Metody immunoctytochemiczneDWA NUMERY

Metody immunocytochemiczne.
Barwienie fluorescencyjne komórek
prawidłowych i nowotworowych
PRAKTIKUM Z BIOLOGII KOMÓRKI
(BT 106)
Metody immunocytochemiczne...
BT 206, BT 231
Metody immunocytochemiczne. Barwienie fluorescencyjne komórek
prawidłowych i nowotworowych
Za prekursora immunocytochemii uważa się Alberta Coonsa, który zastosował
przeciwciała znakowane izotiocyjanianem fluoresceiny do wykrywania antygenów w
mrożonych skrawkach (1941r). Intensywny rozwój metod immunocytochemicznych
rozpoczął się w latach 70-tych XX w. Obecnie immunocytochemia stała się podstawową
metodą zarówno w badaniach struktury i funkcji komórek jak i diagnostyce
histopatologicznej.
Metody immunocytochemiczne polegają na wykrywaniu i lokalizacji składników
komórek i tkanek w oparciu o wysoce specyficzną reakcję wiązania antygen-przeciwciało.
Zazwyczaj stosuje się je do wykrywania antygenów za pomocą swoistych przeciwciał, choć
używa się również tzw. reakcji odwróconych, które polegają na wykrywaniu przeciwciał za
pomocą znakowanych antygenów. Antygenami mogą być przede wszystkim białka, ale
również polisacharydy i kwasy nukleinowe. Przeciwciała to immunoglobuliny
(syntetyzowane przez zwierzęta i ludzi w odpowiedzi na obecność antygenu), które posiadają
zdolność swoistego rozpoznania antygenu i wiązania się (poprzez anty-determinantę
zlokalizowaną w obrębie fragmentu Fab) z fragmentem antygenu zwanym determinantą
antygenową lub epitopem. Przeciwciała stosowane w immunocytochemii zazwyczaj należą
do klasy IgG i mogą być poliklonalne (zawierające mieszaninę przeciwciał przeciwko różnym
determinantom tego samego antygenu) lub monoklonalne (wszystkie skierowane przeciwko
takiej samej determinancie antygenowej).
Uwidocznienie miejsca wiązania się przeciwciała z antygenem zlokalizowanym w
komórce czy tkance możliwe jest jedynie pod warunkiem odpowiedniego znakowania.
Znaczniki nie powinny zmieniać właściwości substancji znakowanej (przeciwciała) oraz
muszą posiadać cechy, które dają możliwość ich bezpośredniej lub pośredniej obserwacji w
jednym z rodzajów mikroskopów (mikroskop jasnego-pola, fluorescencyjny lub
elektronowy). Najczęściej stosowanymi znacznikami są:
- fluorochromy ( w metodach immunofluorescencyjnych)
- enzymy (w metodach immunoenzymatycznych)
- białka zawierające metal ciężki (zazwyczaj ferrytyna zawierająca żelazo) lub metale
ciężkie, najczęściej złoto koloidalne, stosowane w badaniach ultrastrukturalnych (w
mikroskopii elektronowej).
Metody immunofluorescencyjne są obecnie powszechnie stosowane zarówno w
badaniach podstawowych jak i zastosowaniu do diagnostyki. Są stosunkowo mało
czasochłonne i proste w wykonywaniu, mogą być stosowane do wykrywania antygenów w
komórkach żywych, utrwalonych, na skrawkach tkankowych (kriostatowych lub
parafinowych) oraz antygenów osadzonych na różnych nośnikach (np. kulkach
spolimeryzowanej agarozy). Stosuje się różne rodzaje metod immunofluorescencyjnych:
- metody (reakcje) bezpośrednie (bezpośrednie wykrywanie antygenów w tkance za
pomocą
znakowanych fluorescencyjnie swoistych przeciwciał);
- metody pośrednie (w pierwszym etapie dokonuje się wiązania antygenu ze swoistym
przeciwciałem nieznakowanym, a następnie związane już z antygenem przeciwciało
lokalizuje się drugim przeciwciałem, znakowanym fluorochromem, skierowanym
2
BT 206, BT 231
Metody immunocytochemiczne...
BT 206, BT 231
przeciw immunoglobulinom zwierzęcia, od którego izolowano pierwsze
przeciwciało);
- reakcje dwu- lub trójbarwne (umożliwiające uwidocznienie 2 lub 3 antygenów w
tej samej komórce lub tkance, dzięki zastosowaniu kilku przeciwciał znakowanych
fluorochromami o różnych kolorach fluorescencji).
Metody pośrednie są czulsze od metod bezpośrednich, ale są bardziej czasochłonne
i skomplikowane,
co
zwiększa
ryzyko
wystąpienia
reakcji
niespecyficznych. Jest wiele przyczyn uzyskiwania fałszywych wyników reakcji
immunocytochemicznych. Reakcje fałszywie negatywne występują zazwyczaj w przypadku
nieprawidłowego utrwalania i przygotowywania komórek (skrawków tkankowych), które
może doprowadzić do zablokowania determinant antygenowych lub ucieczki antygenów z
badanego materiału. Najczęściej występującymi przyczynami reakcji fałszywie
pozytywnych są: niespecyficzna adsorpcja przeciwciał, obecność kilku antygenów
pokrewnych o podobnych epitopach, dyfuzja antygenów, a w przypadku stosowania metod
immunoenzymatycznych, występowanie endogennej aktywności enzymatycznej w badanej
tkance. Dlatego w badaniach immunocytochemicznych należy przestrzegać standaryzacji
wszystkich etapów używanej metody oraz stosować kontrole i testy na specyficzność
przeciwciał.
Cel doświadczenia:
Celem ćwiczenia jest praktyczne zapoznanie się z wybranymi metodami immunocytochemicznymi, z
metodą pośredniej immunofluorescencji i metodą immunoenzymatyczną oraz możliwościami wykrywania
obecności, lokalizacji i kolokalizacji rożnych struktur w komórkach zwierzęcych.
Przebieg ćwiczenia:
I. Identyfikacja filamentów pośrednich: cytokeratynowych i wimentynowych, w otrzymanych
komórkach metodą pośredniej immunofluorescencji.
II. Identyfikacja filamentów cytokeratynowych w otrzymanych komórkach pośrednią metodą
immunoenzymatyczną.
III. Porównanie przydatności obu metod do wykrywania takiego samego antygenu (cytokeratyny)
3
BT 206, BT 231
Metody immunocytochemiczne...
BT 206, BT 231
Wykonanie ćwiczenia:
Praca w dwuosobowych zespołach
1. Oglądnąć (w mikroskopie odwróconym) komórki wysiane na szkiełkach umieszczonych w szalkach
hodowlanych.
komórki prawidłowe –
fibroblasty skóry ludzkiej (HSF)
ludzkie fibroblasty oskrzeli (HBF)
komórki nowotworowe –
komórki XC (szczurzego mięsaka)
komórki HPC4 (raka trzustki)
2. Każdy zespół wybiera do barwienia 4 szalki ze szkiełkami z takimi samymi komórkami
(szkiełka tylko z komórkami prawidłowymi lub nowotworowymi).
3. Dwa szkiełka należy wykorzystać do identyfikacji wybranych filamentów cytoszkieletu:
mikrofilamentów, filamentów pośrednich (cytokeratynowych lub wimentynowych) lub mikrotubul
metodą pośredniej immunofluorescencji.
jedno szkiełko należy przeznaczyć do wykrywania poszukiwanego białka metodą
immunocytofluorescencji pośredniej (inkubacja utwalonych komórek kolejno z pierwszoi drugorzędowym przeciwciałem), drugie szkiełko wykorzystać do przeprowadzenia kontroli
negatywnej (inkubacja utrwalonych komórek tylko z drugorzędowym, znakowanym fluorescencyjnie
przeciwciałem
4. Dwa szkiełka należy wykorzystać do identyfikacji wybranych filamentów cytoszkieletu (takich
samych jak powyżej): mikrofilamentów, filamentów pośrednich (cytokeratynowych lub
wimentynowych) lub mikrotubul pośrednią metodą immunoenzymatyczną.
jedno szkiełko należy przeznaczyć do wykrywania poszukiwanego białka metodą
immunoenzymatyczną (inkubacja utrwalonych komórek kolejno z pierwszo- i drugorzędowym
przeciwciałem oraz substratem), drugie szkiełko wykorzystać do przeprowadzenia kontroli
negatywnej (bez inkubacji komórek z przeciwciałem przeciw poszukiwanemu antygenowi)
4
BT 206, BT 231
Metody immunocytochemiczne...
BT 206, BT 231
Identyfikacja filamentów cytoszkieletu metodą pośredniej immunofluorescencji
w wybranych komórkach z hodowli in vitro
Wybrać do barwienia 2 szkiełka z takimi samymi komórkami.
Utrwalanie komórek:
1. Zlać pożywkę z szalki znad szkiełek z komórkami i przepłukać szkiełka 3 razy roztworem PBS
o temp. 37oC.
2. Zlać PBS i zalać komórki 3,7% roztworem formaldehydu w PBS o temp. 37oC
i utrwalać komórki przez 15 min w cieplarce.
3. Zlać utrwalacz znad komórek i przepłukać szkiełka 3 razy roztworem PBS.
4. Zlać PBS i zalać komórki 0.1% roztworem Tritonu X-100 i pozostawić na 7 min w temperaturze
pokojowej.
5. Zlać Triton X-100 znad komórek i przepłukać szkiełka 3 razy PBS.
Inkubacja komórek z przeciwciałem I-rzędowym:
(nieznakowanym, swoistym przeciwciałem skierowanym przeciwko poszukiwanemu
antygenowi)
6. Zlać PBS i zalać komórki roztworem 1% BSA (albuminy surowicy wołowej) w PBS
i inkubować w temperaturze pokojowej około10 min.
7. Przygotować komory wilgotnościowe do barwienia komórek:
małe szalki szklane umieścić w dużych szalkach wyłożonych wilgotną watą (komory
wilgotnościowe), aby krople przeciwciała nie wysychały.
8. Inkubacja komórek z pierwszorzędowym przeciwciałem:
Na suchą małą szalkę położyć 1 pasek parafilmu o wielkości około 2cm x 2cm, na środek
każdego kawałka parafilmu nakropić 20µl przeciwciała.
(przeciwciało otrzymane od asystenta – jedno z poniższych)
- monoklonalne mysie przeciwciało przeciwko:
α-aktynie (α-SMA) (IgG)
α- tubulinie (IgG)
wimentynie (IgM)
cytokeratynie (IgG)
9. Wyjąć szkiełko z utrwalonymi komórkami z szalki, z roztworu BSA w PBS, osuszyć brzegi
szkiełka bibułą i położyć je na parafilmie, tak aby komórki dotykały kropli przeciwciała.
Inkubować komórki z pierwszym przeciwciałem 45 min w temperaturze pokojowej.
10. Po inkubacji komórek z przeciwciałem pierwszorzędowym szkiełko umieścić w szalce
wypełnionej roztworem PBS i przepłukać starannie 3 razy.
5
BT 206, BT 231
Metody immunocytochemiczne...
BT 206, BT 231
Inkubacja komórek z przeciwciałem II-rzędowym:
(znakowanym fluorescencyjnie przeciwciałem skierowanym przeciwko immunoglobulinom
zwierzęcia, od którego uzyskano przeciwciało I-rzędowe).
Roztwór przeciwciała może dodatkowo zawierać barwniki fluorescencyjne do wybarwienia
jąder i filamentów aktynowych.
11. Na wieczko małej szalki położyć paskek parafilmu o wielkości około 2cm x 2cm i na środek
nakropić 20µl odpowiedniej mieszaniny barwników (I lub II).
(mieszanina barwników otrzymana od asystenta),
Mieszanina I zawiera odpowiednio rozcieńczone:
- kozie przeciwciało anty-mysie IgG znakowane Alexa-488
- roztwór barwnika Hoechst 33258, o stężeniu 500ng/ml
oraz może zawierać falloidynę znakowaną Alexa546 w stężeniu 500ng/ml.
Mieszanina II zawiera odpowiednio rozcieńczone:
- kozie przeciwciało anty-mysie IgM znakowane Alexa-546
- roztwór barwnika Hoechst 33258, o stężeniu 500ng/ml
oraz falloidynę znakowaną Alexa488 w stężeniu 500ng/ml.
12. Barwione szkiełko z komórkami położyć na parafilmie tak, aby komórki dotykały kropli
mieszaniny barwników i barwić komórki 35 min w ciemności, w temperaturze pokojowej, w
szalce wyłożonej wilgotną watą.
13. Po zakończonym barwieniu zdjąć szkiełko z parafilmu i przenieść do szalki z H2O destylowaną
i wypłukać starannie 5 razy.
Przygotowanie preparatu:
14. Wyczyścić szkiełko podstawowe i nakropić na nie 2 razy po 10µl H2O destylowanej.
Na krople wody nałożyć kolejno (komórkami do wody):
szkiełko z wybarwionymi komórkami oraz szkiełko po reakcji kontrolnej, osuszyć brzegi
szkiełek bibułą i okleić je lakierem do paznokci.
15. Tak przygotowane preparaty oglądnąć w mikroskopie fluoresencyjnym przy odpowiednim
zestawie filtrów (wzbudzenia i emisji)
dla struktur barwionych:
Hoechst 33258
światło wzbudzające: UV (max 352nm), a emisja - światło niebieskie
Aleksa-Fluor 488:
światło wzbudzenia: niebieskie (max 488 nm), a emisja – światło zielone
Alexa546:
światło wzbudzenia: zielone (max 554 nm), a emisja – światło czerwone.
16. Porównać fluorescencyjne obrazy różnych elementów cytoszkieletu w komórkach prawidłowych
i nowotworowych ( preparaty wykonywane przez różnych studentów).
6
BT 206, BT 231
Metody immunocytochemiczne...
BT 206, BT 231
Identyfikacja filamentów cytoszkieletu pośrednią metodą immunoenzymatyczną w
wybranych komórkach z hodowli in vitro
Wybrać do barwienia 2 szkiełka z takimi samymi komórkami.
Utrwalanie komórek:
1. Zlać pożywkę z szalki, w której znajduje się szkiełko i przepłukać dokładnie szkiełko
roztworem PBS z jonami Ca2+, Mg2+ o temp. 37°C.
2. Zlać PBS i zalać komórki 3,7% roztworem formaldehydu w PBS o temp. 37°C i utrwalać
komórki przez 15 min w cieplarce.
3. Zlać utrwalacz znad komórek i przepłukać szkiełka 3 razy roztworem PBS.
4. Zlać PBS i zalać komórki 0.1% roztworem Tritonu X-100 i pozostawić na 7 min
w temperaturze pokojowej.
Inaktywacja endogennego enzymu znacznikowego:
5. Zlać Triton X-100 znad komórek i przepłukać szkiełka 2 razy PBS.
Zalać komórki 1 ml roztworu 0,1% H2O2 i inkubować komórki przez 5 minut.
6. Zlać wodę utlenioną i przepłukać trzykrotnie PBS.
Inkubacja komórek z przeciwciałem I-rzędowym:
(nieznakowanym, swoistym przeciwciałem skierowanym przeciwko poszukiwanemu
antygenowi)
7. Zlać PBS i zalać komórki roztworem 1% BSA (albuminy surowicy wołowej) w PBS
i inkubować w temperaturze pokojowej około 10 min.
8. Przygotować komory wilgotnościowe do barwienia komórek: małe szalki szklane umieścić
w dużych szalkach wyłożonych wilgotną watą (komory wilgotnościowe), aby krople
przeciwciała nie wysychały.
9. Inkubacja komórek z pierwszorzędowym przeciwciałem:
Na suchą małą szalkę położyć 1 pasek parafilmu o wielkości około 2cm x 2cm, na środek
kawałka parafilmu nakropić 20μl pierwszego przeciwciała.
(przeciwciało otrzymane od asystenta – jedno z poniższych)
- monoklonalne mysie przeciwciało przeciwko:
α-aktynie (α-SMA) (IgG)
α- tubulinie (IgG)
wimentynie (IgM)
cytokeratynie (IgG)
Wyjąć szkiełko z utrwalonymi komórkami z szalki, z roztworu BSA w PBS, osuszyć brzegi
szkiełka bibułą i położyć je na parafilmie, tak aby komórki dotykały kropli przeciwciała.
Inkubować komórki z pierwszym przeciwciałem 45 min w temperaturze pokojowej.
10. Po inkubacji komórek z przeciwciałem pierwszorzędowym szkiełko umieścić w szalce
wypełnionej roztworem PBS i przepłukać starannie 3 razy.
7
BT 206, BT 231
Metody immunocytochemiczne...
BT 206, BT 231
Inkubacja komórek z przeciwciałem II-rzędowym:
przeciwciałem znakowanym HRP (peroksydazą chrzanową) skierowanym przeciwko
immunoglobulinom zwierzęcia, od którego uzyskano przeciwciało I-rzędowe
(przeciwciało odpowiednio przeciwko mysim IgG lub IgM sprzężone z enzymem).
11. Inkubacja komórek z przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z peroksydazą
Na szalkę położyć pasek parafilmu o wielkości około 2cm x 2cm i na środek nakropić 20 μl
roztworu odpowiedniego przeciwciała:
kozie przeciwciało anty-mysie IgG lub anty-mysie IgM znakowane HRP
(HRP-conjugated anti-mouse antibody).
Szkiełka z komórkami położyć na parafilmie tak, aby komórki dotykały kropli przeciwciała
i barwić komórki 35 min w ciemności, w temperaturze pokojowej, w szalkach
wyłożonych wilgotną watą.
12. Po zakończonym barwieniu zdjąć każde ze szkiełek z parafilmu i przenieść do szalek z PBS
i wypłukać szkiełka starannie 3 razy.
Inkubacja komórek z substratem:
13. Zlać PBS i inkubować komórki w roztworze substratu dla peroksydazy (CN/DAB).
(zmieszane 0,2 ml CN/DAB Solution (10X) z 1,8 ml buforu Stable Peroxide Substrate
Solution ).
DAB (3,3’ diaminobenzydyna), zmieszana z 4CN (4-chloro-1-naftolem) dają w obecności
HRP i H2O2 czarny nierozpuszczalny produkt. Miejsca, gdzie związało się przeciwciało
drugorzędowe staną się czarne.
14. Inkubować 7-10 minut, aż szkiełko zabarwi się na czarno.
15. Po zakończonym barwieniu wypłukać szkiełka starannie 3 razy PBS.
16. Zalać szkiełka roztworem hematoksyliny – inkubować 1 minutę, a następnie przepłukać
szkiełka 3 razy wodą z kranu.
Przygotowanie preparatu:
17. Wyczyścić szkiełko podstawowe i nakropić na nie 2 razy po 10μl H2O. Na krople wody
nałożyć kolejno szkiełka z wybarwionymi komórkami (komórkami do wody), osuszyć
brzegi szkiełek bibułą i okleić je lakierem do paznokci.
18. Tak przygotowane preparaty oglądnąć w mikroskopie jasnego pola.
8
BT 206, BT 231
Metody immunocytochemiczne...
BT 206, BT 231
Zakres materiału, który należy przygotować do ćwiczeń:
- Organizacja, funkcje i metody badania cytoszkieletu w komórkach zwierzęcych.
- Metody immunocyfluoresencyjne i ich znaczenie w badaniach biologii komórki.
- Zastosowanie barwników fluorescencyjnych w badaniach struktury i funkcji komórek.
Zalecana literatura:
Wykłady 1-3 z kursu Praktikum z cytochemii (wykłady poprzedzające ćwiczenie).
Kurs: „Biologia komórki dla biochemików ” – wykłady dotyczące budowy i funkcji cytoszkieletu
Red. M. Zabel –Immunocytochemia, PWN 1999, rozdz..1, 2 i 4
B. Alberts i inni.-Podstawy Biologii Komórki, PWN 2005; rozdz.17.
Red. J. Kawiak i M. Zabel – Seminaria z cytofizjologii, WMed 2002, rozdz..7 i 14
9
BT 206, BT 231