Chromatografia powinowactwa

Chromatografia powinowactwa
Wyciąg z kart charakterystyki substancji niebezpiecznych:
kwas octowy, 96% - C
kwas solny - C
odczynnik Bradford - Xn
p-nitrokatechol - Xi
siarczan p-nitrokatecholu - Xi
Tris – Xi
wodorotlenek sodu - C
Cel:
Oczyszczenie arylosulfatazy z homogenatu wątroby metodą chromatografii powinowactwa z lektynami
oraz sporządzenie bilansu oczyszczania.
Zasada:
Zasada chromatografii powinowactwa z lektynami opiera się na oddziaływaniach pomiędzy lektyną a cukrem.
Lektyna to białko nie będące enzymem ani przeciwciałem, mające zdolność do specyficznego,
niekowalencyjnego wiązania reszt cukrowych. Nośnik (np. pochodna agarozowa Sepharose) może zawierać
unieruchomioną lektynę a z mieszaniny poddawanej procesowi oczyszczania wyodrębniane są cukry,
glikoproteiny, proteoglikany, glikolipidy, liposacharydy lub polisacharydy. Często stosowaną do chromatografii
lektyną jest konkanawalina A, która rozpoznaje reszty mannozy wchodzące w skład części cukrowej licznych
glikoprotein. W pierwszym etapie glikoproteiny wiążą się z lektyną a substancje balastowe są wypłukiwane z
kolumny. Następnie związane glikoproteiny są uwalniane i wymywane ze złoża w tzw. procesie elucji na skutek
konkurowania cząsteczek eluentu (np. metylo-α-D-mannozyd) o miejsca wiązania na lektynie. Eluat to ciecz
wymyta z kolumny chromatograficznej zawierająca m.in. oczyszczaną substancję.
Arylosulfatazy (EC 3.1.6.1) to glikoproteiny należące do klasy hydrolaz. Są obecne w licznych tkankach
organizmu, np. w lizosomach wątroby. Wyróżnia się arylosulfatazy A, B i C ze względu na różnice w ich masie
cząsteczkowej, lokalizacji subkomórkowej, wpływie inhibitorów, specyficzności i powinowactwie do substratu oraz
optimum pH. Enzymy te katalizują reakcje hydrolizy estrów siarczanowych i pełnią istotne funkcje. Dla przykładu,
jednym z naturalnych substratów dla arylosulfatazy A jest siarczan cerebrozydu będący składnikiem mieliny.
Niedobór tego enzymu powoduje demielinizację prowadzącą do zaburzeń neurologicznych (leukodystrofia
metachromatyczna).
Do oznaczania aktywności arylosulfataz stosuje się substraty syntetyczne takie jak estry siarczanowe fenoli np.
siarczan p-nitrokatecholu (skrót NCS, 2-hydroksy-5-nitrofenylosiarczan). Produktem hydrolizy jest p-nitrokatechol
o maksimum absorbcji promieniowania przy długości fali 515 nm. Wyizolowana w procesie chromatografii
arylosulfataza jest białkiem natywnym a jej zdolności katalityczne można wykorzystać do określenia stopnia
oczyszczenia próbki.
1
Opis wykonania:
I. Chromatografia powinowactwa
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Przygotować w statywie 20 opisanych kolejnymi numerami kalibrowanych probówek do zbierania frakcji.
Otworzyć odpływ kolumny i pozwolić, aby bufor wypłynął aż do momentu, gdy dolny menisk będzie nieco
powyżej górnej granicy złoża chromatograficznego. Nie wolno dopuścić do wyschnięcia złoża. Prędkość
przepływu powinna wynosić ok. 1 ml/min. Zamknąć odpływ kolumny.
Bardzo ostrożnie nanieść 1 ml homogenatu ruchem okrężnym po ściankach kolumny ponad powierzchnię
złoża, nie dopuszczając do jego wzburzenia.
Otworzyć wylot kolumny i rozpocząć zbieranie frakcji do przygotowanych probówek (po 2 ml).
Równocześnie nie dopuścić, aby poziom cieczy dotarł do górnej granicy złoża. W tym celu, natychmiast
bardzo ostrożnie dodawać 2 razy po 1 ml buforu. Należy uniknąć wzburzenia powierzchni złoża w trakcie tej
czynności.
Przemywać kolumnę dodając 9 x 2 ml buforu, równocześnie zbierając 9 dodatkowych frakcji. Dbać, aby słup
cieczy o wysokości przynajmniej 2-3 cm był stale obecny w górnej strefie kolumny.
Nałożyć 2 x 2 ml roztworu do elucji (eluentu) równocześnie zbierając pierwszą frakcję eluatu i zamknąć
kolumnę na 10 min.
Otworzyć odpływ kolumny, zbierać kolejne próbki eluatu do probówek i dodawać kolejne porcje eluentu
(8 x 2 ml).
Monitorować rozdział mierząc wartości absorbancji przy λ = 280 nm dla poszczególnych frakcji płukania
i elucji wobec ślepej odczynnikowej (bufor) przy użyciu spektrofotometru UV-VIS.
Płukać kolumnę buforem a na koniec zamknąć jej wylot.
II. Oznaczanie stężenia białka metodą Bradford (Bradford, 1976)
1.
2.
3.
Przygotować krzywą kalibracyjną zgodnie z instrukcją „Metody oznaczania stężenia białka”.
Przygotować rozcieńczenia homogenatu w probówkach wirowniczych typu eppendorf w następujący
sposób:
25x:
5 µl homogenatu + 120 µl wody destylowanej
50x:
50 µl homogenatu rozcieńczonego 25x + 50 µl wody destylowanej.
Roztwory wymieszać i zwirować.
W płytce 96-dołkowej przygotować ślepą odczynnikową (10 μl wody destylowanej) oraz próbki badane
pipetując do oddzielnych dołków po 10 μl nierozcieńczonego eluatu (2 powtórzenia) i po 10 μl
rozcieńczonych homogenatów (25x i 50x). Do wszystkich próbek dodać po 250 μl odczynnika Bradford.
W czasie 5 – 20 min od momentu dodania odczynnika zmierzyć absorbancję w czytniku do płytek
titracyjnych przy λ = 595 nm względem ślepej odczynnikowej. Od wartości absorbancji dla próbek odjąć
wartość dla próby ślepej i uzupełnić tabelę nr 1.
III. Oznaczanie aktywności enzymatycznej arylosulfataz A i B (Worwood i wsp., 1973)
1.
2.
Przygotować mieszaniny reakcyjne pipetując do oddzielnych probówek wirowniczych typu eppendorf po 30
µl nierozcieńczonego eluatu (2 powtórzenia) oraz po 30 µl nierozcieńczonego homogenatu (2 powtórzenia).
Dodać do nich po 100 µl buforu octanowego o pH = 5,6. W oddzielnej probówce przygotować ślepą
odczynnikową zawierającą 130 µl buforu. Do wszystkich próbek dodać po 30 µl roztworu substratu
(siarczan p-nitrokatecholu, NCS) i dokładnie wymieszać.
Prowadzić inkubację w temperaturze 37°C przez 10 min.
2
3.
4.
Zatrzymać reakcję enzymatyczną przez dodanie do wszystkich probówek po 0,5 ml stopera (0,25 M NaOH).
Dokładnie wymieszać.
Przenieść po 200 μl próbek do oddzielnych dołków płytki 96-dołkowej. Zmierzyć absorbancję w czytniku
do płytek przy λ = 515 nm względem ślepej odczynnikowej. Od wartości absorbancji dla próbek odjąć
wartość dla ślepej odczynnikowej i uzupełnić tabelę nr 2.
Analiza wyników:
1.
2.
3.
4.
Narysować wykres zależności A280 od numeru frakcji uzyskanej w trakcie rozdziału chromatograficznego
(chromatogram). Określić numer frakcji eluatu o najwyższej zawartości białka. Oznaczenia stężenia białka
i aktywności enzymatycznej są wykonywane dla tej frakcji eluatu.
Obliczyć stężenie białka w nierozcieńczonym eluacie i homogenacie korzystając z krzywej kalibracyjnej.
Wynik umieścić w tabeli 1.
Obliczyć wartości aktywności enzymatycznej arylosulfatazy w eluacie i homogenacie wyrażone w U (µmol
p-nitrokatecholu / ml / min) korzystając ze wzoru:
(A515 ∙ Vc / Vp) / t ∙ 12,6
Vc – całkowita objętość próbki inkubowanej
Vp – objetość roztworu badanego (homogenatu / eluatu)
t – czas inkubacji [min]
12,6 – współczynnik absorbcji
Wynik umieścić w tabeli 2.
Obliczyć aktywność właściwą arylosulfatazy w homogenacie i eluacie oraz współczynnik oczyszczenia
będący ilorazem aktywności właściwej w eluacie oraz aktywności właściwej w homogenacie. Wynik
umieścić w tabeli 3.
Materiały, odczynniki i aparatura laboratoryjna:
Bufor do rozdziału chromatograficznego: 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2,
1 mM MnCl2, eluent: 0,5 M metylo-α-D-mannozyd w buforze, homogenat wątroby szczura, kolumna
chromatograficzna wypełniona złożem (3 ml Sepharose-ConA) umieszczona w statywie z uchwytem, statywy na
probówki, kalibrowane probówki do zbierania frakcji, pipety automatyczne, końcówki do pipet automatycznych,
spektrofotometr UV-VIS, kuweta kwarcowa, czasomierz, probówki wirownicze typu eppendorf, wirówka, czytnik
do mikropłytek, płytki 96-dołkowe, suchy blok grzejny, odczynnik Bradford, wzorcowy roztwór BSA o stężeniu 0,5
mg/ml, woda destylowana, bufor do reakcji enzymatycznej: 250 mM octan sodu – kwas octowy, pH 5,6, substrat:
3 mM siarczan p-nitrokatecholu w 250 mM CH3COONa – CH3COOH, pH 5,6, stoper: 0,25 M NaOH
Zalecana literatura:
„Biochemia. Krótkie wykłady” red. D. Hames, N. Hooper, PWN, Warszawa 2010; rozdział pt. „Oczyszczanie białek”; str. 7477.
"Wybrane zagadnienia z biochemii ogólnej" T. Kędryna, M. Gałka-Walczak, B. Ostrowska, Wydawnictwo UJ, Kraków 2001;
str. 288-289.
3