Wykorzystanie metod immunocytochemicznych BCH395

WYKORZYSTANIE METOD
IMMUNOCYTOCHEMICZNYCH
W DIAGNOSTYCE MEDYCZNEJ
PRAKTIKUM Z CYTOCHEMII
(BCH395)
Wykorzystanie metod ...
BCH395
Wykorzystanie metod immunocytochemicznych w diagnostyce
medycznej
Cel ćwiczenia:
Wykorzystanie metod immunocytochemii pośredniej do identyfikacji komórek
nowotworowych w kokulturach z komórkami prawidłowymi w hodowli in vitro (imitacja
skrawków tkankowych z przerzutami komórek nowotworowych).
Przebieg ćwiczenia:
I. Identyfikacja filamentów pośrednich: cytokeratynowych i wimentynowych, w
otrzymanych komórkach metodą pośredniej immunofluorescencji.
II. Identyfikacja filamentów cytokeratynowych w otrzymanych komórkach pośrednią
metodą immunoenzymatyczną.
III. Porównanie przydatności obu metod do wykrywania takiego samego antygenu
(cytokeratyny)
IV. Oglądanie preparatów immunohistochemicznych z diagnostyki nowotworów w
tkankach miękkich (wykrywanie antygenów nowotworowych)
Wykonanie ćwiczenia:
Praca w dwuosobowych zespołach
1. Oglądnąć (w mikroskopie odwróconym) komórki wysiane na szkiełkach umieszczonych w
szalkach hodowlanych. Mogą to być:
− mysie fibroblasty 3T3 (imitacja prawidłowej tkanki łącznej)
− mysie fibroblasty 3T3 w kokulturze z mysimi komórkami rakowymi np. trzustki, płuc lub jelita
(imitacja prawidłowej tkanki łącznej z przerzutami nowotworowymi)
2.
KaŜdy zespół wybiera do barwienia 4 szalki ze szkiełkami z takimi samymi komórkami
(szkiełka tylko komórkami prawidłowymi lub kokulturą komórek prawidłowych i
nowotworowych).
3. Dwa szkiełka naleŜy wykorzystać do identyfikacji filamentów pośrednich: cytokeratynowych i
wimentynowych metodą pośredniej immunofluorescencji
− jedno szkiełko naleŜy przeznaczyć do wykrywania poszukiwanego białka metodą
immunocytofluorescencji pośredniej (inkubacja utrwalonych komórek kolejno z pierwszo- i
drugorzędowym przeciwciałem), drugie szkiełko wykorzystać do przeprowadzenia kontroli
negatywnej (inkubacja utrwalonych komórek tylko z drugorzędowym, znakowanym
fluorescencyjnie przeciwciałem
4. Dwa szkiełka naleŜy wykorzystać do identyfikacja filamentów cytokeratynowych w
otrzymanych komórkach pośrednią metodą immunoenzymatyczną
− jedno szkiełko naleŜy przeznaczyć do wykrywania cytokeratyny metodą immunoenzymatyczną
(inkubacja utrwalonych komórek kolejno z pierwszo- i drugorzędowym przeciwciałem oraz
substratem), drugie szkiełko wykorzystać do przeprowadzenia kontroli negatywnej (bez
inkubacji komórek z przeciwciałem przeciw cytokeratynie)
2
BCH395
Wykorzystanie metod ...
BCH395
Identyfikacja filamentów pośrednich: cytokeratynowych i wimentynowych, w otrzymanych
komórkach metodą pośredniej immunofluorescencji.
1. Wybrać (kaŜdy zespół) do barwienia 2 szkiełka z takimi samymi komórkami.
2. Zlać poŜywkę z szalki znad szkiełek z komórkami i przepłukać dokładnie szkiełka
roztworem PBS z jonami Ca2+,Mg2+ o temp. 37°C.
3. Zlać PBS i zalać komórki 3,7% roztworem formaldehydu w PBS o temp.37°C i
utrwalać komórki przez 15 min w cieplarce.
4. Zlać utrwalacz znad komórek i przepłukać szkiełka 2 razy roztworem PBS.
5. Zlać PBS i zalać komórki 0.1% roztworem Tritonu X-100 i pozostawić na 7 min w
temperaturze pokojowej.
6. Zlać Triton X-100 znad komórek i przepłukać szkiełka 3 razy PBS.
− Jedno szkiełko przeznaczyć do wykrywania poszukiwanego białka metodą
immunocytofluorescencji pośredniej ( inkubacja komórek kolejno z pierwszo- i
drugorzędowym przeciwciałem), drugie szkiełko z utrwalonymi komórkami
pozostawićw PBS (inkubacja tylko z drugorzędowym przeciwciałem- kontrola)
7. Zlać PBS i zalać komórki roztworem 3% BSA (albuminy surowicy wołowej) w PBS i
inkubować w temperaturze pokojowej około 15 min.
8. Przygotować komory wilgotnościowe do barwienia komórek: Małe szalki szklane
umieścić w duŜych szalkach wyłoŜonych wilgotną watą (komory wilgotnościowe),
aby krople przeciwciała nie wysychały.
9. Inkubacja komórek z pierwszorzędowym przeciwciałem: Na suchą małą szalkę
połoŜyć 1 pasek parafilmu o wielkości około 2cm x 2cm, na środek kaŜdego kawałka
parafilmu nakropić 20µl pierwszego przeciwciała (przeciwciało otrzymane od
asystenta – jedno z poniŜszych) monoklonalne mysie przeciwciało przeciwko:
− wimentynie – IgM
− cytokeratynie –IgG
(KaŜdy zespół wykonuje barwienie cytokeratyny i wimentyny)
10. Wyjąć szkiełko z utrwalonymi komórkami szalki z roztworu BSA w PBS, osuszyć
brzegi szkiełka bibułą i połoŜyć je na parafilmie, tak aby komórki dotykały kropli
przeciwciała. Inkubować komórki z pierwszym przeciwciałem 45 min w
temperaturze pokojowej.
11. Po inkubacji komórek z przeciwciałem pierwszorzędowym szkiełko umieścić w
szalce wypełnionej roztworem PBS i przepłukać starannie 3 razy.
3
BCH395
Wykorzystanie metod ...
BCH395
12. Inkubacja komórek z przeciwciałem drugorzędowym znakowanym fluorescencyjnie i
z barwnikami fluorescencyjnymi do wybarwienia jąder komórkowych: Na szalkę
połoŜyć dwa paski parafilmu o wielkości około 2cm x 2cm i na środek kaŜdego
nakropić 20µl mieszaniny barwników (mieszanina barwników otrzymana od
asystenta), która zawiera odpowiednio rozcieńczone:
− kozie przeciwciało anty-mysie IgG znakowane Alexa-488
− przeciwciało anty-mysie IgM znakowane Alexa-546
− roztwór barwnika Hoechst 33258, o stęŜeniu 500ng/ml
13. Oba barwione szkiełka z komórkami połoŜyć kolejno na paskach parafilmu tak, aby
komórki dotykały kropli mieszaniny barwników i barwić komórki 35 min, w
ciemności, w temperaturze pokojowej, w szalkach wyłoŜonych wilgotną watą.
14. Po zakończonym barwieniu zdjąć kaŜde ze szkiełek z parafilmu i przenieść do szalek
z H2O destylowaną i wypłukać szkiełka starannie 5 razy.
15. Wyczyścić szkiełko podstawowe i nakropić na nie 2 razy po 10µl H2O destylowanej.
Na krople wody nałoŜyć kolejno szkiełka z wybarwionymi komórkami (komórkami
do wody), osuszyć brzegi szkiełek bibułą i okleić je lakierem do paznokci.
16. Tak przygotowane preparaty oglądnąć w mikroskopie fluorescencyjnym. Dla struktur
barwionych:
− Hoechst 3325
światło wzbudzające: UV (max 352nm), a emisja - światło niebieskie
− Aleksa-Fluor 488:
światło wzbudzenia: niebieskie (max 488 nm), a emisja – światło zielone
− Alexa-Fluor 546:
światło wzbudzenia: zielone (max 546 nm), a emisja – światło czerwone
17. Na podstawie obserwacji komórek w wykonanych preparatach naleŜy odpowiedzieć
na pytania:
a) Czy otrzymane do barwienia komórki stanowiły populację heterogenną (hodowlę
komórek prawidłowych i nowotworowych w kokulturze)?
b) Jeśli tak, to jaki procent populacji stanowią komórki nowotworowe (uwaga:
naleŜy skorzystać z dodatkowego barwienia jąder komórkowych)?
4
BCH395
BCH395
Wykorzystanie metod ...
II. Identyfikacja filamentów cytokeratynowych
pośrednią metodą immunoenzymatyczną.
w
otrzymanych
komórkach
1. Wybrać (kaŜdy zespół) do barwienia 2 szkiełka z takimi samymi komórkami.
2. Zlać poŜywkę z szalki, w której znajduje się szkiełko i przepłukać dokładnie szkiełko
roztworem PBS z jonami Ca2+,Mg2+ o temp. 37°C.
3. Zlać PBS i zalać komórki 3,7% roztworem formaldehydu w PBS o temp.37°C i
utrwalać komórki przez 15 min w cieplarce.
4. Zlać utrwalacz znad komórek i przepłukać szkiełka 3 razy roztworem PBS.
5. Zlać PBS i zalać komórki 0.1% roztworem Tritonu X-100 i pozostawić na 7 min w
temperaturze pokojowej.
6. Zlać Triton X-100 znad komórek i przepłukać szkiełka 2 razy PBS.
Zalać komórki 1 ml roztworu 0,1% H2O2 i inkubować komórki przez 5 minut.
7. Zlać wodę utlenioną i przepłukać trzykrotnie PBS
8. Zlać PBS i zalać komórki roztworem 1% BSA (albuminy surowicy wołowej) w PBS i
inkubować w temperaturze pokojowej około 10 min.
9. Przygotować komory wilgotnościowe do barwienia komórek: Małe szalki szklane
umieścić w duŜych szalkach wyłoŜonych wilgotną watą (komory wilgotnościowe),
aby krople przeciwciała nie wysychały.
10. Inkubacja komórek z pierwszorzędowym przeciwciałem: Na suchą małą szalkę
połoŜyć 1 pasek parafilmu o wielkości około 2cm x 2cm, na środek kawałka
parafilmu nakropić 20µl pierwszego przeciwciała (przeciwciało otrzymane od
asystenta –monoklonalne mysie przeciwciało przeciwko cytokeratynie). Wyjąć
szkiełko z utrwalonymi komórkami szalki z roztworu BSA w PBS, osuszyć brzegi
szkiełka bibułą i połoŜyć je na parafilmie, tak aby komórki dotykały kropli
przeciwciała.
Inkubować komórki z pierwszym przeciwciałem 35 min w temperaturze pokojowej.
11. Po inkubacji komórek z przeciwciałem pierwszorzędowym szkiełko umieścić w
szalce wypełnionej roztworem PBS i przepłukać starannie 3 razy.
12. Inkubacja komórek z przeciwciałem drugorzędowym sprzęŜone z peroksydazą
(przeciwciało
przeciwko
mysim
IgG
sprzęŜone
z
enzymem).
Na szalkę połoŜyć pasek parafilmu o wielkości około 2cm x 2cm i na środek
nakropić 15 µl roztworu przeciwciała: kozie przeciwciało anty-mysie IgG
znakowane HRP (HRP-conjugated anti-mouse IgG antibody)
Szkiełka z komórkami połoŜyć na parafilmie tak, aby komórki dotykały kropli
przeciwciała i barwić komórki 30 min, w ciemności, w temperaturze pokojowej, w
szalkach wyłoŜonych wilgotną watą.
5
BCH395
Wykorzystanie metod ...
BCH395
13. Po zakończonym barwieniu zdjąć kaŜde ze szkiełek z parafilmu i przenieść do szalek
z PBS i wypłukać szkiełka starannie 3 razy.
14. Przygotować substrat dla peroksydazy. Pomieszać 0,2 ml CN/DAB Solution
(10X) z 1,8 ml buforu Stable Peroxide Substrate Solution (1X).
DAB (3,3’ diaminobenzydyna), zmieszana z 4CN (4-chloro-1-naftolem) dają w
obecności HRP i H2O2 czarny nierozpuszczalny produkt. Miejsca, gdzie związało się
przeciwciało drugorzędowe staną się czarne.
15. Inkubować 7-10 minut, aŜ szkiełko zabarwi się na czarno.
16. Po zakończonym barwieniu wypłukać szkiełka starannie 3 razy PBS.
17. Zalać szkiełka roztworem hematoksyliny – inkubować 1 minutę, a następnie
przepłukać szkiełka 3 razy wodą z kranu.
18. Wyczyścić szkiełko podstawowe i nakropić na nie 2 razy po 10µl H2O. Na krople
wody nałoŜyć kolejno szkiełka z wybarwionymi komórkami (komórkami do wody),
osuszyć brzegi szkiełek bibułą i okleić je lakierem do paznokci.
19. Tak przygotowane preparaty oglądnąć w mikroskopie jasnego pola.
6
BCH395