docIdentyfikacja składników proteomu jądra komórkowego Arabidopsis
download 
Reklamacja Transkrypt
Identyfikacja składników proteomu jądra komórkowego Arabidopsis
Autoreferat rozprawy doktorskiej mgr Macieja Kotlińskiego Identyfikacja składników proteomu jądra komórkowego Arabidopsis thaliana i analiza modyfikacji potranslacyjnych histonu H1 Promotor: Prof. dr hab. Andrzej Jerzmanowski Zakład Biologii Systemów, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski Recenzenci: Prof. dr hab. Jacek Otlewski, Zakład Inżynierii Białka, Wydział Biotechnologii, Uniwersytet Wrocławski Prof. dr hab. Adam Dubin, Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii, Uniwersytet Jagielloński Jądro jest jedną z najważniejszych a zarazem, z powodu wyjątkowej złożoności, najsłabiej poznanych organelli komórki. Proteom jądra jest wysoce dynamiczny i, ze względu na liczne połączenia z cytoplazmą i stałą wymianę białek pomiędzy organellami, trudny do zdefiniowania. W literaturze brak kompleksowych badań proteomicznych jądra komórek roślinnych, w szczególności Arabidopsis, najważniejszego organizmu modelowego w biologii roślin. Przedstawione tu badania są pierwszą tego rodzaju analizą proteomu jądrowego Arabidopsis. Ważnym aspektem badania proteomów jest analiza modyfikacji potranslacyjnych białek, które mają kluczowe znaczenie dla pełnionych przez nie funkcji. Jednym z głównych składników proteomu jądra komórkowego są białka histonowe. Modyfikacje potranslacyjne histonów pełnią istotną rolę w procesach regulacji ekspresji genów. Podczas gdy modyfikacje potranslacyjne histonów rdzeniowych są od wielu lat obiektem intensywnych badań, histon H1 jest pod tym względem słabiej poznany. Modyfikacje potranslacyjne tego białka były badane u zwierząt. Modyfikacje roślinnego histonu H1 nie zostały dotąd scharakteryzowane. W pracy opisano wyniki pierwszej kompleksowej potranslacyjnych występujących na roślinnym histonie H1. analizy modyfikacji Jądra użyte do analiz proteomicznych izolowano z zawiesinowej kultury komórek T-87, w sześciu powtórzeniach biologicznych, za pomocą opracowanej w tym celu metody. Zastosowano podejście ‘shotgun proteomics’, polegające na trawieniu całego proteomu i późniejszej analizie mieszaniny peptydów przy pomocy systemu HPLC połączonego ze spektrometrem mas. Użycie spektrometru mas Orbitrap Velos pozwoliło na zastosowanie strategii ‘high-high’, w której zarówno pomiary widm MS, jak i MS/MS przeprowadzano z wysoką rozdzielczością. Łącznie wykryto 6 753 białka jądrowe, będące produktami 4 862 genów. Dla prezentacji wyników doświadczeń utworzono stronę www działającą w oparciu o bazę danych, pozwalającą na zmianę kryteriów identyfikacji białek. Aby stworzyć grupę odniesienia, przeanalizowano całościowy proteom komórek T‑87, co pozwoliło na identyfikację 6 342 białek, produktów 4 406 genów. Połowę z białek zidentyfikowanych w preparatach jądra komórkowego znaleziono w preparatach całych komórek. Znajdowały się wśród nich liczne białka typowe dla jądra, co sugeruje duży udział proteomu jądra w proteomie badanych komórek. Analizy „Gene Ontology” wykazały zasadnicze różnice klas białek wzbogaconych w obu badanych preparatach. Izolacja białek histonowych z roślin jest trudniejsza niż izolacja histonów z tkanek zwierzęcych, ze względu na obecność licznych metabolitów wtórnych, polisacharydów, itp. Dodatkowym problemem podczas preparatyki histonów z Arabiodopsis jest mały genom, a co za tym idzie niewielka liczba cząsteczek histonów przypadająca na jedną komórkę. Wykonanie opisanych badań histonu H1 Arabidopsis wymagało opracowania metody jego izolacji i rozdziału za pomocą HPLC, co doprowadziło do odkrycia, że stężenie nieallelicznego wariantu H1.2 jest 13‑to krotnie wyższe niż drugiego wariantu H1.1. Ze względu na brak wydajnych metod izolacji histonu H1 z Arabidopsis, do tej pory przyjmowano, że stężenia H1.1 i H1.2 są zbliżone podobnie, jak stężenia kodujących je transkryptów. Stwierdzono także występowanie mniejszego, nie wykrytego dotychczas produktu alternatywnego składania transkryptu H1.2. Przeprowadzone w niniejszej pracy analizy doprowadziły do wykrycia, po raz pierwszy, licznych modyfikacji potranslacyjnych histonu H1 takich, jak fosforylacja, acetylacja, krotonylacja, formylacja, mono- i di- metylacja oraz propionylacja. Okazało się, że wiele z tych modyfikacji występuje w obrębie silnie konserwowanej ewolucyjnie domeny globularnej histonu H1. Może to mieć istotny wpływ na siłę wiązania cząsteczek H1 z nukleosomem. W wyniku badań stwierdzono występowanie szeregu nieznanych modyfikacji potranslacyjnych oraz modyfikacji, których masa odpowiada masie modyfikacji nie znajdowanych do tej pory u Eucaryota. Okazało się, że do kwasu glutaminowego występującego w obrębie domeny N-końcowej H1.1 i H1.2, przyłącza się kation żelaza (II). W obrębie domeny N-końcowej H1 znaleziono także liczne miejsca fosforylacji. Wykryto, że fosforylacja N-końcowej seryny białka może współwystępować z przyłączeniem kationu żelaza (II). Należy dodać, że stwierdzenie natury chemicznej nie opisanych do tej pory modyfikacji potranslacyjnych, znalezionych podczas przeprowadzonych analiz, będzie wymagać kolejnych badań podobnie, jak stwierdzenie roli atomu żelaza przyłączanego do domeny N-końcowej histonu H1. Wykonane badania, zarówno proteomu jądra komórkowego, jak i modyfikacji potranslacyjnych histonu H1, pozwoliły na zgromadzenie dużej ilości danych, które mogą zostać poddane dalszym analizom. Warto zwrócić uwagę na liczne niedoskonałości oprogramowania stosowanego obecnie do analiz tego typu. Można się spodziewać, że wraz z rozwojem oprogramowania, zebrane dane mogą dostarczać coraz to nowych informacji o modyfikacjach potranslacyjnych histonu H1 oraz innych białkach obecnych w jądrze komórkowym.
