docWzór ekspresji genów związanych z obroną antyoksydacyjną w
download 
Reklamacja Transkrypt
Wzór ekspresji genów związanych z obroną antyoksydacyjną w
&ARM0RZEGL.AUK 7ZÌREKSPRESJIGENÌWZWIZANYCHZOBRONANTYOKSYDACYJN WKOMÌRKACHNOWOTWOROWYCH(,I37 EKSPONOWANYCHNACISPLATYNÃ %XPRESSIONPATTERNOFGENESASSOCIATEDWITHANTIOXIDANTDEFENCE IN(,AND37CELLSEXPOSEDTOCISPLATIN !LICJA:AJDEL!DAM7ILCZOK$ARIA:IMIERSKA-ONIKA0AUL3AMOJEDNY !LEKSANDER/WCZAREK5RSZULA-AZUREK +ATEDRAI:AKAD"IOFARMACJI7YDZIA&ARMACEUTYCZNYZ/DDZIAEM-EDYCYNY,ABORATORYJNEJ gLSKI5NIWERSYTET-EDYCZNYW+ATOWICACH +ATEDRAI:AKAD'ENETYKI-EDYCZNEJ7YDZIA&ARMACEUTYCZNYZ/DDZIAEM-EDYCYNY,ABORATORYJNEJ gLSKI5NIWERSYTET-EDYCZNYW+ATOWICACH :AKAD3TATYSTYKI7YDZIA&ARMACEUTYCZNYZ/DDZIAEM-EDYCYNY,ABORATORYJNEJ gLSKI5NIWERSYTET-EDYCZNYW+ATOWICACH +ATEDRAI:AKAD"IOLOGII-OLEKULARNEJ7YDZIA&ARMACEUTYCZNYZ/DDZIAEM-EDYCYNY,ABORATORYJNEJ gLSKI5NIWERSYTET-EDYCZNYW+ATOWICACH Streszczenie Komórki nowotworowe często wykazują pierwotną lub nabytą oporność na cisplatynę, powszechnie stosowany cytostatyk. Oporność ta może być m.in. związana z nadmierną aktywnością białek uczestniczących w obronie antyoksydacyjnej. Stosując technikę mikromacierzy oligonukleotydowych HG-U133A (Affymetrix) porównywano ekspresję genów związanych z obroną antyoksydacyjną w kontrolnych oraz eksponowanych na cisplatynę komórkach ludzkich linii nowotworowych HL-60 (białaczki promielocytarnej) i SW707 (gruczolakoraka okrężnicy), wykazujących odmienną wrażliwość na ten lek. Komórki SW707 w odróżnieniu od komórek HL-60 charakteryzuje zwiększony poziom ekspresji genów GPX2, NQO1, NXN, PRDX2 oraz zmniejszony poziom ekspresji CAT i CCL5. Po ekspozycji na cisplatynę zaobserwowano zmniejszenie ekspresji w komórkach SW707 genu TXN, a w komórkach HL-60 genów NQO1 i CCL5. Ponadto, zauważono wzrost ekspresji genu CAT w komórkach SW707 oraz genu GSTZ1 w komórkach HL-60. Zmiany te sugerują, że w komórkach HL-60 nie występuje oporność na cisplatynę spowodowana nadmierną ekspresją genów kodujących białka obrony antyoksydacyjnej w odróżnieniu od komórek SW707 charakteryzujących się zwiększonym potencjałem antyoksydacyjnym i przez to zmniejszoną wrażliwością na terapię przeciwnowotworową, której towarzyszy indukcja stresu oksydacyjnego. Słowa kluczowe: cisplatyna, ekspresja genów, obrona antyoksydacyjna, oporność, komórki białaczki promielocytarnej, komórki gruczolakoraka okrężnicy Abstract Tumour cells are often characterised by primary or acquired resistance to cisplatin, a commonly used anticancer agent. This resistance can be associated with excessive activity of proteins participating in antioxidant defence. Using oligonucleotide microarray technique (HG-U133A, Affymetrix) the expression of genes associated with antioxidant defence in HL-60 cells (promyelocytic leukemia) and SW707 cells (colorectal carcinoma), which show different sensitivity to cisplatin after exposition to this drug, was compared. SW707 cells, opposite to HL-60 cells, are characterised by the increased expression of GPX2, NQO1, NXN, PRDX2 genes and decreased expression of CAT and CCL5 genes. After cisplatin treatment, the decreased expression of TXN gene in SW707 cells and the decreased expression of NQO1, and CCL5 genes in HL-60 were observed. Moreover the increased expression of CAT gene occurred in SW 707 cells while in HL-60 cells the increased expression of GSTZ1 took place. The observed changes suggest that in HL-60 cells, opposite to SW707 cells, the resistance to cisplatin caused by the excessive expression of genes coding antioxidant defence proteins does not exist. SW707 cells are characterised by the increased antioxidant potential and thus the decreased susceptibility to anticancer therapy, which involves oxidative stress induction. Key words: cisplatin, gene expression, antioxidant defence, resistance, promyelocytic leukemia cells, colorectal carcinoma cells COPYRIGHT'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33. ' Ö Cisplatyna (cis-diaminodichloroplatyna II) jest powszechnie stosowanym lekiem charakteryzującym się dużą skutecznością w terapii nowotworów złośliwych jąder, jajników, pęcherza moczowego, płuc, głowy i szyi. Po wniknięciu do wnętrza komórki drogą dyfuzji prostej lub transportu aktywnego, w wyniku hydrolizy, podczas której jon chlorkowy w pozycji cis jest zastępowany przez cząsteczkę wody, cisplatyna ulega przekształceniu w postać aktywną, która reaguje z nukleofilowymi molekułami takimi jak DNA, RNA, białka i fosfolipidy błonowe. Cytotoksyczna aktywność cisplatyny związana jest z tworzeniem interi intramolekularnych wiązań z DNA, co zaburza procesy replikacji, transkrypcji, translacji prowadząc do zatrzymania cyklu komórkowego i aktywacji ścieżek sygnałowych kierujących komórki nowotworowe na drogę apoptozy [1]. Jednym z postulowanych mechanizmów apoptozy jest udział nietrwałych, bardzo reaktywnych produktów posiadających niesparowany elektron, zwanych reaktywnymi formami tlenu (RFT). W celu uzyskania bardziej stabilnej struktury, RFT reagują z różnymi składnikami komórek, inicjując wolnorodnikowe procesy peroksydacji lipidów, białek, węglowodanów, kwasów nukleinowych, co w rezultacie prowadzi do licznych zaburzeń procesów metabolicznych komórki [2]. Dowiedziono, że indukowanej przez cisplatynę apoptozie towarzyszy wzrost poziomu RFT oraz produktów peroksydacji białek i lipidów, a zastosowanie antyoksydantów takich jak N-acetylocysteina czy glutation znosi cytotoksyczne działanie tego leku i przeciwdziała śmierci komórek [3]. Ponieważ zarówno nadmiar RFT, jak ich brak jest niekorzystny, komórki wykształciły liczne mechanizmy obronne mające zapewnić optymalny poziom RFT. System obronny tworzą enzymy antyoksydacyjne m.in. dysmutaza ponadtlenkowa (SOD), katalaza (CAT), peroksydazy glutationowe (GPx), peroksyredoksyny, transferazy glutationowe (GSTs) oraz nieenzymatyczne zmiatacze wolnych rodników, np. glutation, tioredoksyna, tokoferol, metalotioneiny, kwas askorbinowy, czy kwas moczowy [2]. Prawidłowe funkcjonowanie sytemu antyoksydacyjnego zapewnia ochronę komórce przed niepożądaną aktywnością RFT. Komórki nowotworowe charakteryzują się odmiennym metabolizmem i w przeciwieństwie do komórek prawidłowych, zdolne są do życia w warunkach stresu oksydacyjnego. Nadmiar RFT w tych komórkach może zwiększać ich proliferację, ale nie prowadzić do ich różnicowania, bądź nie kierować ich na drogę apoptozy [2, 4]. Istotnym problemem stosowania cisplatyny w terapii nowotworów jest pierwotna lub nabyta podczas leczenia oporność komórek nowotworowych na działanie tego leku. Wśród przyczyn oporności komórek nowotworowych na cisplatynę wymieniane są mechanizmy zapobiegające powstawaniu adduktów DNA-cisplatyna przez zmniejszenie kumulacji cisplatyny w komórce wskutek zmniejszonego wnikania leku do komórki, nasilonych procesów detoksykacyjnych powodujących zwiększone usuwanie leku z komórki oraz mechanizmy polegające na blokowaniu śmierci komórki przez zwiększenie procesów naprawczych DNA, zwiększenie tolerancji komórki na uszkodzony i zmodyfikowany przez lek materiał genetyczny [1]. Jedną z postu- lowanych hipotez przyczyn oporności na leczenie, któremu towarzyszy generowanie znacznych ilości RFT, takich jak chemioterapia, radioterapia, czy terapia fotodynamiczna jest zwiększona obrona antyoksydacyjna w komórkach nowotworowych spowodowana m.in. nadekspresją genów kodujących białka i enzymy o działaniu antyoksydacyjnym, detoksykacyjnym, cytoprotekcyjnym [5, 6]. Ekspresja genów związanych z obroną antyoksydacyjną w komórkach, które były poddane działaniu stresu oksydacyjnemu, może być oceniana za pomocą metody mikromacierzy oligonukleotydowych. Technika ta pozwala na ocenę transkryptomu komórki i porównanie ekspresji wybranego zbioru genów w komórkach z indukowanym stresem oksydacyjnym, np. przez cisplatynę, względem komórek kontrolnych. Celem przedstawionej pracy było porównanie transkryptomów związanych z obroną antyoksydacyjną w różniących się wrażliwością na cisplatynę komórkach ludzkich linii nowotworowych HL-60 (białaczki promielocytarnej) i SW707 (gruczolakoraka okrężnicy), oraz określenie zmian w profilu ekspresji genów kodujących białka uczestniczące w obronie antyoksydacyjnej pod wpływem tego leku. Do analizy ekspresji genów zastosowano technikę mikromacierzy oligonukleotydowych HG-U133A (Affymetrix). - Rl-tlR |J¬ Hodowle Komórkowe. Materiał do badań stanowiły hodowane komórki ludzkich linii nowotworowych: białaczki promielocytarnej HL-60 i gruczolakoraka okrężnicy SW707. Komórki HL-60 hodowano w mieszaninie RPMI 1640 (Gibco) z dodatkiem 10% FBS (Sigma), 100 μg /ml streptomycyny, 100 U/ml penicyliny (Polfa Tarchomin), 2 mM glutaminy (Sigma), 1 mM pirogronianu sodu (Sigma) i 4,5 g/l glukozy. Dla hodowli SW707 medium hodowlane stanowiła mieszanina RPMI 1640+OptiMEM 50:50 (Gibco) z dodatkiem 5% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) (Sigma), 100 μg/ml streptomycyny, 100 U/ml penicyliny (Polfa Tarchomin) oraz 2 mM glutaminy (Sigma). Hodowle komórkowe prowadzone były w warunkach porównywalnych do warunków fizjologicznych, zgodnie z wymogami hodowli in vitro, w specjalnie do tego przeznaczonych polistyrenowych naczyniach. Po 48 h inkubacji w 37˚C, w wilgotnej atmosferze nasyconej 5% CO2, dodawano po 2 ml roztworu cisplatyny (Sigma), tak aby w hodowlach uzyskać stężenia zgodne z wartościami ID30 (Inhibitory Dose 30%). Cisplatynę rozpuszczano w DMSO a następnie rozcieńczano za pomocą właściwej dla danej hodowli pożywki w taki sposób, aby ilość dodawanego do każdej hodowli DMSO była jednakowa. W hodowli HL-60 stężenie cisplatyny wynosiło 0,22 μg/ml, a w hodowli SW707 0,56 μg/ml. Hodowle kontrolne nie zawierały dodatku cisplatyny, ani DMSO. Po 6 godzinach inkubowania hodowli HL-60 i SW707 z cisplatyną w obecności DMSO oraz DMSO - stanowiącym układ odniesienia, w temperaturze 37˚C, w wilgotnej atmosferze nasyconej 5% CO2, komórki zbierano i przygotowywano do ekstrakcji RNA. Ekstrakcja Całkowitego RNA. RNA ekstrahowano z użyciem odczynnika TRIZOL (Invitrogen Life Technologies), zgodnie z protokołem producenta. Ekstrakty całkowitego &ARM0RZEGL.AUK nazwa sondy symbol genu 202831_at GPX2 39729_at PRDX2 219489_s_at NXN 210519_s_at NQO1 211922_s_at CAT 201432_at CAT 204655_at CCL5 nazwa kodowanego białka peroksydaza gluationowa 2 (żołądkowo-jelitowa) (glutathione peroxidase 2, gastrointestinal) peroksydaza zależna od tioredoksyny 2 (peroksyredoksyna) (peroxiredoxin 2) nukleoredoksyna (nucleoredoxin) oksydoreduktaza NAD(P)H: chinon 1 (NAD(P)H dehydrogenase, quinone 1) katalaza (catalase) katalaza (catalase) wartość SLR chemokina CCL5 (RANTES) (chemokine (C-C motif) ligand 5) -2,72 5,18 4,85 3,65 2,85 -3,93 -2,8 Tabela I. Transkrypty różnicujące hodowle kontrolne komórek SW707 porównane w odniesieniu do hodowli kontrolnych HL-60 wybrane spośród 87 sond związanych z obroną antyoksydacyjną (SLR – ang. signal log ratio – stosunek zlogarytmowanych uśrednionych wartości fluorescencji transkryptu w porównywanych grupach, strzałka ↑ - nadekspresja, strzałka ↓ - spadek ekspresji genu w komórkach SW707). RNA oczyszczono z wykorzystaniem zestawu RNeasy Mini Kit (Qiagen), w celu usunięcia ewentualnych zanieczyszczeń DNA. Ekstrakty RNA oceniano ilościowo przy użyciu spektrofotometru GeneQuant II (Pharmacia Biotech). Wartość absorbancji przy długości fali 260 nm była podstawą do obliczenia stężenia RNA, przy założeniu, że wynik pomiaru w kuwecie o drodze optycznej 1 cm równy 1 OD260 odpowiada stężeniu 40 μg RNA w 1 cm3 ekstraktu, oraz jakościowo techniką elektroforezy w 1% żelu agarozowym barwionym bromkiem etydyny. Wyznaczanie Transkryptomu Metodą Mikromacierzy Oligonukleotydowych HG-U133A (Affymetrix). Około 8 μg całkowitego RNA zostało wykorzystane do syntezy dwuniciowego cDNA (Gibco BRL SuperScript Choice system), które stanowiło matrycę do syntezy biotynylowanego cRNA (reakcja transkrypcji in vitro, Enzo kit). Po fragmentacji biotynylowanego cRNA przeprowadzono hybrydyzację z mikromacierzą Test3 oraz HG-U133A (Affymetrix). Znakowanie produktów hybrydyzacji przeprowadzono kilkustopniowo kompleksem streptawidyna–fikoerytryna, znakowanymi przeciwciałami przeciw biotynie oraz przeciwciałami przeciw kompleksowi streptawidyna–fikoerytryna zgodnie z protokołem EukGEWS2v4 zalecanym dla mikromacierzy oligonukleotydowej HG–U133A w przewodniku Gene Expression Analysis Technical Manual (Affymetrix). W następnym etapie płytki mikromacierzy poddano skanowaniu skanerem Agilent GeneArray Scanner G2500A (Agilent Technologies). Otrzymane wyniki intensywności fluorescencji zostały zapisane i zarchiwizowane w programie Microarray Suite. Analizę porównawczą transkryptomów przeprowadzono po normalizacji wyników w programie RMA Expres wykorzystując programy komputerowe: Statistica v.7,0, Gnumeric, oraz Microsoft Excel '¬ylpl Analizę profilu ekspresji genów kodujących białka związane z obroną antyoksydacyjną poprzedzono porównaniem raportów wygenerowanych w programie Microarray Suite Affymetrix bezpośrednio po odczycie sygnałów fluorescen- cji na mikromacierzy. Rozkład sygnałów fluorescencji na płytce, zgodny z zaleceniami producenta mikromacierzy (Affymetrix „Technical Manual GeneChip Expression Analysis”) był podstawą do akceptacji kolejnych transkryptomów do analizy porównawczej, którą rozpoczęto od normalizacji wyników w programie RMA Express, w celu wyrównania zróżnicowanych wartości tła oraz szumu, zmniejszającego prawdopodobieństwo błędnej interpretacji wyników. Zbiór 87 genów związanych z obroną antyoksydacyjną uzyskano korzystając z bazy danych bazy NCBI, bazy Affymetrix NetAffxTM Analysis Centem, komercyjnie dostępnego zestawu firmy SABiosciences przeznaczonego do badania genów stresu oksydacyjnego i obrony antyoksydacyjnej oraz danych literaturowych. W dalszym etapie analizy porównawczej z grupy 22283 mRNA, które można analizować na mikromacierzy HGU133A, wyselekcjonowano 87 transkryptów za pomocą programu Gnumeric. Do oceny wyników wykorzystano metody klasteryzacji hierarchicznej oraz metodę Blanda – Altmana. Zastosowanie tych metod pozwoliło na wyznaczenie parametru SLR (signal log ratio) wskazującego wielokrotność różnicy sygnału fluorescencji i wskazanie genów związanych z obroną antyoksydacyjną których ekspresja różnicowała transkryptomy komórek HL60 i SW707 hodowli kontrolnych oraz których ekspresja w największym stopniu uległa zmianie pod wpływem cisplatyny. Jako geny różnicujące uznawano wszystkie geny, których sygnał fluorescencji (SLR) różnił się, co najmniej ± 2STD (dwukrotna wartość odchylenia standardowego). W badanych próbach zaobserwowano odmienne ilości genów różnicujących, które zostały przedstawione w tabelach I oraz II, z uwzględnieniem nazwy sondy, symbolu genu, nazwy kodowanego białka, oraz wartości SLR dla transkryptów różnicujących. Jak wynika z danych zebranych w tabeli I profil ekspresji genów kodujących białka obrony antyoksydacyjnej hodowli kontrolnych komórek SW707 porównywanych w odniesieniu do hodowli kontrolnych komórek HL-60 charakteryzuje zwiększony poziom ekspresji genów GPX2, NQO1, NXN, PRDX2 oraz zmniejszony poziom ekspresji CAT i CCL5. Po ekspozycji na cisplatynę komórek SW707 tylko jeden transkrypt TXN (wartość SLR: – 1,53 dla sondy 216609_at) spełniał kryterium genu różnicującego i obserwowano spadek jego ekspresji względem COPYRIGHT'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33. do degradacji. Czynniki takie jak oksydanty, czy ksenobiotyki powodują uwol1405_i_at -1,72 nienie Nrf-2 z kompleksu Keap1-Nrf-2 i transport aktywnego Nrf-2 do jądra ko204655_at -1,51 mórkowego, gdzie wiąże się z elementem odpowiedzi antyoksydacyjnej (ARE, ang. 201468_s_at -1,59 antioxidant response element) jądrowego 210519_s_at -1,11 DNA za pośrednictwem motywu zamTabela II. Transkrypty różnicujące hodowle komórek HL-60 eksponowane na cisplaty- ka leucynowego(bZIP). Nrf2 aktywunę względem prób odniesienia (hodowli HL-60 eksponowanych na DMSO) wybrane je większość genów kodujących białka spośród 87 sond związanych z obroną antyoksydacyjną (SLR – ang. signal log ratio o działaniu antyoksydacyjnym, detoksy– stosunek zlogarytmowanych uśrednionych wartości fluorescencji transkryptu w po- kacyjnym i cytoprotekcyjnym, takie jak równywanych grupach, strzałka ↑ - nadekspresja, strzałka ↓ - spadek ekspresji genu SOD, CAT, GPx, reduktazę tioredoksyny, GSTs, oksydoreduktazę NAD(P) w komórkach HL-60 eksponowanych na cisplatynę). H: chinon 1 (NQO1, DT-diaforazę, EC 1.6.99.2), które unieszkodliwiając RFT prób odniesienia (eksponowanych na DMSO). Transkrypi reaktywne metabolity ksenobiotyków stabilizują potencjał tomy komórek HL-60 eksponowanych na cisplatynę wzglęoksydacyjno-redukcyjny komórki. Doniesienia literaturowe dem transkryptomów hodowli odniesienia (eksponowanych ostatnich lat podkreślają, że w komórkach prawidłowych na DMSO) różnicuje obniżona ekspresja transkryptów ścieżka sygnalizacyjna zależna od Nrf-2 zapewnia ochroNQO1 i CCL5 (Tab. II). Genami o znacznie zmienionej eksnę przed wywoływanym przez m.in. ksenobiotyki stresem presji, chociaż niespełniających kryteriów dla genów różoksydacyjnym i jego skutkami, natomiast w komórkach nonicujących (SLR-1, SLR+1) okazały się GSTZ1 (wartość wotworowych przedłużający się stan aktywności Nrf-2 pełSLR: 0,999 dla sondy 209531_at) w komórkach HL-60 oraz ni istotną rolę w rozwoju oporności tych komórek na różnoCAT w komórkach SW707 (wartości SLR: 0,851 i 0,972 odrodne terapie, którym towarzyszy generowanie znacznych powiednio dla sond 201432_at; 211922_s_at), których eksilości RFT, takie chemioterapia, radioterapia, terapia fotopresja była stymulowana obecnością cisplatyny. dynamiczna. Jedną ze strategii przywracania wrażliwości opornym komórkom nowotworowym może być inhibicja ¬p¥oNrf-2 za pomocą siRNA [5, 6]. Zastosowana w naszych badaniach metoda mikromacieOd wielu lat trwają intensywne poszukiwania sposobów rzy oligonukleotydowych umożliwiła przeprowadzenie anazwiększenia efektywności terapii przeciwnowotworowej lizy porównawczej transkryptomów związanych z obroną oraz zminimalizowania niepożądanych efektów towarzysząantyoksydacyjną w komórkach ludzkich linii nowotworocych procesom leczenia nowotworów. Skuteczność cisplawych białaczki promielocytarnej HL-60 oraz gruczolakoratyny zależy między innymi od dawki i wrażliwości komórek nowotworowych, jednakże wraz ze wzrostem dawki tego ka okrężnicy SW707, a także określenie wpływu cisplatyny leku rośnie toksyczność względem tkanek prawidłowych. na profil ekspresji genów kodujących białka uczestniczące Mechanizmy toksyczności cisplatyny nie są w pełni pozna- w obronie antyoksydacyjnej. Rezultaty analizy porównawne, chociaż przeważa pogląd, że zjawisko to jest związane ze czej transkryptomów hodowli kontrolnych pokazują, że kozdolnością tego leku do generowania znacznych ilości RFT, mórki SW707 w odróżnieniu od komórek HL-60 charakteco przy jednoczesnym obniżeniu wewnątrzkomórkowego ryzuje zwiększony poziom ekspresji genów GPX2, NQO1, stężenia glutationu i aktywności enzymów antyoksydacyj- NXN, PRDX2, co może świadczyć o ich zwiększonym nych, prowadzi do zachwiania równowagi prooksydacyjno potencjale antyoksydacyjnym i sugerować występowanie antyoksydacyjnej, sprzyja powstawaniu stresu oksydacyj- pierwotnej oporności wielolekowej związanej z nadmierną nego i w konsekwencji warunkuje neuro-, nefro- i ototok- obroną antyoksydacyjną. GPX2 jest genem kodującym ensyczność, a tym samym ogranicza stosowanie tego leku zym peroksydazę glutationową 2 (GPX2) katalizującą detoksykację nadtlenku wodoru. Udowodniono, że w komórkach w terapii [7, 8]. Komórki nowotworowe charakteryzuje różna wrażliwość nowotworowych GPX2 ulega przeważnie nadekspresji [10]. na cytotoksyczne działanie cisplatyny, np. badania kliniczne Wydaje się, że wzrost ekspresji GPX w komórkach prawijak i eksperymentalne pokazują, że większość nowotworów dłowych zapewnia równowagę prooksydacyjno antyoksyokrężnicy i odbytnicy wykazuje oporność na terapię [9]. dacyjną, natomiast w komórkach ulegających transformacji Pierwotna lub nabyta podczas leczenia oporność komórek nowotworowej wzrost aktywności tego genu może zapobienowotworowych na działanie leków znacznie ogranicza sku- gać indukowanej przez uszkodzenia oksydacyjne programoteczność chemioterapii, a tym samym zmniejsza prawdopo- wanej śmierci komórki [4]. NXN koduje białka uczestnicządobieństwo wyleczenia. Jedną z przyczyn oporności komó- ce w procesach wzrostu i różnicowania komórek. Białka te rek nowotworowych na działanie leków zwiększona obrona zaliczane są do rodziny tioredoksyny [11]. Peroksydaza zaantyoksydacyjna. Główną rolę w indukcji białek obrony leżna od tioredoksyny (peroksyredoksyna) kodowana przez antyoksydacyjnej i enzymów II fazy detoksykacji odgrywa PRDX, katalizuje redukcję nadtlenku wodoru i wodoronadczynnik transkrypcyjny Nrf2 (nuclear erythroid 2-related tlenków lipidowych wykorzystując jako źródło elektronów factor). W warunkach fizjologicznych Nrf-2 jest związany tioredoksynę. W organizmie człowieka występuje szereg z cytoplazmatycznym białkiem Keap1 i kierowany szybko izoform peroksyredoksyny, niektóre z nich uczestniczą nazwa sondy symbol genu nazwa kodowanego białka chemokina CCL5 (RANTES) CCL5 (chemokine (C-C motif) ligand 5) chemokina CCL5 (RANTES) CCL5 (chemokine (C-C motif) ligand 5) oksydoreduktaza NAD(P)H: chinon 1 NQO1 (NAD(P)H dehydrogenase, quinone 1) oksydoreduktaza NAD(P)H: chinon 1 NQO1 (NAD(P)H dehydrogenase, quinone 1) wartość SLR &ARM0RZEGL.AUK w regulacji procesów takich jak proliferacja i apoptoza [12]. Wartości stężeń ID30, przy których zahamowanie proliferacji wynosi 30% wynoszące odpowiednio dla komórek HL60 0,22 μg/ml, a dla komórek SW707 0,56 μg/ml, również wskazują na mniejszą wrażliwość komórek SW707 na cytotoksyczne działanie cisplatyny. W komórkach SW707 eksponowanych na cisplatynę wśród genów związanych z obroną antyoksydacyjną stwierdzono spadek ekspresji genu TXN (kodującego tioredoksynę) oraz znaczny wzrost ekspresji genu CAT (kodującego enzym katalazę), który może świadczyć o kompensacyjnej reakcji komórek SW707 na indukowany przez cisplatynę stres oksydacyjny, co także może prowadzić do indukowania oporności na lek. Tioredoksyna jest wielofunkcyjnym polipeptydem, zawierającym w swej strukturze dwie reszty cysteinylowe, których grupy tiolowe mogą ulegać utlenianiu z wytworzeniem mostków disiarczkowych. Zdolność do reakcji wymiany grupy tiolowej i mostków disiarczkowych powoduje, że tioredoksyna, podobnie jak glutation, zapobiega oksydacyjnym modyfikacjom białek poprzez redukowanie mostków disiarczkowych powstających w wyniku działania utleniaczy. Utleniona postać tioredoksyny ulega redukcji przy udziale reduktazy tioredoksyny w obecności NADPH. Ponadto, tioredoksyna wpływa na proces apoptozy poprzez oddziaływanie na kinazę ASK 1 (apoptosis signalregulated kinase 1). Opisywana w literaturze nadekspresja TXN w komórkach nowotworowych, nie tylko warunkuje oporność na chemioterapię, ale także zwiększa proliferację i przeżywalność tych komórek w obrębie guza w porównaniu do komórek nowotworowych, które nie wykazują zwiększonej ekspresji tego genu [12, 13]. Cytotoksyczność cisplatyny względem komórek SW707 może być związana z hamowaniem aktywności wewnątrzkomórkowego układu tioredoksyny, w którego skład wchodzi: tioredoksyna, reduktaza tioredoksyny i NADPH. Inhibicja tego systemu jest związana z nieodwracalną, kowalencyjną modyfikacją centrum aktywnego reduktazy tioredoksyny przez cisplatynę [14]. Rezultaty naszych badań pokazują, że ekspozycja komórek HL-60 na cisplatynę powoduje obniżenie ekspresji transkryptów genów NQO1 i CCL5 oraz wzrost ekspresji GSTZ1. Wzrost aktywności GSTs związany jest z intensywnymi procesami detoksykacji i często jest przyczyną oporności komórek nowotworowych na chemioterapię, dlatego GSTs są stosowane jako marker oporności na dany chemioterapeutyk [15]. NQO1 katalizuje reakcję dwuelektronowej redukcji związków chinonowych, dzięki czemu zapobiega powstawaniu wolnych rodników semichinonowych i RFT, co chroni komórkę przed oksydacyjnymi uszkodzeniami oraz pełni ważną funkcję w prewencji nowotworów. Enzym ten uczestniczy w aktywacji leków przeciwnowotworowych o strukturze chinonów, takich jak mitomycyny i antracykliny. Ponadto NQO1 wykazuje właściwości hamowania proliferacji komórek nowotworowych przez wzrost p53 i indukcję apoptozy. Obniżenie aktywności NQO1 wskutek polimorfizmu zwiększa ryzyko niektórych chorób nowotworowych m.in. białaczek, a także zmniejsza odpowiedź komórek nowotworowych na leczenie na skutek obniżenia poziomu p53 i indukowanej przez leki apoptozy w konsekwencji zmniejszając skuteczność terapii. Aktualne doniesienia literaturowe sugerują, że polimorfizm NQO1 może stanowić czynnik ryzyka zachorowania na przewlekłą białaczkę limfocytarną oraz czynnik predykcyjny odpowiedzi na chemioterapię białaczek [16] i radioterapię po operacyjnym usunięciu niedrobnokomórkowego raka płuc [17]. Niektóre doniesienia literaturowe sugerują, że NQO1 redukując endogenne związki takie jak, np. α-tokoferol, zapewnia wysokie stężenia ich zredukowanych form, co odgrywa istotna rolę w rozwoju oporności komórek nowotworowych na działanie leków [18]. Gen CCL5 koduje chemokinę CCL5 (RANTES). Do wytwarzania CCL5 zdolnych jest wiele rodzajów komórek nowotworowych. Jak wynika z doniesień literaturowych CCL5 może stanowić wskaźnik pomocny w rozpoznawaniu i prognozowaniu schorzeń nowotworowych. Wykazano wzrost ekspresji CCL5 wraz ze stopniem zaawansowania choroby nowotworowej piersi, żołądka, płuc, co sugeruje udział tej chemokiny w progresji procesu nowotworowego, zaś obecność tej chemokiny w niektórych zmianach łagodnych może przemawiać za początkiem procesu złośliwego. Powszechnie akceptowany jest pogląd, że sieć cytokin odgrywa istotną rolę w biologii nowotworów pierwotnych i przerzutowych takich jak kontrola infiltracji leukocytów do wnętrza guza, modyfikacja odpowiedzi immunologicznej guza, regulacja angiogenezy, działanie jako autokrynne lub parakrynne czynniki wzrostu i przeżycia oraz bezpośrednie odrywanie się komórek nowotworowych od macierzystego guza. Biologiczna aktywność chemokin w większości nowotworów bardziej ułatwia ich rozwój i rozprzestrzenianie się niż indukuje immunologiczną odpowiedź przeciwnowotworową [19]. Ekspozycja komórek HL-60 na cisplatynę spowodowała zmniejszenie ekspresji CCL5. Odmienne efekty opisali Levina i wsp. [20], którzy traktując komórki ludzkich linii nowotworowych cisplatyną lub doksorubicyną obserwowali wzrost wydzielania szeregu chemokin, m.in. CCL5, co zwiększało potencjał proliferacyjny i antyapoptotyczny komórek i zmniejszało ich wrażliwość na działanie leków. Takie różnice w wynikach badań mogą być spowodowane znaczną liczbą wzajemnych zależności i powiązań między poszczególnymi chemokinami w różnych typach nowotworów. Zaangażowanie chemokin i ich receptorów w choroby nowotworowe stwarza możliwości terapeutycznej interwencji. Wydaje się, że zablokowanie reakcji chemokina-receptor może zahamować lub opóźnić rozwój procesów nowotworzenia. Analizując otrzymane wyniki w kontekście aktualnych doniesień literaturowych wydaje się, że w komórkach HL60 nie występuje oporność spowodowana nadmierną ekspresją genów kodujących białka obrony antyoksydacyjnej w odróżnieniu od komórek SW707 charakteryzujących się zwiększonym potencjałem antyoksydacyjnym i przez to zmniejszoną wrażliwością na terapię przeciwnowotworową, której towarzyszy indukcja stresu oksydacyjnego. Oznaczanie poziomu wskaźników obrony antyoksydacyjnej powinno być zatem brane pod uwagę jako jeden z czynników decydujących o doborze odpowiedniej terapii. 'yl|pl 1. Transkryptomy hodowli kontrolnych SW707 porównywane w odniesieniu do transkryptomów HL-60 charakteryzuje zwiększony poziom ekspresji genów GPX2, COPYRIGHT'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33. NQO1, NXN, PRDX2 oraz zmniejszony poziom ekspresji CAT i CCL5. 2. Ekspozycji komórek SW707 na cisplatynę towarzyszy spadek ekspresji genu TXN oraz znaczny wzrost ekspresji genu CAT. 3. Ekspozycja komórek HL-60 na cisplatynę powoduje obniżenie ekspresji transkryptów NQO1 i CCL5 oraz znaczny wzrost ekspresji GSTZ1. 4. W komórkach HL-60 nie występuje nadmierna ekspresja genów kodujących białka obrony antyoksydacyjnej w odróżnieniu od komórek SW707 charakteryzujących się zwiększonym potencjałem antyoksydacyjnym, co może być jedną z przyczyn zmniejszenia wrażliwości na terapię przeciwnowotworową, której towarzyszy indukcja stresu oksydacyjnego, co sugeruje celowość oznaczania poziomu wskaźników obrony antyoksydacyjnej, które powinno być brane pod uwagę jako jeden z czynników decydujących o doborze odpowiedniej terapii. Wykorzystane do analizy ekspresji genów komórki ludzkich linii nowotworowych: białaczki promielocytarnej HL60 i gruczolakoraka okrężnicy SW707 zostały wyhodowane przez dr Joannę Wietrzyk i mgr Martę Świtalską w Laboratorium Doświadczalnej Terapii Przeciwnowotworowej Instytutu Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN we Wrocławiu. Piśmiennictwo 1. Kelland L. The resurgence of platinum – based cancer chemotherapy. Nat Rev Cancer 2007; 7: 573-584. 2. Das U. A radical approach to cancer. Med Sci Monit 2002, 8: RA79-92. 3. Previati M i wsp. Cisplatin-induced apoptosis in human promyelocytic leukemia cells. Int J Mol Med 2006; 18: 511-516. 4. Halliwell B. Oxidative stress and cancer: have we moved forward? Biochem J 2007; 401: 1–11. 5. Cho JM i wsp. Role of the Nrf2-antioxidant system in cytotoxicity mediated by anticancer cisplatin: implication to cancer cell resistance. Cancer Lett 2008; 260: 96–108. 6. Wang XJ i wsp. Nrf2 enhances resistance of cancer cells to chemotherapeutic drugs, the dark side of Nrf2. Carcinogenesis 2008; 29: 1235–1243. 7. Hanigan MH, Devarajan P. Cisplatin nephrotoxicity: molecular mechanisms. Cancer Ther 2003; 1: 47–61. 8. Rybak LP i wsp. Mechanisms of cisplatin-induced ototoxicity and prevention. Hear Res 2007; 226: 157–167. 9. Kulbacka J, Saczko J, Chwiłkowska A. Rak jelita grubego - charakterystyka i oporność na leczenie. Onkol Prak Klin 2008; 4: 135–140. 10. Chu FF, Esworthy RS, Doroshow JH. Role of Se-dependent glutathione peroxidases in gastrointestinal inflammation and cancer. Free Radic Biol Med 2004; 36: 1481-1495. 11. Funato Y, Miki H. Nucleoredoxin, a novel thioredoxin family member involved in cell growth and differentiation. Antioxid Redox Signal 2007; 9: 1035–1057. 12. Cha MK, Suh KH, Kim IH. Overexpression of peroxiredoxin I and thioredoxin1 in human breast carcinoma. J Exp Clin Cancer Res 2009; 28:93. 13. Biaglow JE, Miller RA. The thioredoxin reductase/thioredoxin system: novel redox targets for cancer therapy. Cancer Biol Ther 2005 4: 6-13. 14. Arnér ES i wsp. Analysis of the inhibition of mammalian thioredoxin, thioredoxin reductase, and glutaredoxin by cis-diamminedichloroplatinum (II) and its major metabolite, the glutathione-platinum complex. Free Radic Biol Med 2001; 31: 1170-1178. 15. Wang W, Liu G, Zheng J. Human renal UOK130 tumor cells: a drug resistant cell line with highly selective overexpression of glutathione S-transferase-pi isozyme. Eur J Pharmacol 2007; 568: 61-67. 16. Begleiter A i wsp. Investigation of an NQO1 polymorphism as a possible risk and prognostic factor for chronic lymphocytic leukemia. Leuk Res 2009; 33: 74-81. 17. Song SY i wsp. Clinical significance of NQO1 C609T polymorphisms after postoperative radiation therapy in completely resected non-small cell lung cancer. Lung Cancer xxx (2009) xxx–xxx http://dx.doi.org/10.1016/j. lungcan.2009.06.009 18. Ross D i wsp. NAD(P)H: quinone oxidoreductase 1 (NQO1): chemoprotection, bioactivation, gene regulation and genetic polymorphisms. Chem Biol Interact 2000; 129: 77-97. 19. Slettenaar VI, Wilson JL. The chemokine network: A target in cancer biology? Adv Drug Deliv Rev 2006; 58: 962–974. 20. Levina V i wsp. Chemotherapeutic drugs and human tumor cells cytokine network. Int J Cancer 2008; 123: 2031-2040. Adres do korespondencji: Dr n. farm. Alicja Zajdel Katedra i Zakład Biofarmacji SUM ul. Narcyzów 1 41-200 Sosnowiec tel. (32) 364 10 63 e-mail: [email protected]
