RECENZJA PRACY DOKTORSKIEJ mgr farm. Anny Kasprzyk pt

RECENZJA PRACY DOKTORSKIEJ
mgr farm. Anny Kasprzyk
pt. „Farmakokinetyka i dystrybucja narządowa treosulfanu i jego
biologicznie aktywnego monoepoksytransformeru”
Badania
farmakokinetyczne
stanowią
bardzo
ważny
element
w badaniach nad lekiem, ponieważ pozwalają na poznanie procesów jakim
lek podlega w ustroju, dostarczają danych do oszacowania parametrów
farmakokinetycznych i ich zmienności w populacji, a uzyskane wyniki mogą
stanowić podstawę optymalizacji farmakoterapii. Jednym z ważnych
aspektów w tych badaniach jest opracowanie czułej, selektywnej, dokładnej
i precyzyjnej metody analitycznej. Metoda taka powinna zostać zwalidowana
zgodnie z wytycznymi dla metod bioanalitycznych. Praca doktorska mgr
Anny Kasprzyk wykonana pod kierunkiem prof. dr hab. Franciszka Główki,
przy udziale dr Michała Romańskiego jako promotora pomocniczego,
dotyczy tego typu badań nad treosulfanem - cytostatykiem od niedawna
stosowanym
w
kondycjonowaniu
przed
przeszczepami
komórek
krwiotwórczych (hematopoietic stem cell transplantation, HSCT). Praca
realizowana była ze środków Uniwersytetu Medycznego im. Karola
Marcinkowskiego w Poznaniu oraz Narodowego Centrum Nauki we
współpracy
z
Kliniką
Onkologii,
Hematologii
i
Transplantologii
Pediatrycznej Uniwersytetu Medycznego im. Karola Marcinkowskiego
w Poznaniu i Kliniką Transplantologii Szpiku, Onkologii, Hematologii
Dziecięcej Uniwersytetu Medycznego we Wrocławiu oraz Katedrami
Medycyny Sądowej oraz Histologii i Embriologii Uniwersytetu Medycznego
w Poznaniu.
Ocena merytoryczna pracy
Jak wynika z danych literaturowych, treosulfan jest lekiem
o stosunkowo słabo poznanych właściwościach farmakokinetycznych
i
niewykorzystanych
możliwościach
terapeutycznych.
Jeszcze
mniej
wiadomo na temat farmakokinetyki jego aktywnych epoksytransformerów,
które powstają w nietypowy sposób, bo bez udziału enzymów. Brak jest także
danych na temat dystrybucji tego leku do tkanek potencjalnie związanych
z jego toksycznością oraz do miejsca działania jakim jest, w przypadku
kondycjonowania przed HSCT, szpik kostny. Stąd, konieczne są dalsze
badania zarówno kliniczne, jak i przedkliniczne w celu pogłębienia wiedzy na
temat tego leku i jego aktywnych transformerów oraz ich losów
w organizmie. Wśród leków stosowanych w terapii kondycjonującej,
treosulfan wydaje się być bardzo atrakcyjną alternatywą dla istniejących
schematów
kondycjonowania.
Charakteryzuje
się
znacznie
mniejszą
toksycznością w stosunku do innych leków o podobnym zastosowaniu, stąd
też może być stosowany u pacjentów pediatrycznych i osób w podeszłym
wieku.
W świetle tych danych, tematyka podjęta przez Doktorantkę jest
niezmiernie ważna i aktualna. W swoich badaniach wybrała populację
pacjentów pediatrycznych, u których stosowanie standardowej terapii było
przeciwskazane. Uzyskane wyniki badań farmakokinetycznych wraz z pełną
informacją o tych pacjentach umożliwiło przeprowadzenie dogłębnej analizy
uzyskanych danych i poszukiwanie korelacji, które mogą być pomocne
w optymalizacji dawkowania badanego leku. Należy podkreślić, że tego typu
badania,
uwzględniające
stężenia
aktywnych
produktów
aktywacji
treosulfanu, do tej pory prowadzone były na bardzo małej grupie chorych
(dwoje dzieci poddanych kondycjonowaniu przed HSCT). Z kolei badania
farmakokinetyczne na zwierzętach prowadzone były wyłącznie na królikach
i obejmowały, oprócz pomiaru stężeń badanego związku i jego dwóch
aktywnych transformerów w osoczu, ocenę dystrybucji tych związków do
cieczy wodnistej oka.
Efektem przeprowadzonych badań są interesujące i wartościowe
wyniki, które
pozwalają na poznanie farmakokinetyki treosulfanu i jego
epoksytransformeru w grupie 16 pacjentów pediatrycznych z dwóch klinik
onkologicznych z różnymi typami nowotworów, głównie
układu
krwiotwórczego. Są to wyniki unikatowe w skali świata, których
zgromadzenie wymagało umiejętności współpracy z lekarzami. Prowadzone
badania mają nie tylko charakter poznawczy, ale także posiadają kilka
aspektów praktycznych. Wykazano m.in., że nie ma potrzeby różnicowania
dawek treosulfanu w zależności od wieku i powierzchni ciała dziecka oraz, że
obecnie stosowane schematy dawkowania tego leku są właściwe, gdyż
zapewniają całkowita eliminację leku proleku i jego aktywnego transformeru
przed wykonaniem przeszczepienia. Z kolei badania na zwierzętach
przyczyniły się do wyjaśnienia przyczyn niskiej toksyczności treosulfanu,
która związana jest z niewielką dystrybucją tych związków do mózgu
i wątroby. Jeszcze jeden aspekt praktyczny przeprowadzonych badań, to
potwierdzenie przydatności pomiarów stężeń badanych związków w osoczu
u tych pacjentów, gdyż korelują one ze stężeniami tych związków w szpiku
kostnym. Co więcej, w ramach przedstawionej do recenzji pracy doktorskiej
opracowano i zwalidowano zgodnie z wytycznymi EMA metodę analityczną,
która umożliwiła oznaczenie badanych związków w różnych matrycach
biologicznych i z całą pewnością będzie wykorzystywana w przyszłości do
dalszych badań nad treosulfanem.
Praca napisana jest bardzo starannie, poprawnie pod względem
edytorskim, stylistycznym i gramatycznym. Wyniki przedstawiono w postaci
licznych tabel i rycin, które są niezwykle przejrzyste i właściwie
zinterpretowane. W opisach tabel i rycin można doszukać się wszystkich
niezbędnych informacji do zrozumienia zawartych w nich treści. Wśród
nielicznych nieścisłości należy zwrócić uwagę na podrozdział 10.4 i 11.4:
„Analiza parametrów farmakokinetycznych”, gdzie powinno być: „Analiza
farmakokinetyczna” oraz w wielu miejscach pracy: „kryteria
Akaike
i Schwartza”, gdzie powinno być: „kryteria Akaike i Schwarz’a”.
Ocena metodologiczna pracy
Rozprawa mgr Anny Kasprzyk liczy 190 stron i ma układ klasyczny,
czyli składa się ze wstępu, celu pracy, części doświadczalnej, wyników,
omówienia wyników i dyskusji oraz wniosków. We wstępie Doktorantka
omawia szeroko historię przeszczepień komórek krwiotwórczych oraz
aktualnie stosowane schematy kondycjonowania przed przeszczepem,
budowę i mechanizmy działania busulfanu i treosulfanu, działania
niepożądane
związane
z
ich
stosowaniem
oraz
właściwości
farmakokinetyczne tych leków. Cel pracy jest jasno sprecyzowany,
a zaproponowane zadania badawcze są sformułowane poprawnie i logicznie
ze sobą powiązane. Zastosowane metody badawcze są nowoczesne
i zaawansowane technologicznie. Co więcej, zostały one trafnie dobrane do
rodzaju zadań badawczych i zamierzonych celów. Do oznaczenia stężeń
badanych związków Doktorantka zastosowała skomplikowaną technikę
LC/MS/MS. W ramach badań opracowała oryginalną metodę oznaczania
badanych związków w różnych matrycach biologicznych i przeprowadziła jej
walidację zgodnie z wymogami EMA. Do analizy uzyskanych wyników
zastosowała profesjonalne programy komputerowe, takie jak: WinNonlin,
Statistica oraz GraphPad Prism. Na szczególną uwagę zasługuje dyskusja
wyników, która jest niezwykle rzeczowa i wnikliwa. Omawiając wyniki
Doktorantka często odnosi swoje rozważania do danych literaturowych liczba cytowanych prac to aż 152 pozycje, które, w większości, ukazały się w
ostatnich latach. Konsekwencją dyskusji wyników są wnioski, które trafnie
podsumowują całą pracę i wskazują najważniejsze jej osiągnięcia. Pracę
zamyka 6 załączników, zawierających m.in. zgody odpowiednich komisji
etycznych oraz wyniki dopasowania modeli farmakokinetycznych do stężeń
badanych związków pochodzących od poszczególnych pacjentów.
Po zapoznaniu się z metodologią badań nasuwają się następujące
uwagi i propozycje:
Walidacja metod bioanalitycznych wg EMA obejmuje także badania
stabilności standardu wewnętrznego oraz roztworów zapasowych
i roboczych. Ponadto brak w opisie walidacji metody analitycznej
informacji o badaniach stabilności z użyciem osocza ludzkiego oraz
informacji czy i w jakich warunkach przechowywano próbki.
Dopasowując
model
dwukompartmentowy
do
danych
farmakokinetycznych zazwyczaj oczekuje się parametrów tj.: V1, k10, k12
i k21. W oparciu o nie można obliczyć tzw. parametry drugorzędne, np.:
CL, AUC, czy t0.5. Nie jest jasne, dlaczego Doktorantka w Tabeli 27
podaje wartości parametrów typowych dla analizy bezmodelowej,
podczas gdy w opisie tabeli wspomina o modelu dwukompartmentowym.
W celu wyboru właściwego modelu farmakokinetycznego, Doktorantka
stosowała kryteria informacyjne Akaike i Schwarz. Tymczasem ocena
dobroci dopasowania obejmuje także inne elementy, tj. wizualna ocena
dopasowania modelu do danych, wielkości współczynników zmienności
i błędu standardowego parametrów farmakokinetycznych i, przede
wszystkim, analiza rozkładu reszt (Gabrielsson J., Weiner D.:
Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Data Analysis: Concepts and
Applications, 4th Edition, Swedish Pharmaceutical Press 2007). W pracy
nie zamieszczono także informacji czy i jakie wagi zastosowano
dopasowując modele do danych w programie WinNonlin.
Dysponując stężeniami leku macierzystego i jego transformeru nie
podjęto próby opracowania modelu z kompartmentem dla metabolitu.
Takie podejście pozwoliłoby na równoczesne dopasowanie stężeń obu
związków oraz na oszacowanie stałej szybkości powstawania aktywnego
transformeru.
Doktorantka podjęła próbę przewidywania pola pod krzywą zmian
stężenia w czasie w szpiku kostnym pacjentów na podstawie znajomości
stężeń badanych związków w osoczu i szpiku szczurów. Mając do
dyspozycji program WinNonlin, można byłoby pokusić się o zbudowanie
modelu fizjologicznego z uwzględnieniem wszystkich badanych tkanek
i organów szczura, a następnie przeprowadzić symulacje stężeń tych
związków w tkankach, w tym w szpiku kostnym, u ludzi.
Nie wyjaśniono, dlaczego w badaniach wykorzystano zwierzęta obydwu
płci oraz przyczyn, dla których w badaniach na zwierzętach wybrano
drogę dootrzewnową, podczas gdy pacjenci otrzymywali lek drogą
dożylną.
Przedstawione uwagi nie umniejszają oceny merytorycznej pracy,
która jest bardzo ambitna i świadczy o dużej wiedzy i umiejętnościach
Doktorantki w zakresie prowadzenia badań farmakokinetycznych oraz
rozwoju i walidacji metod analitycznych, jak również dowodzi znajomości
nowoczesnych programów do analizy farmakokinetycznej i statystycznej.