Zastosowanie techniki RFLP w diagnostyce molekularnej

&ARM0RZEGL.AUK†
:ASTOSOWANIETECHNIKI2&,0WDIAGNOSTYCEMOLEKULARNEJ
2ESTRICTIONFRAGMENTSLENGTHPOLYMORPHISM;2&,0=ANALYSIS
INMOLECULARDIAGNOSTICS
%WA-ORIC†*ANISZEWSKA,UDMIŒA7ÃGLARZ
+ATEDRAI:AKŒAD"IOCHEMII7YDZIAŒ&ARMACEUTYCZNYZ/DDZIAŒEM-EDYCYNY,ABORATORYJNEJW3OSNOWCU
gL’SKI5NIWERSYTET-EDYCZNYW+ATOWICACH
Streszczenie
Abstract
Odkrycie struktury i wyjaśnienie mechanizmu replikacji
DNA stało się podstawą dynamicznego rozwoju genetyki,
a w konsekwencji opracowania molekularnych podstaw
wielu chorób dziedzicznych oraz sposobów ich diagnozowania w oparciu o analizę genetyczną. Jedną z technik wykorzystywanych w diagnostyce molekularnej jest
RFLP, czyli analiza polimorfizmu długości fragmentów
restrykcyjnych. W przedstawionej pracy opisano przykłady zastosowania techniki RFLP w diagnostyce molekularnej choroby Hashimoto (polimorfizm genu CTLA-4),
reumatoidalnego zapalenia stawów (polimorfizm genu
interleukiny-6), samoistnego migotania przedsionków
(polimorfizm genu MinK), hiperhomocysteinemii (polimorfizm genu reduktazy metylenotetrahydrofolianowej),
dystrofii mięśniowej typu Duchenne’a (polimorfizm genu
DMD), w diagnostyce chorób bakteryjnych (infekcja
wywołana Helicobacter pylori i Campylobacter jejuni)
i wirusowych (HPV- Human Papilloma Virus) oraz
w ustalaniu ojcostwa.
Discovery of DNA structure and replication initiated a
dynamic progress in molecular genetics and led to the
elaboration of molecular bases of inherited diseases and
methods of their diagnosis. One of the techniques used
in molecular diagnostics is the analysis of restriction
fragments length polymorphism- RFLP. In this paper we
describe some examples of application of RFLP in molecular diagnosis of Hashimoto disease (polymorphism
of CTLA-4 gene), rheumatoid arthritis (polymorphism
of interleukine-6 gene), atrial fibryllation (polymorphism
of MinK gene), hyperhomocysteinemia (polymorphism
of methylenetetrahydrofolate reductase gene), Duchenne
muscular dystrophy (polymorphism of DMD gene), and
also in diagnosis of bacterial infections caused by Helicobacter pylori and Campylobacter jejuni and of viral infections (HPV-Human Papilloma Virus]. The application of
RFLP in affiliate is also described.
Słowa kluczowe: diagnostyka molekularna, fragmenty
restrykcyjne, analiza RFLP, polimorfizm genetyczny, enzymy restrykcyjne
Wstęp
Odkrycie struktury i wyjaśnienie mechanizmu replikacji
DNA przez Jamesa Watsona oraz Francisa Cricka w 1953
roku stało się podstawą dynamicznego rozwoju genetyki,
a w konsekwencji rozpracowania molekularnych podstaw
wielu chorób dziedzicznych oraz sposobów ich diagnozowania w oparciu o analizę genetyczną. Jedną z technik
wykorzystywanych w diagnostyce molekularnej jest RFLP,
czyli analiza polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych. Metoda RFLP polega na identyfikacji różnic długości
(polimorfizmu) fragmentów DNA powstających na skutek
działania enzymu restrykcyjnego z grupy endonukleaz,
na badany DNA. Rozpoznawana sekwencja o długości od
4 do 8 par zasad (pz) ma zwykle charakter symetryczny.
W zależności od liczby miejsc restrykcyjnych w DNA i odległości między nimi uzyskuje się określoną liczbę fragmentów restrykcyjnych o odpowiedniej długości. Zastosowanie
techniki RFLP ma na celu wykrywanie polimorfizmów oraz
Key words: molecular diagnostics, restriction fragments,
RFLP analysis, genetic polymorphism, restriction enzymes
mutacji w analizowanym materiale genetycznym. Gdy mutacja występuje w obrębie miejsca restrykcyjnego, jej konsekwencją jest zanik lub pojawienie się dodatkowego miejsca
restrykcji, w zależności od typu mutacji. Uwidacznia się to
w postaci zmienionej liczby fragmentów w analizowanym
DNA. Gdy mutacja nie dotyczy miejsca restrykcyjnego i ma
charakter dużej (powyżej 50 pz) insercji lub delecji, można ją wykryć na podstawie zmienionej długości fragmentu,
w obrębie którego miała miejsce. Zaletą analizy jest fakt, iż
można ją przeprowadzić na nawet bardzo niewielkiej ilości
DNA uzyskanego z materiału biologicznego [1, 2].
Przykłady wykorzystania techniki RFLP
w diagnostyce genetycznej
Przykładem wykorzystania metody RFLP jest poszukiwanie związku występowania polimorfizmu w genie
CTLA-4 z rozwojem choroby Hashimoto. CTLA-4 jest
ważną cząsteczką regulatorową występującą na powierzch-
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
ni limfocytów T, która bierze udział w interakcji między nim
i komórką prezentującą antygen. Genetycznie uwarunkowane zaburzenie ekspresji lub funkcji CTLA-4 wywołuje zwiększoną aktywację limfocytów T i prowadzi do rozwoju chorób
o podłożu autoimmunologicznym. Dotychczas opisano 3 polimorfizmy związane z genem CTLA-4, z których znaczenie
czynnościowe ma polimorfizm kodonu 17 w obrębie tego
genu. Zamiana adenozyny na guaninę w pozycji 49 prowadzi
do zastąpienia treoniny przez alaninę w wiodącej sekwencji
aminokwasowej produktu białkowego genu CTLA-4, która pełni funkcję peptydu sygnałowego kierującego białko
do siateczki endoplazmatycznej. Badania przeprowadzone
prze Kucharską i wsp. [3] miały na celu ustalenie częstości
występowania polimorfizmu A49G w CTLA-4 u 30 dzieci
z rozpoznaną chorobą Hashimoto w porównaniu do grupy
kontrolnej, którą stanowiło 38 dzieci bez stwierdzonych
chorób o podłożu autoimmunologicznym oraz z prawidłową czynnościowo tarczycą. Analiza profili restrykcyjnych
produktu amplifikacji fragmentu genu CTLA-4 poddanego
trawieniu enzymem BbvI ujawniła obecność jednego prążka
charakterystycznego dla homozygot A/A; dwóch prążków
charakterystycznych dla homozygot G/G oraz trzech prążków charakterystycznych dla heterozygoty A/G. W grupie
dzieci z chorobą Hashimoto, z częstością znamienną statystycznie w stosunku do grupy kontrolnej, występowały
homozygoty z rzadkim allelem G/G(Ala/Ala). Polimorfizm
genu CTLA-4 w pozycji 49 eksonu 1, w którym znajduje
się kodon 17, jest uważany za jeden z głównych czynników
genetycznych niezależnych od HLA, predysponujących do
wystąpienia chorób o podłożu autoimmunologicznym. Wyniki powyższych badań potwierdzają związek występowania polimorfizmu A49G genu CTLA-4 z występowaniem
choroby Hashimoto w populacji polskich dzieci [3].
Technikę RFLP zastosowano również do zbadania wpływu polimorfizmu genu kodującego interleukinę-6 (IL-6)
na skuteczność leczenia chorych na reumatoidalne zapalenie stawów (RZS) metotreksatem i prednizonem. RZS jest
przewlekłą chorobą zapalną, w patogenezie której istotną
rolę odgrywają liczne cytokiny. Jedną z nich o działaniu
prozapalnym jest IL-6. Zwiększona synteza tej cytokiny
u chorych na RZS uważana jest za jedną z przyczyn nasilenia objawów choroby. Podwyższone stężenia IL-6 obserwowano w surowicy i płynie stawowym u chorych z RZS
[4]. Zidentyfikowano kilka polimorfizmów w obrębie genu
IL-6 wpływających na ekspresję tej cytokiny. Stwierdzono,
że genotyp GG polimorfizmu w pozycji 174 w obrębie promotora genu IL-6 koreluje ze zwiększoną syntezą tej cytokiny. W związku z tym zbadano wpływ zidentyfikowanego
polimorfizmu na efekty terapeutyczne w grupie chorych na
RZS leczonych metotreksatem i prednizonem. Badaniami
objęto 70 osób, z których część stanowili chorzy, u których
osiągnięto remisję objawów choroby po stosowanej terapii,
a grupę drugą stanowili chorzy bez stwierdzonej remisji.
W wyniku przeprowadzonej analizy z wykorzystaniem
RFLP stwierdzono, że częstość występowania objawów remisji była istotnie statystycznie mniejsza u nosicieli genotypu GG w porównaniu z pacjentami o genotypach GC i CC,
co sugeruje, że polimorfizm genu IL-6 może warunkować
skuteczność leczenia metotreksatem i prednizonem chorych
na RZS [4].
Kolejnym przekładem zastosowania techniki RFLP
w diagnostyce klinicznej były badania dotyczące występowania polimorfizmów w genie MinK związanych z patogenezą migotania przedsionków (AF, ang. atrial fibrillation).
AF jest najczęstszą postacią złożonych zaburzeń serca.
Szczególną postać stanowi samoistne AF (ang. lone atrial
fibrillation) występujące u 2-31% chorych ze stwierdzoną
arytmią. Dotychczas zidentyfikowano 7 lokalizacji chromosomowych oraz opisano kilka mutacji i polimorfizmów prowadzących do rozwoju migotania przedsionków. Polimorfizm genu MinK ma wpływ na funkcję białka podjednostki
β kanału potasowego Iks, który pełni istotną rolę podczas repolaryzacji. Analiza restrykcyjna genu MinK pozwoliła na
określenie związku polimorfizmu G38S w tym genie z występowaniem samoistnego AF i na ocenę tego polimorfizmu
jako genetycznego markera podatności na AF. Badaniem
objęto grupę 69 chorych z samoistnym AF oraz 60 osób bez
występującej arytmii jako grupę kontrolną. W wyniku analizy restrykcyjnej z zastosowaniem enzymu HindIII otrzymano dwa produkty: jeden o długości 500 pz – forma alleliczna
S, drugi o długości 300 pz odpowiadający formie allelicznej
G. Stwierdzono znacznie częstsze występowanie allelu G
w grupie osób z AF w porównaniu z grupą kontrolną.
W grupie osób z AF najczęściej występował genotyp GS, następnie GG i najrzadziej genotyp SS. Uzyskane obserwacje
wskazały, że obecność genotypu GG związana była z ponad
10-krotnym, wzrostem zagrożenia występowania AF, natomiast obecność allelu S genu MinK może spełniać kryteria
czynnika ochronnego przed postępowaniem arytmii. W oparciu o wyniki powyższych badań wnioskowano, że polimorfizm
G38S genu MinK prawdopodobnie jest związany z samoistnym AF i może być zastosowany jako potencjalny genetyczny
marker zagrożenia występowania samoistnego AF [5].
Metodę PCR-RFLP zastosowano również do oceny polimorfizmu genu reduktazy metylenotetrahydrofolianowej
(MTHFR) uczestniczącej w przemianie homocysteiny (Hcy)
do metioniny. Gen MTHFR jest zbudowany z 11 eksonów
o wielkości od 102 do 432 pz oraz 10 intronów o wielkości
od 250 pz do 1,5 kilo par zasad (kpz). Wielkość trzeciego
intronu obejmuje 4,2 kpz. Badania nad genem MTHFR doprowadziły do identyfikacji rzadko występujących mutacji,
które prowadzą do bloku metabolicznego u homozygot,
co wiąże się z hiperhomocysteinemią wysokiego stopnia.
Obecnie opisano 24 mutacje prowadzące do akumulacji homocysteiny we krwi. W genie tym zidentyfikowano
również kilka polimorfizmów, z których najlepiej zbadane
pod względem wpływu na aktywność produktu białkowego
są: tranzycja C677T występująca w eksonie 4 i transwersja A1298C w eksonie 7. Szczegółowe badania zależności
między genotypem MTHFR a aktywnością enzymatyczną
produktu białkowego wykazały, że najniższa aktywność
i największa termolabilność enzymu występuje u homozygot oraz u mieszanych heterozygot polimorficznych alleli.
Wysoka aktywność reduktazy metylenotetrahydrofolianowej warunkuje sprawny metabolizm Hcy, zabezpieczający
śródbłonek naczyń krwionośnych przed niekorzystnym oddziaływaniem zarówno Hcy, jak i związków powstających
z tego aminokwasu jako produkty alternatywne. Wysoki
poziom Hcy we krwi uwarunkowany występowaniem polimorficznych odmian genu MTHFR sprzyja oksydacyjne-
&ARM0RZEGL.AUK
mu uszkodzeniu, zapaleniu i dysfunkcji śródbłonka naczyń
i stanowi niezależny czynnik ryzyka rozwoju miażdżycy
i chorób sercowo-naczyniowych. Zastosowanie metody
PCR-RFLP do określenia polimorfizmu genu MTHFR pozwoliło na dokładne oznaczenie genotypów osób z tętniakiem aorty brzusznej i ich porównanie z genotypami grupy
kontrolnej. W analizie RFLP wykorzystano enzymy restrykcyjne HindIII oraz MboII. Analiza asocjacji między polimorfizmami C677T i A1298C genu MTHFR a tętniakiem aorty
brzusznej została wykonana dla 63 chorych i 74 osób grupy
kontrolnej losowo wybranych z populacji polskiej. W grupie
63 chorych z tętniakiem aorty brzusznej stwierdzono znamienne statystycznie podwyższenie częstości występowania
allelu 677T MTHFR w stosunku do odpowiednich częstości
w grupie populacyjnej. Częstość występowania allelu 1298C
MTHFR w grupie osób chorych była wyższa od częstości
stwierdzonej w kontrolnej grupie populacyjnej [6, 7].
Postępująca dystrofia mięśniowa typu Duchenne’a
(DMD) jest chorobą genetyczną powodującą upośledzenie
ruchu i bardzo często paraliż kończyn, szczególnie kończyn
dolnych. Objawy choroby występują u osób, które mają
tylko jeden defektywny gen kodujący dystrofinę. Przykładem zastosowania techniki PCR-RFLP w odniesieniu do tej
jednostki chorobowej jest analiza regionu pERT87-15 genu
DMD przy udziale enzymu restrykcyjnego XmnI. W obrębie amplifikowanego fragmentu zidentyfikowano dwa miejsca rozpoznawane przez ten enzym: jedno stanowi marker
RFLP, drugie występuje w całej populacji i dlatego jest wykorzystywane jako kontrola trawienia enzymatycznego [8].
W prowadzonych badaniach określa się również nosicielstwo dystrofii mięśniowej Duchenne’a. W tym celu analizie
poddaje się fragment genu DMD obejmujący część 3’ intronu 16 i ekson 17, który wykazuje naturalny polimorfizm
długości fragmentów restrykcyjnych. Polimorficzne miejsce
w intronie 16 genu DMD jest rozpoznawane przez endonukleazę restrykcyjną TaqI. Produktami trawienia endonukleazą są allele o dwóch wielkościach, tj. allel TagI(-) – 416 pz
oraz allel TagI(+) z dwoma prążkami o długościach 182 pz
i 234 pz. Obecność allelu TaqI (-) jest sprzężona z mutacją
prowadzącą do choroby [9].
Metodę RFLP wykorzystuje się również do detekcji
infekcji bakteryjnych, jak również do oceny skuteczności
stosowanej terapii przeciwko określonym czynnikom patogennym. Przykładem jest wykrywanie zakażenia wywołanego Helicobacter pylori skutkującego chorobą wrzodową
i ocena efektów terapii z zastosowaniem kloritromycyny,
omeprazolu i omoksycyliny. Analizie restrykcyjnej z wykorzystaniem enzymów restrykcyjnych Sau3A i Hhal poddano
próbki DNA, izolowane z bioptatów żołądka 72 zainfekowanych osób przed i po terapii. W wyniku amplifikacji fragmentu genu ureC (820pz) uzyskano 42 różne profile RFLP
z preparatów pochodzących od pacjentów przed terapią
i 17 wzorów dla próbek pobranych od chorych po zakończonej terapii. Analiza wzorów polimorficznych RFLP przed
i po kuracji pozwoliła na określenie liczby osób podatnych
i opornych na terapię wyżej wymienionymi lekami [10].
Kolejnym przykładem zastosowania techniki RFLP są
badania dotyczące mutacji związanej z opornością pałeczek
Campylobacter jejuni na fluorochinolony. Mikroaerofilne
pałeczki C. jejuni są w wielu krajach najczęściej izolowanym
czynnikiem etiologicznym bakteryjnych zakażeń przewodu
pokarmowego występujących w populacji ludzkiej. Drobnoustroje te wywołują odzwierzęcą chorobę zakaźną zwaną
kompylobakteriozą, przebiegającą najczęściej pod postacią
zapalenia żołądkowo-jelitowego lub zapalenia jelit. W zakażeniach pałeczkami Campylobacter u osób dorosłych stosowane są fluorochinolony. Leki z tej grupy działają na gyrazę
DNA( topoizomeraza II) oraz topoizomerazę IV. Enzymy te
kontrolują przestrzenną konformację DNA bakterii, a także
biorą udział w procesie jego replikacji. Zablokowanie aktywności tych enzymów prowadzi do zahamowania replikacji DNA i śmierci komórki bakteryjnej. Oporność bakterii
na fluorochinolony ma najczęściej podłoże chromosomalne
i jest wynikiem punktowych mutacji w genach kodujących
gyrazę i/lub topoizomerazę IV, co powoduje zmiany w tych
białkach i zmniejszenie powinowactwa do fluorochinolonów. Celem badań prowadzonych przez Wardak i wsp. [11]
było określenie częstości występowania mutacji w kodonie 86 genu gyrA kodującym podjednostkę gyrazy DNA
u C. jejuni. Pałeczki tej bakterii wrażliwe na ciprofloksacynę posiadają sekwencję nukleotydową rozpoznawaną
przez enzym RsaI, natomiast szczepy z mutacją w kodonie
86 genu gyrA powodującą zamianę treoniny na izoleucynę,
takiej sekwencji nie posiadają. Przebadano 65 szczepów pałeczek C. jejuni i stwierdzono, że wszystkie szczepy oporne
na ciprofloksacynę posiadały punktową mutację w kodonie
86, natomiast szczepy wrażliwe na ten lek nie posiadały tej
mutacji [11].
Metoda RFLP może być również stosowana do wykrywania infekcji wirusowych, np. wywołanych wirusem HPV
(Human Papilloma Virus). HPV jest powszechnym, przenoszonym drogą płciową patogenem, który jest przyczyną
złośliwych nowotworów szyjki macicy. DNA tego wirusa
wykrywa się mniej więcej u 10% wszystkich chorych na ten
nowotwór. Dotychczas zidentyfikowano ponad 77 różnych
typów HPV. Metoda RFLP umożliwia identyfikację typu
i podtypu wirusa oraz wykrywanie nowych, zatem może
być stosowana w profilaktyce raka szyjki macicy, a także
w celu analizowania ewolucji wirusowego DNA. W badaniach przeprowadzonych metodą „Southern Blotting” w
odniesieniu do próbek zawierających wymaz z szyjki macicy pochodzących od 177 kobiet wybrano te zawierające
wirusowy DNA, który poddano trawieniu różnymi enzymami restrykcyjnymi (BamHI; HaeIII; HinfI; PstI i RsaI). Po
zsekwencjonowaniu otrzymanych produktów RFLP i porównaniu ze sobą uzyskanych profili możliwa była identyfikacja typu wirusa. Typ onkogenny HPV 16 zidentyfikowano
u 40,9% badanych, typy HPV 53 i HPV 58 u 13,6% przypadków, podobnie jak w typach mieszanych infekcji HPV [12].
Technika PCR-RFLP stosowana jest również do ustalenia ojcostwa pozwanego w oparciu o badania rodzinne,
kiedy nie dysponuje się jego profilem genetycznym. W tym
celu wykorzystuje się połączenie metody RFLP z analizą
STR (ang. short tandem repeat), tj. analizą oligonukleotydowych, tandemowych powtórzeń występujących w ilości
5-100 kopii o długości od 2 do 6 pz w pojedynczym locus.
Badanie z zastosowaniem analizy STR i RFLP pozwala na
potwierdzenie ojcostwa z prawdopodobieństwem graniczącym z pewnością > 99.999%. Analizę minisatelitarnego DNA
prowadzi się w oparciu o technikę RFLP stosując restrykcję
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
enzymem HinfI oraz hybrydyzację z sondami do pojedyńczego loci (SLP). W przedstawionych przez autorów badaniach
zastosowano zestaw 7 markerów RFLP-SLP oraz 15 markerów STR. Łączna analiza 7 układów RFLP-SLP wykazała
prawdopodobieństwo ojcostwa wynoszące 99.72% [13].
Piśmiennictwo
1. Nathans D, Smith HO. Restriction endonucleases in the
analysis and restructuring of DNA molecules. Ann Rev
Biochem 1975; 44: 273-293.
2. Słomski R. Wykrywanie mutacji i polimorfizmów metodą
PCR-RFLP. Przykłady analizy DNA. Praca zbiorowa. Wydawnictwo Akademii Rolniczej w Poznaniu 2004; 90-95.
3. Kucharska AM, Wiśniewski A, Rymkiewicz-Kluczyńska
B. Występowanie polimorfizmu w pozycji 49 eksonie
1 genu CTLA-4 u dzieci z chorobą Hashimoto. Endokrynologia, Diabetologia i Choroby Przemiany Materii
Wieku Rozwojowego. 2006; 12: 163-166.
4. Pawlik A, Czerny B, Dąbrowska-Żamojcin E, Górnik W,
Poziomkowska I, Gawrońska-Szklarz B, Herczyńska M.
Wpływ polimorfizmu interleukiny-6 na skuteczność leczenia
chorych na reumatoidalne zapalenie stawów metotreksatem i
prednizonem. Pol Arch Med Wewn 2005; 114: 843-847.
5. Prystupa A, Dzida G, Myśliński W, Małej G, Lorens T.
Polimorfizm genu MinK w patogenezie samoistnego migotania przedsionków. Kardiol Pol 2006; 64: 1205-1211.
6. Kang SS, Wong P, Bock HG, Horwitz A, Grix A. Intermediate hyperhomocysteinemia resulting from compound heterozygosity of methylenetetrahydrofolate reductase mutations. Am J Hum Genet 1991; 48: 546-551.
7. Strauss E, Waliszewski K, Gabriel M, Zapalski S, Pawlak AL. Increased risk of abdominal aortic aneurysm in
carriers of MTHFR677T allele. J Appl Genet 2003; 44:
85-93.
8. Roberts RG, Cole CG, Hart KA, Bobrow M, Bentley
DR. Rapid carrier and prenatal diagnosis of Duchene and Becker muscular dystrophy. Nucleic Acids Res
1989; 17: 811.
9. Karczmarek M, Hoppe-Gołębiewska J, Napierała D,
Słomski R. Wykrywanie mutacji i polimorfizmów genu
DMD metodą PCR-RFLP. Analiza DNA-teoria i praktyka. Wydawnictwo Uniwersytetu Przyrodniczego w Poznaniu 2008; 306-311
10. Stone GG, Shortridge D, Flamm RK, Beyer J, Ghoneim
AT, Tanaka SK. PCR-RFLP typing of ureC from Helicobacter pylori isolated from gastric biopsies during a
European multi-country clinical trial. J Antimicrob Chemother 1997; 40: 251-256.
11. Wardak S, Szych J, Cieślik A. Wykorzystanie techniki
PCR-RFLP do wykrywania mutacji w kodonie 86 genu
gyrA związanej z opornością na fluorochinolony pałeczek Campylobacter jejuni. Med Dośw Mikrobiol 2005;
57: 295-301.
12. Astori G, Beltrame A, Pipan C, Raphenon G, Botta GA.
PCR-RFLP-Detected Human Papilloma Virus Infection
In a Group of Senegalese Women Attending an STD Clinic and Identification of a New HPV-68 Subtype. Intervirology 1999; 42: 221-227.
13. Jacewicz R, Szram S. Polimorfizm STR a RFLP w ustaleniu ojcostwa na podstawie badań rodzinnych. Arch
Med Sąd Krym 2005; LV: 36-38.
data otrzymania pracy: 23.03.2010 r.
data akceptacji do druku: 20.04.2010 r.
Adres do korespondencji:
dr Ewa Moric-Janiszewska,
Katedra i Zakład Biochemii, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach,
41-200 Sosnowiec, ul. Narcyzów 1,
tel.+ 48 32 364 10 06;
e-mail: [email protected]