Przepis do_wiadczenia - izolacja DNA Przepis do_wiadczenia

Przepis do_wiadczenia - izolacja DNA
1.
Podpisa_ (np. swoimi inicja_ami) wszystkie puste probówki znajduj_ce si_ w!statywie, na wieczku i z
boku probówki – pozwoli to unikn__ pomylenia próbek.
2.
Steryln_ pa_eczk_ do wymazów pobiera si_ próbk_ komórek z nab_onka jamy ustnej. Ze wzgl_du na
wysok_ czu_o__ techniki PCR nie mo_na dopu_ci_ do zanieczyszczenia pa_eczki innymi _ród_ami DNA!
3.
Natychmiast po pobraniu wymazu nale_y odci__ fragment pa_eczki z próbk_ i umie_ci_ j_ w zielonej
probówce, w której znajduje si_ roztwór lizuj_cy (oparty na SDSie).
4.
Prowadz_cy dodaj_ do ka_dej zielonej probówki z próbk_ DNA 20 _l (0,02 ml) proteinazy K (z grzyba
Tritirachium album limber).
5.
Dobrze zamkn__ (SDS si_ bardzo pieni!)! Delikatnie wymiesza_.
6.
Inkubowa_ przez 20 minut w 37°C, od czasu do czasu mieszaj_c.
7.
W_o_y_ kolumienk_ do probówki 2ml. Roztwór z probówki nanie__ ostro_nie na kolumienk_ do
oczyszczania DNA. Uwa_a_ _eby nie dotkn__ ko_cówk_ bia_ego z_o_a!
8.
Wirowa_ przez 1 minut_ przy 12 tys. obrotów.
9.
Wyla_ zawarto__ dolnej probówki i w_o_y_ do niej ponownie kolumienk_.
10. Doda_ 500 _l roztworu p_ucz_cego A1 (czerwona probówka – napisy si_ _cieraj_!).
11. Wirowa_ przez 1 minut_ przy 12 tys. obrotów.
12. Wyla_ zawarto__ spodniej probówki i w_o_y_ do niej ponownie kolumienk_.
13. Doda_ 500 _l roztworu p_ucz_cego A1.
14. Wirowa_ przez 2 minuty przy 12 tys. Obrotów
15. Wyrzuci_ doln_ probówk_, a kolumienk_ umie_ci_ w NOWEJ, bia_ej, uprzednio podpisanej probówce
1,5 ml z oberwanym _epkiem.
16. Sprawnie i ostro_nie doda_ na „dno” kolumienki 50 _l wody o temperaturze 75°C.
17. Inkubowa_ 3 minuty w temperaturze pokojowej.
18. Wirowa_ przez 1 minut_ przy 12 tys. obrotów.
19. Kolumienk_ wyrzuci_, wodny roztwór DNA znajduj_cy si_ na dnie probówki zachowa_, zakrywaj_c
wieczkiem.
Przepis do_wiadczenia - PCR
1.
Otrzyman_ probóweczk_ do PCR ( z mieszanin_ reakcyjn_ bez DNA) szybko podpisa_ i najszybciej, jak
to mo_liwe, umie_ci_ w lodzie. W probówce s_ ju_: bufor, jony magnezu, deoksynukleotydy (dATP,
dTTP, dGTP, dCTP), startery, polimeraza, woda.
2.
Do probówki do PCR doda_ 5 _l DNA, probówk_ zamkn__ i do momentu umieszczenia jej w aparacie do
PCR trzyma_ w lodzie.
Przepis do_wiadczenia – elektroforeza w _elu agarozowym
1.
Do probówki z produktem PCR i doda_ do niej 4 _l barwnika
i!rozmiesza_ go a_ do uzyskania jednolitego zabarwienia roztworu.
2.
Je_li próbka rozmaza_a si_ po _ciankach probówki – króciutko
zwirowa_.
3.
Ostro_nie i z wyczuciem na_o_y_ 12 ml próbki z!barwnikiem do
studzienki, zapisuj_c, do której studzienki na_o_y_o si_ próbk_.
4.
W__czy_ pr_d - napi_cie!!!
5.
Po up_ywie min. 30 min. wy__czy_ pr_d, _el wraz z saneczkami
W!R_KAWICZKACH przenie__ i!obejrze_ w _wietle UV.
standard wielko_ci –
uk_ad i d_ugo__ pr__ków
Volume 15 _l
for 20 probes:
Woda
2,3
46
Bufor 10x
1,5
30
MgCl2
1,2
24
dNTP 2,5mM
1,5
30
Startery 5mM
1,5+1,5
30+30
DNA
5
-
Taq 1u/ml
0,5
10