Streszczenie Wstęp

Streszczenie
Celem niniejszej pracy było przeprowadzenie analizy mikrobiologicznej odcieku
z wysypiska śmieci w Łężycach, określenie skuteczności jego dezynfekcji preparatem
„Septonit” oraz dokonanie oceny zagrożenia sanitarnego w środowisku i zdrowiu człowieka.
Do identyfikacji poszczególnych szczepów bakterii zastosowałem podłoża wybiórcze,
hamujące lub przyspieszające ich rozwój. Dla stwierdzenia ewentualnej obecności
grzybów(drożdżaków) oraz pleśni zastosowałem podłoże Sabourauda.
Próbka odcieku przeznaczona do badań została udostępniona mi przez pracowników
zakładu zagospodarowania odpadów „Eko Dolina” w Łężycach koło Gdyni. Badania
laboratoryjne przeprowadziłem we wrześniu 2011 roku na Wydziale Chemii Politechniki
Gdańskiej w Katedrze Leków i Biochemii.
Przeprowadzone przeze mnie badania wykazały, że:
1. W odcieku znajdują się bakterie zaliczane do jelitowej mikroflory pochodzenia
kałowego.
2. Odciek jest siedliskiem bakterii z rodziny Enterobacteriaceae, a także rodzajów
Enterobacter, Bacillus, Micrococcus i Staphylococcus.
3. Oprócz zanieczyszczeń typu bakteryjnego odciek zawiera drożdżaki oraz pleśnie.
4. Preparat „Septonit” jest środkiem dezynfekującym o bardzo dużej skuteczności wobec
bakterii wyizolowanych z odcieku; wyjątek stanowią bakterie z rodzaju Bacillus, które
wykazały wysoki stopień odporności na ten preparat.
Wstęp
Odciekiem nazywamy wodę, pochodzącą głównie z opadów atmosferycznych,
która infiltruje, następnie wypływa z ognisk zanieczyszczeń takich jak składowiska odpadów
komunalnych lub przemysłowych i przenika do podłoża. Charakteryzuje się on wysoką
obecnością związków chloru, siarki oraz azotu (w szczególności amonowego). Zawartość
tych składników oraz ich ilość zależy od wielu czynników takich jak: rodzaj odpadów,
sposobów ich rekultywacji, technik składowania, ilości wody ją
infiltrującej, a także wieku kwatery oraz pory roku. Zawartość
związków chemicznych, przekraczająca obowiązujące normy,
utrudnia lub uniemożliwia oczyszczanie odcieku. Proces ten
wymaga, przed odprowadzeniem odcieku do oczyszczalni,
podczyszczenia go do odpowiednich parametrów. Skład odpadów
na polskich składowiskach, to w 35% odpady organiczne, w 50% biodegradowalne, co pozwala przypuszczać, że zarówno odpady
jak i odciek stanowią dobre środowisko rozwoju dla saprofitów i
mikroorganizmów chorobotwórczych.
Jak wykazały moje badania odciek posiada bogatą
gatunkowo mikroflorę, głównie bakterie jelitowe pochodzenia
kałowego z rodziny Enterobacteriaceae oraz rodzaju Enterobacter,
a także bakterie z rodzajów Bacillus, Micrococcus i Zdjęcie 1. Kolba zawierająca
Staphylococcus, i grzyby oraz pleśnie. Ze względu na stwierdzoną nieprzetworzony odciek. (fot.
przeze mnie obecność licznych zanieczyszczeń mikrobiologicznych Michał Żuk)
w odcieku składowiskowym można wysnuć wniosek, że stanowi on
poważne zagrożenie sanitarno-epidemiologiczne dla środowiska przy niezachowaniu
właściwych zabezpieczeń.
Materiały i metody
W celu przeprowadzenia analizy mikrobiologicznej odcieku zastosowałem podłoża
wybiórcze, sprzyjające lub hamujące rozwój określonych rodzajów mikroorganizmów:
Chapmana – wybiórcze dla Staphylococcus, pozwalające odróżnić gatunki
rozkładające mannitol od gatunków nie mających takich właściwości,
Baird - Parkera – wybiórcze dla Staphylococcus (pozwala odróżnić S. aureus od
innych gatunków z tego rodzaju) oraz Micrococcus i Bacillus,
Slanetza – wybiórcze dla bakterii z rodzaju Enterococcus,
VRBD wg Mossela – wybiórcze dla Enterobacteriaceae.
Dodatkowo użyłem podłoża Sabourauda do sprawdzenia, czy oprócz bakterii
nieprzetworzony odciek jest również siedliskiem grzybów.
Przebieg przeprowadzonego przez mnie doświadczenia ilustruje przedstawiony poniżej
schemat.
3ml
odcieku
I
3ml odcieku
+ 30μl
„Septonitu”:
100 μl próbki
kontrolnej
100 μl próbki
badawczej
30 lub 37°C
48 h
II
I – próba kontrolna
II – próba badawcza
Szalki z jednym z pięciu
podłoży stałych
2. Z próby kontrolnej oraz badawczej pobrano po
100 μl odcieku i wylano na 20 szalek z
przygotowanymi wcześniej podłożami stałymi.
Następnie za pomocą wyjałowionego gładzika,
próbę rozprowadzono równomiernie po całej
powierzchni każdej z szalek.
1. Do każdej z probówek
3. 5 szalek z próby
wlano
taką
samą
ilość
kontrolnej i 5 z badawczej
odcieku, do próby badawczej
inkubowano w 30°C przez
dodano 30 μl preparatu
48h; 5 szalek z próby
„Septonit”.
kontrolnej i 5 z badawczej
Próbki pozostawiono na 10
inkubowano w 37°C przez
minut, w celu zadziałania
48h.
preparatu dezynfekującego.
Do dezynfekcji próbki odcieku wykorzystałem preparat „Septonit”, który jest
stosowany do dezynfekcji chemiczno – termicznej tkanin. Zawiera on w swoim składzie
nadtlenek wodoru, kwasy octowy i nadoctowy. Został on wybrany przeze mnie do badań ze
względu na to, że posiada atest Zakładu Zwalczania Skażeń Biologicznych PZH w
Warszawie, a jego działanie sprawdzone zostało między innymi w Instytucie Gruźlicy
i Chorób Płuc w Warszawie oraz Zakładzie Mikrobiologii Centralnego Szpitala Klinicznego
w Warszawie.
Po inkubacji przeprowadziłem identyfikację wyrosłych na wszystkich płytkach kolonii
mikroorganizmów oraz sprawdziłem dezynfekującą skuteczność preparatu „Septonit”
na drobnoustroje zawarte w odcieku – próbki badawcze.
Przeprowadzone przez mnie badania odbywały się w warunkach laboratoryjnych
Politechniki Gdańskiej i miały na celu wyłącznie analizę jakościową. Bakterie wyhodowane
na pożywkach nie służyły mi do żadnych dalszych badań.
Wyniki
Analizę mikrobiologiczną odcieku przedstawia poniższa tabela.
Podłoże
Chapmana
Baird Parkera
Próba
Temperatura
inkubacji.
Kontrolna
30 °C
37 °C
Badawcza
30 °C
37 °C
30°C
Kontrolna
37°C
Badawcza
30°C
37°C
VRBD wg
Mossela
Kontrolna
30°C
37°C
Badawcza
Slanetza
Kontrolna
30°C
37°C
30°C
37°C
Badawcza
Sabourauda
Kontrolna
30°C
37°C
30°C
37°C
Badawcza
30°C
37°C
Wygląd kolonii.
Zidentyfikowane
mikroorganizmy.
Żółte, lśniące, wypukłe, okrągłe, o średnicy poniżej 5 mm
Żółte, lśniące, wypukłe, o nieregularnym kształcie i falistym
brzegu, jedna o średnicy około 2 cm, druga, przylegająca do
krawędzi płytki na 1/3 jej obwodu. Dookoła kolonii podłoże
zmieniło barwę z czerwonej na żółtą
Brak kolonii.
Brak kolonii.
Ponad 50 małych, okrągłych kolonii o średnicy
nieprzekraczającej 3mm. Kolonie o rozmiarach powyżej 1mm
składają się z większego, półprzezroczystego, wypukłego,
szarego kręgu otaczającego małą, czarną, okrągłą kolonię.
Kolonie mniejsze niż 1mm płaskie, matowe i czarne.
Kilkaset kolonii o rozmiarach do 3mm, pokrywające około
40% powierzchni szalki. Kolonie rozmiarami przekraczające
1mm czarne, matowe, wypukłe o nieregularnych,
zaokrąglonych kształtach. Kolonie poniżej 1 mm w kolorach
od brązowego do czarnego, płaskie, matowe.
Około 30 płaskich, matowych, czarnych i brązowych kolonii
o średnicy poniżej 1mm .
9 małych płaskich, matowych, czarnych kolonii o średnicy
poniżej 1mm, dodatkowo kolonia przy krawędzi szalki na
około ½ jej obwodu.
Małe, czerwone kolonie pokrywające około 5% powierzchni
płytki, część okrągła o średnicy do 2 mm, część o kształcie
nieregularnym z postrzępionymi brzegami. Dookoła kolonii
podłoże odbarwiło się.
Dwie czerwone kolonie o średnicy około 1cm każda. Podłoże
wokół kolonii odbarwiło się.
Brak kolonii.
Brak kolonii.
Czerwone kolonie pokrywające około 8% powierzchni płytki.
4 kolonie okrągłe, płaskie o średnicy około 1 cm, kilkanaście
małych okrągłych i wypukłych, dwie o nieregularnym
kształcie z postrzępionymi krawędziami, podłoże wokół
kolonii uległo odbarwieniu.
5 płaskich, okrągłych kolonii koloru o czerwonym
zabarwieniu i średnicy około 1 cm każda, podłoże wokół
kolonii uległo odbarwieniu.
Brak kolonii.
Brak kolonii.
14 kolonii – 6 okrągłych, białych, wypukłych o średnicy
około 5mm, 8 przezroczystych, o zaokrąglonych kształtach i
średnicy od 5 do 10mm
Kolonie pokrywające około 20% powierzchni płytki, o
nieregularnych, zaokrąglonych kształtach, białe, o średnicy od
około 5mm do około 3cm, cześć posiada przezroczystą
otoczkę śluzową.
Brak kolonii
Brak kolonii
Bakterie z rodzaju
Staphylococcus mające
zdolność rozkładania
mannitolu.
Brak.
Brak.
Staphylococcus aureus;
bakterie z rodzajów
Micrococcus i Bacillus
Bakterie z rodzaju
Bacillus.
Bakterie z rodziny
Enterobacteriaceae.
Brak.
Brak.
Bakterie z rodzaju
Enterococcus
Brak.
Brak.
Grzyby i pleśnie
Brak
Brak
Jak wynika z analizy powyższej tabeli w nieprzetworzonym odcieku znajdują się
bakterie z rodziny Enterobacteriaceae, rodzajów Enterobacter, Bacillus, Micrococcus i
Staphylococcus. Oprócz bakterii odciek jest środowiskiem życia grzybów i pleśni.
Zastosowanie dwóch podłoży wybiórczych, pozwalających identyfikować Staphylococcus,
podłoża Chapmana i podłoża Baird – Parkera, umożliwia stwierdzić, że wyhodowanym
przedstawicielem tego rodzaju jest S. aureus. Na płytkach z próbami badawczymi jedynymi
zidentyfikowanymi mikroorganizmami były bakterie z rodzaju Bacillus.
Przybliżone rozmiary poszczególnych kolonii oraz skuteczność dezynfekcji przy
pomocy preparatu „Septonit” prezentuje poniższy wykres.
Zależność między rozmiarami kolonii a użyciem środka
dezynfekującego.
Powierzcnia szalki pokryta koloniami
45%
40%
40%
35%
30%
25%
25%
kontrola 30 °C
kontrola 37°C
20%
septonit 30 °C
20%
septonit 37°C
15%
10%
8%
6%
10%
8%
5%
5%
0%0%
0%0%
0%0%
5%
0,5
%1%
5%
0%0%
0%
Sabourauda
Slanetza
VRBD wg
Mossela
Baird Parkera
Chapmana
Podłoże
Jak wynika z wykresu wzrost mikroorganizmów na płytkach kontrolnych jest zależny
od podłoża i temperatury inkubowania. Im wyższa, tym większy wzrost – wyjątek stanowi
podłoże Slanetza. W próbkach badawczych po zastosowaniu „Septonitu” wyraźnie widać
brak obecności mikroorganizmów na podłożach Saborauda, Slanetza, VRBD wg Mossela i
Chapmana, a śladowe ilości drobnoustrojów z rodzaju Bacillus występują na podłożu Biard –
Markera. Tak więc preparat „Septonit” wykazuje się bardzo wysoką, niemal stuprocentową
skutecznością w niszczeniu mikroorganizmów.
Dyskusja
Uzyskane przeze mnie wyniki badań wykazują, że odciek składowiskowy jest
siedliskiem głównie jelitowej flory bakteryjnej, pochodzenia kałowego, która należy do
rodziny Enterobacteriaceae. Większość przedstawicieli tej rodziny jest komensalami
jelitowymi, część jest patogenami oportunistycznymi, charakteryzującymi się różnymi
zdolnościami chorobotwórczymi.
W literaturze możemy znaleźć informacje, że najprawdopodobniej, znajdującymi się
w odcieku, przedstawicielami tej rodziny są bakterie z rodzajów Salmonella i Shigella oraz
Eschericha coli i Yersinia enterocolitica (Szyłak-Szydłowski, 2010). Mogą one powodować
między innymi zarówno samoograniczające się nieżyty żołądka i jelit, jak i zespoły chorób
ogólnoustrojowych, jak na przykład dur brzuszny. W odcieku stwierdziłem również obecność
przedstawicieli z rodzaju Enterococcus. Podobnie jak Enterobacteriaceae są one składnikiem
flory jelitowej oraz patogenami oportunistycznymi. Mogą być one przyczyną zakażeń dróg
moczowych, zapalenia wsierdzia i bakteriemii. Odciek jest również środowiskiem życia
bakterii z rodzaju Bacillus (gram-dodatnie pałeczki), które wytwarzają twarde i wytrzymałe
spory, umożliwiające im przetrwanie w trudnych warunkach środowiska. Jedynie nieliczni
jego przedstawiciele powodują choroby u ludzi, są to B. anthracis, będący przyczyną wąglika
i B. cereus, który wywołuje zatrucia pokarmowe. Ponadto
zidentyfikowałem bakterie z rodzaju Micrococcus, które uważane są
za bakterie niechorobotwórcze, jednak opisano przypadki
wyizolowania ich z zakażeń oportunistycznych(źródło). Stwierdzona
została również obecność Staphylococcus aureus (gram-dodatniej
bakterii, zamieszkującej jamę nosową ludzi i zwierząt), która może
spowodować zakażenia ropne skóry, tkanek podskórnych i miękkich,
zakażenia układowe oraz zatrucia związane z wytwarzaną przez nią
toksyną. W odcieku stwierdziłem również obecność grzybów i pleśni.
Są to najprawdopodobniej przedstawiciele rodzajów Aspergillus,
Cladosporium i Penicillium.(Szyłak-Szydłowski,2010) Niektóre
gatunki z rodzaju Asperagillus mogą powodować grzybicę skóry i płuc
oraz astmę oskrzelową.
W badaniach wykazałem, że preparat „Septonit” jest środkiem
dezynfekującym o wysokiej skuteczności w niszczeniu komórek
bakteryjnych. Działanie jego jest wynikiem wysokiej specyficzności
składników w oddziaływaniu na struktury i metabolizm komórek.
Nadtlenek wodoru jest źródłem wolnych rodników niszczących białka.
Niektóre bakterie chronią się przed jego negatywnym wpływem
wytwarzając enzym - katalazę, która jednak zmniejsza swoją
aktywność przy zastosowanym stężeniu preparatu wynoszącym 25%.
Kwas nadoctowy utlenia mostki dwusiarczkowe i niszczy wiązania
wodorowe w białkach, co doprowadza do przerwania błony
komórkowej. (Rutala, 2008).
Zdjęcie 2. Podłoże Baird –
Jedynymi mikroorganizmami, które wykazały odporność na
Parkera inkubowane
działanie użytego środka dezynfekującego, były bakterie z rodzaju
w 37°C. U góry próba
Bacillus. Jest to najprawdopodobniej spowodowane tym, że jako
kontrolna z koloniami
jedyne ze zidentyfikowanych przeze mnie mikroorganizmów
Bacillus, Micrococcus
i S. aureus, u dołu próba
wytwarzają bardzo wytrzymałe spory, które umożliwiają im
badawcza z koloniami tylko
przetrwanie w otoczenia do czasu, aż warunki staną się bardziej
Bacillus. (fot. Michał Żuk)
sprzyjające ich rozwojowi. Bardzo mała ich liczba w próbie kontrolnej
na podłożu Baird - Parkera (zdjęcie 2) pozwala stwierdzić, że tylko część spor przetrwała
dezynfekcję „Septonitem”.
Mimo dużej ilości mikroorganizmów, potencjalnie chorobotwórczych, odciek stanowi
zagrożenie tylko w przypadku bezpośredniego z nim kontaktu oraz w sytuacji, gdy
przedostanie się on do wód gruntowych lub cieków wodnych, doprowadzając tym samym do
powstania zanieczyszczenia wtórnego. Zajście tych zdarzeń jest mało prawdopodobne.
Bezpośredni kontakt z bakteriami mają tylko pracownicy zakładów, w których odciek
powstaje. Natomiast kwatery, miejsca składowania odpadów, są odpowiednio zabezpieczane,
uniemożliwiając przedostanie się zanieczyszczeń do gleby oraz pobliskich cieków wodnych.
Nawet zakładając kompletnie nierealną sytuację, w której kwatera znajduje się nad wodami
gruntowymi, mało prawdopodobne jest ich skażenie, gdyż przyjmuje się, że rozchodzenie
zanieczyszczeń mikrobiologicznych w strefie aeracji ogranicza się do głębokości zaledwie
trzech metrów. Rozważyć trzeba także czas, przez jaki mikroorganizmy mogą pozostawać w
glebie. Zależy on od wielu czynników takich jak temperatura, pojemność wodna gruntu, jego
struktura, odczyn oraz zawartość martwej materii organicznej. Czas ten waha się od dwóch do
piętnastu miesięcy, przy czym liczba bakterii spada poniżej poziomu, w którym zagrażają one
zdrowiu, po maksymalnie dwóch, trzech miesiącach. Liczba mikroorganizmów w odcieku
zależny od pory roku, jest ona od jeden do dwóch rzędów wielkości większa w okresie letnio
– jesiennym względem okresu zimowo – wiosennego.(Traczewska, 2000). Spośród
zidentyfikowanych przeze mnie mikroorganizmów najdłużej w glebie żyć mogą
przedstawiciele rodzaju Bacillus dzięki wytwarzanym przez nie sporom, umożliwiającym
przetrwanie w trudnych warunkach środowiska oraz przedstawiciele rodziny
Enterobacteriaceae, która jest w stanie dzielić się w temperaturze nawet -2°C. (SzyłakSzydłowski,2010).
Biorąc pod uwagę przedstawione powyżej czynniki, dotyczące mikrobiologicznego
zanieczyszczenia środowiska oraz sposobu zabezpieczenia kwatery składowania odpadów
w zakładzie „Eko Dolina”, mogę stwierdzić, że zagrożenie dla lokalnego środowiska, płynące
z nieprzetworzonego odcieku, jest bardzo znikome. Nie mogę przedstawić porównania
wyników swoich badań odcieku z analizami laboratorium zakładu „Eko Dolina”, ponieważ
nie zostały udostępnione.
Piśmiennictwo
1. Irwing W., Boswell T., Ala’Aldeen D. (2008) Krótkie wykłady – mikrobiologia medyczna
PWN, Warszawa
2. Rutala W. A., Weber D. J., HICPAC, (2008) Guideline for Disinfection and Sterilization
in Healthcare Facilities - Centres for Disease Control and Prevention, USA
3. Praca zbiorowa pod redakcją Szewczyk E. M., (2005) Diagnostyka mikrobiologiczna –
PWN, Warszawa
4. Praca zbiorowa pod redakcją Szewczyk E. M., (2006) Mikrobiologia - Uniwersytet
Medyczny w Łodzi
5. Szyłak – Szydłowski M., Grabińska-Łoniewska A., (Wrzesień 2010) Główne
zanieczyszczenia mikrobiologiczne odcieków składowiskowych - Miesięcznik „Gaz,
woda i technika sanitarna”
6. Traczewska T. M., Karpińska-Smulikowska J. (2/2000) Wpływ składowiska odpadów
komunalnych na jakość mikrobiologiczną powietrza – Czasopismo „Ochrona
Środowiska”