ich wartości w jednostkach. Do narysowania krzywej użyć liniowo/liniowej funkcji sklejanej
(splajnu) stopnia 3 lub łamanej łączącej punkty.
3.
Należy określić nieznane stężenie anty-CCP 3.1 stężenie w jednostkach z osi „Y" poprzez odczyt
odpowiednich absorbancji na osi „x". Obliczyć nieznane jednostki.
4.
Uwaga: Wartości obliczone za pomocą metody wskaźnikowej będą różnić się od wartości
obliczonych według krzywej wzorcowej. Wyższe wartości będą różnić się w większym stopniu niż
wartości niższe. Stosując metodę wskaźnikową wysoko dodatni CCP 3.1 IgG / IgA nie przyniesie
wartości 250.
Interpretacja wyników
Badanie ELISA jest bardzo wrażliwe na technikę i jest w stanie wychwycić nawet najdrobniejsze różnice
w populacjach pacjentów. Poniższe wartości są jedynie wartościami sugerowanymi. Każde laboratorium
powinno ustalić własny normalny zakres na podstawie własnych technik, kontroli, sprzętu i populacji
pacjentów, zgodnie z własnymi ustalonymi procedurami.
Próbka następnie może być sklasyfikowana jako negatywna, słabo pozytywna, średnio pozytywna lub
silnie pozytywna, zgodnie z poniższą tabelą.
Jednostki
<20
20 - 39
40 - 59
≥ 60
Negatywna
Słabo pozytywna
Średnio pozytywna
Silnie pozytywna
1.
2.
3.
Dodatni wynik wskazuje na obecność przeciwciał klasy IgG i / lub IgA anty-CCP 3 i sugeruje
możliwość RZS.
Negatywny wynik wskazuje na brak przeciwciał lub poziomy CCP 3 poniżej ujemnych wartości
odcięcia testu.
Zalecane jest, aby wyniki raportowane przez laboratorium zawierały oświadczenie: „Uzyskano
następujące wyniki uzyskane z INOVA QUANTA Lite® CCP 3.1 IgG/IgA ELISA. Nie można
stosować zamiennie wartości przeciwciał przeciwko CCP uzyskanych przy zastosowaniu metod
testowych innych producentów. Wielkość poziomów zgłoszonych IgG lub IgA nie mogą być
skorelowane z mianem końcowym. "
Ograniczenia badania
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Obecność kompleksów immunologicznych lub innych agregatów immunoglobuliny w próbce
pacjenta może spowodować wzrost poziomu niespecyficznego wiązania i wywoływania wyników
fałszywie dodatnich w tym teście.
Nie wszyscy chorzy na RZS mają dodatnie przeciwciała anty-CCP.
Wyniki tego badania powinny być użyte w powiązaniu z wynikami klinicznymi i innymi badaniami
serologicznymi.
Charakterystyka wydajności testu nie została ustalona dla matryc innych niż surowica, osocze
EDTA i osocze z cytrynianem.
Wartość diagnostyczna przeciwciał anty-CCP 3 u pacjentów z młodzieńczym reumatoidalnym
zapaleniem stawów nie została ustalona.
Substancje mające wpływ na wynik testu: Wysoki poziom hemoglobiny, bilirubiny, cholesterolu
i trójglicerydów nie powoduje fałszywie ujemnych lub fałszywie dodatnich wyników.
5
Oczekiwane wartości z próbek klinicznych
Zdolność QUANTA Lite® CCP3.1 IgG / IgA ELISA do wykrywania / IgG IgA CCP3 oceniano poprzez
porównanie do 942 próbek z testem ELISA, którym dokonano pomiaru-IgG anty-CCP2. Włączono 495
pacjentów z klinicznym rozpoznaniem RZS w wyniku badań zarówno wewnętrznych (186) jak
i zewnętrznych (309). Badano również surowice 275 losowo dobranych dawców krwi. Spośród 272,
gdzie wiek i płeć były dostępne, 97 stanowiły kobiety, średni wiek wynosił 42,4 lat. Kontrola choroby
obejmowała 74 osoby z innymi chorobami reumatycznymi (ORD), takimi jak toczeń rumieniowaty
układowy (34), choroba Mikulicza-Radeckiego (16), twardzina uogólniona (24), jak również dodatkowe
98 próbek z przeciwciałami przeciwko chorobom zakaźnym (ID), takimi jak zapalenie wątroby C (58),
wirus opryszczki zwykłej (herpes simplex) (15), wirus cytomegalii (14), toksoplazmoza (6) i różyczka (5)
w jednym dużym badaniu wewnętrznym.
Swoistość i wrażliwość kliniczna
Poniższa tabela podsumowuje wyniki wszystkich badań klinicznych.
Próbki N=942
CCP3.1 ELISA
+
348
147
55
31
10
437
2
273
6
68
2
96
RZS (Całkowita N=495)
RZS – w ciągu 2 lat (N=86)
Całkowite kontrole (N=447)
Dawcy krwi (N=275)
Inne choroby reumatyczne (N=74)
Choroby zakaźne (N=98)
Czułość kliniczna [95% przedział ufności (CI)] =
CCP ELISA
+
320
175
47
39
8
439
3
272
4
70
1
97
CCP3.1 = 70,3% (66–74%)
CCP = 64,6% (60-69%)
CCP3.1 = 64,0% (52–74%)
CCP = 54,7% (43-65%)
CCP3.1 = 97,8% (96-99%)
CCP = 98,2% (97-99%)
W RZS w ciągu 2 lat =
Specyficzność kliniczna (95% CI) =
Porównanie metody
CCP IgG ELISA
Pozytywna
Negatywny
N = 942
CCP3.1 IgG /
IgA ELISA
Łącznie
Pozytywna
320
38*
358
Negatywny
8**
576
584
Łącznie
328
614
942
% Zgody (95% CI)
Pozyt. % Zgody = 97,6%
(95,3-98,9%)
Negat. %Zgod= 93,8%
(91,6-95,6%)
Całk. % zgody= 95,1%
* 33 spośród tych próbek są zdiagnozowanymi RZS.
** 5 spośród tych próbek są zdiagnozowanymi RZS.
Reaktywność krzyżowa
Aby ocenić potencjalne reakcje krzyżowe z CCP3.1 antygenu z innych autoprzeciwciał, QUANTA Lite®
CCP3.1 ELISA oceniano z 16 próbek, wszystkie mają wysoki poziom wielu innych autoprzeciwciał.
Zawarte w tej grupie były 2 próbki, każdą z nich poddaje się reakcji z SS-A, SS-B, Sm, RNP, ScL-70,
Jo-1, Ribo-P i dsDNA. Wszystkie próbki były ujemne dla anty-CCP3.1. Powyższe badanie nie wykazuje
znaczącego reaktywności krzyżowej antygenu CCP3.1 z wieloma innymi autoprzeciwciałami.
Precyzja i powtarzalność
Mierzono zmienność pomiędzy-przebiegami testu uruchamiając duplikaty badania próbek ujemnych,
słabo dodatnich, silnie dodatnich w 6 oddzielnych testach w okresie 5 różnych dni. Zmiany w obrębie
przebiegu testu mierzono poprzez uruchomienie 9 próbek 9 lub 10 razy na tej samej płytce ELISA.
Reprezentatywne wyniki zostały przedstawione poniżej.
Zmienność pomiędzy seriami
Negatywny 1
Niskie 1
1 pkt * 5 pkt ** 1 pkt 5 pkt
Średnia
6U
4U
22 U 23 U
SD
0,4
0,5
0,7
0,6
CV%
8%
11%
3%
3%
Niskie 2
1 pkt
5 pkt
28 U
30 U
0,8
1,2
3%
4%
Wysokie 1
1 pkt
5 pkt
69 U
85 U
1,7
1,2
2%
1%
Zmienność w obrębie serii
Negatywny 1
1 pkt
5 pkt
Średnia
4U
2U
SD
0,2
0,2
CV%
4%
13%
Niskie 2
1 pkt
5 pkt
26 U
30 U
0,9
1,0
3%
3%
Wysokie 1
1 pkt
5 pkt
68 U
81 U
1,9
3,2
3%
4%
Niskie 1
1 pkt 5 pkt
22 U 24 U
0,9
1,1
4%
5%
* Wyniki badań metodą wskaźnikową
** Wyniki badań metodą krzywej wzorcowej
6
Piśmiennictwo
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
Wener MH: Rheumatoid Factors. Manual of Clinical Laboratory Immunology, NR Rose et al., eds,
American Society for Microbiology Press, 961-972 (2002).
Borretzen M et al.: Rheumatoid Factors. Autoantibodies, Peter JB and Shoenfeld Y, eds, Elsevier
Science B.V., 706-715 (1996).
Kim JK and Weisman MH: When does rheumatoid arthritis begin and why do we need to know?
Arthritis Rheum 43: 473-484 (2000).
Vossenaar ER and Van Venrooj WJ: Anti-CCP antibodies, a highly specific marker for (early)
rheumatoid arthritis. Clin Applied Immunol Rev 4: 239-262 (2004).
Schellekens GA et al.: Citrulline is an essential constituent of antigenic determinants recognized
by rheumatoid arthritis-specific autoantibodies. J Clin Invest. 101: 273-281 (1998).
Vittecoq O et al.: Autoantibodies recognizing citrullinated rat filaggrin in an ELISA using
citrullinated and non-citrullinated recombinant proteins as antigens are highly diagnostic for
rheumatoid arthritis. Clin Exp Immunol 135: 173-180 (2004).
Saraux A et al.: Value of antibodies to citrulline-containing peptides for diagnosing early
rheumatoid arthritis. J Rheumatol 30: 2550-2539 (2003).
Avovac J et al: Diagnostic and predictive value of anti-cycllic citrullinated protien antibodies in
rheumatiod arthritis: a systematic literature review. Ann Rheum Dis 65: 845-851 (2006).
van Gaalen FA et al.: A comparison of the diagnostic accuracy and prognostic value of the firstand second anti-cyclic citrullinated peptide autoantibody (CCP1 and CCP2) tests for rheumatoid
arthritis. Ann Rheum Dis 64: 1510-1512 (2005)
Mittermayer S et al.: A comparison of the frequency of autoantibodies to cyclic citrullinated
peptides using a third generation CCP assay (CCP3) in systemic sclerosis, primary biliary
cirrhosis and rheumatoid arthritis. Clin Rheumatol June 15, e-pub ahead of print (2007).
Vieira LEA et al: Rheumatoid arthritis diagnosis: a comparative study of second and third
generation anti-cyclic citrullinated peptide (CCP) ELISAs. Arthritis Rheum 56: S724 (2007).
Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control/National
Institutes of Health, Fifth Edition, 2007.
7
QUANTA Lite jest zastrzeżonym znakiem handlowym firmy INOVA Diagnostics, Inc.
Copyright 2011. Wszelkie prawa zastrzeżone©
Wyprodukowano przez:
INOVA Diagnostics, Inc.
9900 Old Grove Road
San Diego, CA 92131
Stany Zjednoczone Ameryki
Pomoc techniczna (tylko na terenie Stanów Zjednoczonych i Kanady): 877-829-4745
Pomoc techniczna (poza terenem Stanów Zjednoczonych): 00 + 1 858-805-7950
[email protected]
Autoryzowani przedstawiciele na terenie Unii Europejskiej:
Medical Technology Promedt Consulting GmbH
Altenhofstrasse 80
D-66386 St. Ingbert, Niemcy
Tel.: +49-6894-581020
Faks.: +49-6894-581021
www.mt-procons.com
624550POL
Marzec 2011
Wersja 0
8