przepis do ćwiczenia 2

Ćwiczenie 2
Oznaczanie ilościowe białek, reakcja biuretowa, czynniki denaturujące.
Oznaczanie białek rozpuszczalnych metodą Bradforda
Odczynniki:
• zhomogenizowany i zliofilizowany proszek z liści 6 gatunków roślin
• bufor ekstrakcyjny
• standard BSA
• odczynnik Bradforda
• Woda destylowana
na 1 gr (5 zespołów) potrzeba:
• zhomogenizowany i zliofilizowany proszek z liści 6 gatunków roślin: 6x 100 mg
• bufor ekstrakcyjny: 30 ml do ekstrakcji, 5ml do standardów
• standard BSA 1mg/ml: 1 ml
• odczynnik Bradforda 175ml
Bufor do oznaczania białek
Stoki
Bufor do białek
rozpuszczalnych
Na 300 mL
Na 150 mL
1 M Tris-HCl pH
8,0
50 mM Tris-HCl pH 8,0
15 mL
7,5 mL
0,5 M EDTA
1,0 mM EDTA
0,6 mL
0,3 mL
MgCl2*6H2O
10 mM MgCl2
0,609 g
0,304 g
0,293 mL
0,146
2-merkaptoetanol 14 mM 2-merkaptoetanol
1,12g/mL
(100%)
Odczynnik Bradforda (na 500 mL)
• 17,5 mg barwnika Coomassie Brilliant Blue G-250 rozpuścić w zlewce w 25 mL etanolu
96%
• mieszać ok. 2 h
• Przenieść do kolby na 500 mL z niewielka ilością wody DD H2O
• dodać 35 mL stężonego kwasu fosforowego (85%)
• uzupełnić wodą DD H2O do 500 mL
• mieszać całą noc na mieszadle w ciemności w temp pokojowej
• przelać do nowej butelki i ewentualnie przefiltrować.
Sprzęt
• Spektrofotometr
• wirówka
• wytrząsarka
4
•
•
•
•
probówki eppendorfa 1,5ml
Probówki PP zakręcane (bo do wrzącej łaźni wodnej) (co najmniej 7-15 ml)
Kuwety szklane
pipety szklane i automatyczne
Procedura:
Ekstrakcja białek rozpuszczalnych
• do 6 probówek eppendorfa odważyć po ok. 20mg zhomogenizowanego wcześniej proszku
pochodzącego z różnych gatunków,
• zanotować dokładną wagę naważki w mg
• do każdego eppendorfa dodać 1 mL przygotowanego wcześniej buforu ekstrakcyjnego
• wytrząsać przez ok 1h na wytrząsarce (prędkość 180, amplituda 9)
• w tym czasie wykonać oznaczenie standardów i sporządzić krzywą kalibracyjną – patrz
poniżej
• odwirować przez 10 min i zlać nadsącz do nowej probówki.
Sporządzanie krzywej kalibracyjnej
• standard BSA (1mg/ml) przenieść do eppendorfa i umieścić w lodówce
• przygotować w 6 eppendorfach rozcieńczenia standardu 0.0; 0.05; 0.1; 0.2; 0.4; 0.8 mg/mL
(metodą kolejnych rozcieńczeń). Pobrać 200 uL standardu i dodać do niego 50ul buforu
ekstrakcyjnego (powstanie 250ul o stężeniu 0.8mg/mL). Następnie do pozostałych 5
eppendorfów nalać po 125 ul buforu ekstrakcyjnego. Z pierwszej probówki (0.8mg/mL)
pobrać 125 ul i przenieść do drugiego eppendorfa. Zamieszać przez wpuszczanie i
wypuszczanie a następnie ta samą końcówką pobrać 125 ul powstałego rozcieńczenia i
przenieść do trzeciego eppendorfa. Powtórzyć operacje aż do uzyskania rozcieńczenia 0.05
mg/mL. W ostatniej probówce umieścić sam bufor ekstrakcyjny (125 ul)
• Przygotować 7 probówek na 7-15 ml
• Do probówki nr 1 wlać 50ul buforu ekstrakcyjnego i dodać 2,5 ml roztworu Bradforda.
• do probówek 2-7 nalać 50 ul odpowiedniego standardu i dodać 2,5 ml roztworu Bradforda.
• Zawartość każdej probówki dokładnie zamieszać
• Odczekać 5 min.
• Przelać zawartość z probówek do kuwetek szklanych
• wstawić kuwety do spektrofotometru (1: kontrola do użycia przez ok. 1h, 2-7: sześć
standardów) i dokonać odczytu absorbancji dla długości fali 595
• wykreślić krzywą kalibracyjną (na osi X stężenie, na osi Y absorbancja) i na jej podstawie
oznaczać stężenia badanych próbek. Uwzględnić tylko punkty o przebiegu liniowym,
pozostałe odrzucić.
Wzór lini trendu: y=Ax+B,
obliczanie stężenia: x=(y-B)/A [mg/mL]
po podzieleniu przez naważkę wyrażona w gramach: x=((y-B)/A)/naważka [mg/g s.m.]
Oznaczanie białek rozpuszczalnych
• do probówki na 7-15 ml nalać 50 ul badanej próbki lub buforu ekstrakcyjnego (referencja) a
następnie dodać 2,5 ml roztworu Bradforda i odczekać 5 min.
• Przelać zawartość do kuwetki szklanej.
• wstawić kuwety do spektrofotometru (1: referencja do użycia przez ok. 1h, 2-7: sześć
próbek) i dokonać odczytu absorbancji dla długości fali 595
5
•
wyniki wpisać do arkusza kalkulacyjnego i obliczyć ilość białek w mg/g d.w. ze
sporządzonej wcześniej krzywej kalibracyjnej.
Reakcja biuretowa (Piotrowskiego) - wykrywanie wiązań peptydowych
Potrzebne odczynniki na 1 zespół (x5 na 1 grupę ćwiczeniową):
1ml wody destylowanej
1ml 1% białka jaja kurzego
2 mL 10% NaOH
1 mL 0,5% CuSO4
Szkło:
2x szklane probówki
4x pipetki plastikowe
2x stojak: na probówki (1x) i odczynniki (1x)
Wykonanie
Przygotować 2 probówki. Do pierwszej wlać 1 mL wody destylowanej a do drugiej 1 mL roztworu
białka jaja kurzego. Następnie do każdej z nich dodać 1 mL 10% NaOH, zamieszać, i dodać 3 krople
0,5% CuSO4. W probówce zawierającej białko pojawia się fioletowe zabarwienie.
Reakcja Hellera
Potrzebne odczynniki na 1 zespół (x5 na 1 grupę ćwiczeniową):
1ml wody destylowanej
1ml 1% białka jaja kurzego
2 mL stężonego HNO3
Szkło:
2x szklane probówki
3x pipetki plastikowe
2x stojak: na probówki (1x) i odczynniki (1x)
Wykonanie
Przygotować 2 probówki. Do każdej z nich wlać 1 mL stężonego HNO3. Następnie do pierwszej
nawarstwić 1 mL wody destylowanej a do drugiej 1 mL roztworu białka jaja kurzego (tak aby
roztwory nie zmieszały się). W probówce z białkiem w miejscu zetknięcia się roztworów tworzy się
biały lub żółty pierścień zdenaturowanego i wytrąconego białka nierozpuszczalnego w nadmiarze
kwasu.
Reakcja z NaOH
Potrzebne odczynniki na 1 zespół (x5 na 1 grupę ćwiczeniową):
1ml wody destylowanej
1ml 1% białka jaja kurzego
6
1 mL 10% NaOH
5 mL 1% kwasu octowego
Szkło:
2x szklane probówki
4x pipetki plastikowe
2x stojak: na probówki (1x) i odczynniki (1x)
Wykonanie
Przygotować 2 probówki. Do pierwszej wlać 1 mL wody destylowanej a do drugiej 1 mL roztworu
białka jaja kurzego. Następnie do każdej z nich dodać 2 krople 10% NaOH, zawartość zamieszać i
do każdej dodać ok. 20 kropli 1% kwasu octowego (nie mieszać). W probówce z białkiem wytwarza
się kłaczkowaty osad wytrąconego białka.
7