Rekombinowane wektory wirusowe rAAV w terapii genowej

&ARM0RZEGL.AUK†
2EKOMBINOWANEWEKTORYWIRUSOWER!!6
WTERAPIIGENOWEJNOWOTWORÌW
2ECOMBINANTADENO†ASSOCIATEDVIRUSVECTORR!!6
PREPARATIONS
FORCANCERGENETHERAPY
-ACIEJ-AŒECKI+AROLINA(AJDUKIEWICZ*AN0ACHECKA
:AKŒAD"IOLOGII+OMÌRKI#ENTRUM/NKOLOGII†)NSTYTUTIM-ARII3KŒODOWSKIEJ†#URIE7ARSZAWA
+ATEDRAI:AKŒAD"IOCHEMIII#HEMII+LINICZNEJ7YDZIAŒ&ARMACEUTYCZNY7ARSZAWSKI5NIWERSYTET-EDYCZNY
7ARSZAWA
PO+IEROWNIKA:AKŒADU"IOLOGII+OMÌRKIDOCDRHAB-ACIEJ-AŒECKI
+IEROWNIK+ATEDRYI:AKŒADU"IOCHEMIII#HEMII+LINICZNEJPROFDRHAB*AN0ACHECKA
Streszczenie
W terapii genowej wykorzystuje się, zawierające kodujące sekwencje kwasów nukleinowych, preparaty genowe wprowadzane do komórek za pomocą nośników
genów, czyli wektorów. Prawidłowy układ nośnik/gen
decyduje o wydajnym procesie transfekcji oraz ekspresji genów, która warunkuje efekt terapeutyczny, odpowiedź biologiczną komórek, narządów. Prowadzone są
intensywne badania nad uzyskiwaniem bezpiecznych
dla pacjentów preparatów genowych. Wektory konstruowane w oparciu o genom wirusów związanych
z adenowirusami (rAAV) efektywnie wnoszą geny do
komórek, są nietoksyczne i niepatogenne. rAAV wykorzystywane są w badaniach podstawowych oraz w leczeniu chorych na nowotwory. Próby kliniczne terapii
genowej z rAAV zostały przeprowadzone u chorych na
nowotwory skóry oraz prostaty. Obecność rAAV w klinice odzwierciedla postęp w terapii genowej, a tym samym ujawnia kierunki rozwoju współczesnej farmacji.
Słowa kluczowe: terapia genowa, wirusy związane
z adenowirusami, nowotwory
'‚–|ª-J®RylR
Terapia genowa, terapia fotodynamiczna czy wykorzystanie komórek macierzystych do celów terapeutycznych
odzwierciedlają postęp w naukach farmaceutycznych, a ich
obecność w klinice czyni możliwym leczenie pacjentów, dla
których klasyczne środki i metody leczenia nie są do końca skuteczne. Terapia genowa, znana w klinice od lat 90.
ubiegłego stulecia [1] wykorzystuje geny kodujące białka
o funkcji terapeutycznej. W chwili obecnej w badaniach klinicznych terapii genowej wykorzystuje się nośniki genów
konstruowane głównie w oparciu o genom adenowirusów,
lentiwirusów oraz wirusów związanych z adenowirusami
Abstract
Gene therapy methods are based on coding nucleic acid
sequences that are administered directly to cells via
carriers commonly recognized as DNA vectors. The
correctly prepared cDNA/vector formula determines
efficient transfection of cells, transgen expression, and
therefore biological responses. The studies concerning
the development of safe and efficient vectors are still
conducted. Recombinant adeno-associated virus vectors
(rAAV) are a most promising candidates for cancer gene
therapy protocols. They are nonpathogenic and seem to
be safer than other viral vectors. rAAV effectively infect cancer cells of broad range and permit stable and
efficient transgene expression. In vivo studies show a
promising observations and therapeutic implications.
So far, recombinant adeno-associated based vectors are
successfully used in the clinic for gene therapy of melanoma and prostate patients.
Key words: gene therapy, adeno-associated viruses,
cancers
(AAV). Wiele opracowań wskazuje, iż preparaty genowe wirusowe, mimo iż efektywnie wnoszą geny do komórek, nie
są bezpieczne dla pacjentów . Najczęściej opisywane niepożądane działania rekombinowanych wirusów to wysoka immunogenność oraz mutageneza insercyjna. W chwili obecnej wektory konstruowane w oparciu o genom AAV należą
do najbezpieczniejszych. rAAV bardzo wydajnie infekują
komórki gospodarza, a czas ekspresji transgenu jest długi.
W próbach terapii genowej wykorzystuje się rAAV z uwagi
na brak ich patogenności, toksyczności, wydajną infekcję
komórek oraz długą i wysoką ekspresję wprowadzanych
genów. Atrakcyjność kliniczną rAAV zwiększa również występowanie w przyrodzie serotypów AAV (AAV1-AAV12).
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
Możliwość konstruowania in vitro serotypów rAAV pozwala na przygotowywanie preparatów genowych wnoszących
geny do określonych narządów człowieka. Dalsze badania
przedkiniczne i kliniczne wskażą czy i kiedy rAAV staną się
uniwersalnymi nośnikami genów w terapii genowej i rozszerzą tym samym spektrum środków leczniczych współczesnej farmakoterapii.
'l–¥˜¬Ÿ®ªlÔ®-yRŸ®Ÿ-JRy|ªl–¥˜-ulŸŸ„&…
Wirusy AAV należą do rodziny Parvoviridae, rodzaju
Dependovirus. AAV mają średnicę około 25 nm, symetrię
ikozahedralną i zawierają pojedynczą nić DNA, składającą się z 4680 par zasad (AAV2). Genom wirusa AAV zbudowany jest z dwóch otwartych ramek odczytu lewej rep
i prawej cap, oskrzydlonych sekwencjami ITR (ang. inverted terminal repeats) złożonymi ze 145 par zasad. Sekwencje ITR są niezbędne do replikacji, pakowania i integracji
DNA AAV do genomu gospodarza. W wirusowym genomie
można wyróżnić trzy promotory: p5, p19 i p40. Dwa pierwsze odpowiedzialne są za ekspresję genów białek Rep, natomiast promotor p40 reguluje ekspresją białek kapsydowych
Cap. Zmienność składu aminokwasowego białek kapsydowych determinuje występowanie w przyrodzie serotypów
AAV wykazujących tropizm narządowy. AAV nie posiadają zdolności do samodzielnego namnażania się w komórce
gospodarza, a do replikacji genomu wymagają obecności
wirusa wspomagającego. Wśród najczęściej opisywanych
wirusów ko-infekujących opisuje się adenowirusy oraz herpeswirusy. Unikalną cechą AAV jest również zdolność do
miejscowo-specyficznej integracji własnego DNA do chromosomu 19 człowieka (19q13.4, AAVS1) [2]. Wnikanie
AAV (transdukcja, infekcja) do komórek jest procesem wieloetapowym, w którym można wyróżnić przyłączenie wirusa do powierzchni komórki, transport wewnątrzkomórkowy,
zdarzenia jądrowe. Rozpoznanie i związanie AAV z błona
komórkową wiąże się z oddziaływaniem białek kapsydu wirusów z receptorami komórkowymi. W przypadku wirusa
AAV serotyp 2 (AAV2) najczęściej opisywanymi receptorami są proteoglikany bogate w siarczan heparanu (HSPG).
W wiązaniu błonowym AAV biorą także udział receptory
pomocnicze - ko-receptory, np. dla AAV2 ko-receptorami są
np. integryny oraz receptor dla czynnika wzrostu fibroblastów 1 (FGFR1) [3].
Rp|u7ly|ª-yRŸªRp |–¬Ÿ&Ÿ
o-p|Ÿ‚| RyAo-qyRŸ²–|JplŸqRA®ylA®R
Środki lecznicze współczesnej farmakoterapii mają
zdefiniowaną strukturę, postać, cechuje je ściśle określony
skład ilościowy i jakość, uzyskiwane są dzięki powtarzalnym procedurom syntezy. Znana jest ich aktywność biologiczna, działania niepożądane, a znaczenie kliniczne jest
już najczęściej dobrze udokumentowane. Preparaty genowe, których podstawą są kwasy nukleinowe, są w chwili
obecnej wykorzystywane głównie w pracach eksperymentalnych na liniach komórkowych i zwierzętach oraz stanowią przedmiot wstępnych prób klinicznych terapii genowej
na pacjentach. Biochemiczna formuła preparatu genowego sprowadza się do sekwencji DNA kodujących wybrane
białka o funkcji terapeutycznej, zaś postać farmaceutyczna – determinowana bezpośrednio przez rozwój technologii farmacji stosowanej – sprowadza się do formy wektora
– wirusowego lub niewirusowego nośnika genów. Zainteresowanie wirusowymi wektorami AAV wynika bezpośrednio z
ich charakterystyki molekularno-biochemicznej. Uzyskiwane in vitro - rekombinowane AAV- efektywnie wnoszą geny
do komórek oraz pozwalają na długą ekspresję transgenów,
są nieimmunogenne i niepatogenne dla gospodarza. Obecność serotypów AAV zwiększa ich atrakcyjność kliniczną.
W chwili obecnej, dzięki metodom inżynierii genetycznej,
możliwym jest w warunkach laboratorium konstruowanie
i namnażanie wirusów AAV niosących wybrane geny terapeutyczne. Formuła uzyskiwania rAAV przewiduje także
przygotowanie preparatów genowych rAAV do stosowania
w klinice, czyli spełniających farmakopealne wymagania jakości [4]. Uzyskiwanie rekombinowanych wektorów AAV
wiąże się z potrzebą klonowania molekularnego genów
AAV w formie plazmidów. Istniejąca w chwili obecnej procedura przewiduje wykorzystanie plazmidów AAV (pAAV)
niosących geny rep, cap, transgen oskrzydlony sekwencjami ITR oraz genów wirusów wspomagających np. adenowirusowe geny E1, E2A, E4, VA. Plazmidy wprowadza się
do komórek pakujących hodowanych w warunkach in vitro
w formie hodowli adhezyjnych lub zawiesinowych. Najczęściej wykorzystuje się komórki pakujące ustalonych linii
komórkowych HEK293, HEK293T, HeLa, A549. Z komórek pakujących, transfekowanych pAAV izoluje się cząstki
rekombinowanych wektorów AAV niosących wybrane geny
terapeutyczne. Ilość cząstek wirusowych (miano) w uzyskanym preparacie ocenia się głównie poprzez określenie np.
metodą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (ang. real
time PCR) liczby kopii genomu rAAV w preparacie (gc/ml).
Wyniki badań oceniających natomiast jakość uzyskanego
preparatu – czystość biochemiczną, mikrobiologiczną, toksykologiczną warunkują wykorzystanie preparatu w warunkach klinicznych.
–R‚-–- ¬Ÿ–&ŸªŸ R–-‚llŸaRy|ªRoŸ
y|ª| ª|–}ª
W terapii genowej chorych na nowotwory wykorzystywane są geny kodujące białka o zdefiniowanej aktywności
antynowotworowej. Badania prowadzone są z rekombinowanymi wektorami AAV jako nośnikami genów kodujących
białka proapoptotyczne, antyangiogenne, immunotropowe.
Większość badań prowadzonych jest w warunkach eksperymentalnych – na komórkach linii komórkowych oraz na
zwierzętach laboratoryjnych. Pierwsze próby kliniczne terapii genowej z rAAV zostały przeprowadzone u chorych na
raka prostaty i czerniaka [1].
Geny samobójcze W terapii genowej nowotworów nierzadko wykorzystuje się rAAV niosące geny samobójcze.
Do komórek nowotworowych wprowadza się rAAV kodujące białko enzymatyczne przekształcające nieaktywną formę
leku (prolek) w postać toksyczną dla komórek. W pracach
wskazuje się również, iż zasięg oddziaływania toksycznego
metabolitu jest szerszy niż wynikający z wydajności infekcji
komórek, z uwagi na efekt oddziaływania międzykomórko-
&ARM0RZEGL.AUK
wego (ang. bystander effect) [5]. Najczęściej stosowanym
genem samobójczym jest gen kodujący enzym kinazę tymidynową wirusa opryszczki pospolitej (HSVtk). Jej działanie
w intensywnie dzielących się komórkach nowotworu polega
na fosforylacji nukleozydowych analogów tymidyny, (np.
gancyklowir; acyklowir). Ufosforylowane postaci leków są
inhibitorami polimerazy DNA. Giną komórki, do których
wprowadzony został transgen i zaszła jego ekspresja, jak
oraz komórki, do których toksyczny metabolit dostał się połączeniami międzykomórkowymi. Badania z użyciem AAVHSVtk, w połączeniu z gancyklowirem przeprowadzono np.
na komórkach nowotworów głowy i szyi [6], piersi [7], skóry [8]. W doświadczeniach Su i wsp. [9] mysie komórki raka
wątroby transdukowano wektorem rAAV/HSVtk, pod kontrolą wątrobowo-specyficznego promotora (dla albuminy)
oraz specyficznego dla nowotworu elementu wzmacniającego (dla α-fetoproteiny) [9]. Po podaniu gancykloviru wykazano, że tylko komórki raka wątroby, które wykazywały odczyn dodatni względem obecności albumin i α-fetoproteiny,
uległy zniszczeniu. Podobne badania, jednak na komórkach
raka jajnika, przeprowadzili również Bao i wsp. [10].
Geny proapoptotyczne W terapii genowej nowotworów
wykorzystuje się również geny kodujące białka apoptozy.
W pracy Rohr i wsp. [11] konstrukt rAAV/p53 wprowadzano do komórek niedrobnokomórkowego raka płuca Wraz
ze zwiększającą się dawką preparatu rAAV, obserwowano
zahamowanie wzrostu nowotworu w porównaniu z komórkami transdukowanymi wektorem kontrolnym rAAV/
GFP. Redukcję masy nowotworu wiązano ze zwiększonym
poziomem apoptozy, a jednoczesne podawanie cisplatyny,
wykazało synergistyczny efekt. W innych badaniach wykazano natomiast wydłużenie czasu przeżycia myszy z rakiem
jelita grubego po podaniu „koktajlu terapeutycznego” niosącego jednocześnie gen p53 (Ad- p53) oraz gen kodujący
domenę kringle 1 ludzkiego wątrobowego czynnika wzrostu
(HGFK1) [12]. Zhang i wsp. [13] skonstruowali natomiast
wektor niosący gen TRAIL, będący pod kontrolą promotora dla ludzkiej telomerazy, który wydajnie transdukował
komórki raka wątroby, indukując w nich proces apoptozy. Przeciwnowotworowy efekt wzmocniony był równoległą ekspozycją komórek nowotworowych na działanie
5-fluorouracylu. Podobne doświadczenia z użyciem rAAVTRAIL wykonał Wang i wsp. [14].
Geny antyangiogenne Jedną ze strategii terapii genowej
nowotworów jest antyangiogeneza, czyli próby ograniczania
wzrostu i funkcji naczyń krwionośnych nowotworów. Ma
i wsp. [15] prowadzili badania na komórkach glejaka zaszczepionych szczurom. Doguzowo podawano preparat rAAV
kodujący angiostatynę. Wykazano zahamowanie wzrostu
nowotworu i wydłużenie czasu przeżycia 40% szczurów,
w porównaniu z grupą kontrolną, która otrzymywała preparat rAAV bez genu terapeutycznego. Shi i wsp. [16] zaproponowali użycie rAAV niosące gen endostatyny w badaniach
nad rakiem jelita grubego. Doswidczenia wykonano in vitro,
jak i in vivo. rAAV-endostatyna podawano zwierzętom domięśniowo. Obserwowano wysoki poziom rekombinowanej
endostatyny w surowicy i zahamowanie indukowanej przez
nowotwór angiogenezy, a w konsekwencji ograniczenie
wzrostu guza jelita grubego. Interesujące wyniki opublikowali również Ponnazhagan i wsp. [17]. Autorzy obserwowali ograniczenie wzrostu nowotworu jajnika u myszy, którym
domięśniowo podano preparat bicistronowy rAAV niosący
geny angiostatyny oraz endostatyny jednocześnie.
Geny immunotropowe Wiadomym jest, iż nowotwory posiadają niezwykłą właściwość ucieczki spod nadzoru
układu immunologicznego organizmu. Podejmowanych jest
wiele badań mających na celu stymulację układu odpornościowego do walki z nowotworem np. poprzez dostarczanie
do komórek guza za pomocą wektorów rAAV genów cytokin, które ulegając ekspresji pobudzają komórki prezentujące antygeny oraz limfocyty T cytotoksyczne [18]. Do grupy wykorzystywanych cytokin należą również interferony.
W pracy Zhang i wsp. [19] komórki różnych linii nowotworowych transdukowano konstruktem rAAV niosącym gen
syntetycznego interferonu oraz bakteryjny gen oporności na
neomycynę (rAAV-IFN-conI-Neo). Obserwowano brak różnic we wzroście w porównaniu z komórkami niestransdukowanymi. Pomimo odporności tych komórek na działanie
IFN in vitro, po przeniesieniu stransdukowanych komórek
do zwierząt, guzy wzrastały wolniej niż u zwierząt z komórkami nietransdukowanymi W pracy Hammer i wsp. [20]
natomiast do transdukcji komórek raka mózgu zastosowano
rAAV z genem dla interferonu β (rAAV-IFN β) oraz trichostatynę (inhibitor deacetylazy histonów o działaniu przeciwnowotworowym). Autorzy opisali, iż w wyniku zastosowania rAAV/INF i trichostatyny wzrost guzów mózbu był
ograniczony. W pracy zaś Devchand i wsp. [21] do transdukcji komórek guzów nowotworowych wykorzystano wektor
rAAV kodujący interleukinę 12 (IL12). Wykazano, zależny
od ekspresji IL12 wzrost syntezy interferonu γ i wzmożoną
proliferację limfocytów, [21]. W badaniach poświęconych
terapii genowej nowotworów i genom immunotropowym
wykorzystywane sa również komórki dendrytyczne transdukowanie za pomocą wektorów rAAV. W pracy Liu i wsp.
[22] do komórek dendrytycznych, w przebiegu raka piersi,
wprowadzane były wektory rAAV kodujące błonową glikoproteinę - laktadherynę (BA46). Wprowadzenie do komórek
dendrytycznych AAV/BA46/Neo zaowocowało ekspresją
laktadheryny, szybką odpowiedzią limfocytów cytotoksycznych
na MHC kl.I prezentujące BA46, pobudzeniem limfocytów T do
produkcji IFN-γ oraz ekspresją dodatkowych antygenów na powierzchni komórek dendrytycznych (CD80, CD86).
|J˜¥u|ª-ylR
Preparaty genowe konstruowane w oparciu o genom
niepatogennych wirusów związanych z adenowirusami
(AAV) wykorzystywane są obecnie w badaniach eksperymentalnych, zaś pierwsze próby kliniczne przeprowadzono
u chorych na nowotwory skóry i prostaty. Obecność rAAV
w laboratoriach i klinikach wynika bezpośrednio z faktów, iż
naukowcy potrafią konstruować i namnażać rAAV in vitro,
a uzyskane preparaty zawierają aktywne biologicznie cząstki wirusowe, które są dla pacjentów bezpieczne i wprowadzają wybrane geny terapeutyczne do komórek nowotworowych. Obecność rekombinowanych wektorów wirusowych
AAV w badaniach odzwierciedla postęp w terapii chorych
na nowotwory.
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
Piśmiennictwo
1. www.wiley.co.uk/genmed
2. Małecki M, Woźniak A, Janik P. Wirusy związane z adenowirusami (AAV). Postępy Biochem 2008; 54: 57-63.
3. Małecki M. Wirusowe strategie w terapii genowej ze
szczególnym uwzględnieniem wektorów konstruowanych z wirusów związanych z adenowirusami (AAV).
Postępy Biol. Kom 2004; 31: 47-57.
4. Farmakopea Europejska 2006.
5. Stribbling SM i wsp.: Regressions of established breast
cancer xenografts by carboxypeptidase G2 suicide gene
therapy and the prodrug CMDA are due to a bystander
effect. Hum. Gene Ther 2000; 11: 285-92.
6. Kanazawa T i wsp.: Suicide gene therapy using AAVHSVtk/ganciclovir in combination with irradiation results in regression of human head and neck cancer xenorafts in nude mice. Gene Ther 2003; 10: 51-58.
7. Li ZB i wsp.: Recombinant AAV-mediated HSVtk gene
transfer with direct intratumoral injections and Tet-On
regulation for implanted human breast cancer. BMC
Cancer 2006; 6: 66.
8. Schoensiegel F i wsp.: MIA (melanoma inhibitory activity) promoter mediated tissue-specific suicide gene therapy of malignant melanoma. Cancer Gene Ther 2004;
11: 408-18.
9. Su H i wsp.: Selective-killing of AFP-positive hepatocellular carcinoma cells by adeno-associated virus transfer
of the herpes simplex virus thymidine kinase gene. Hum.
Gene Ther 1996; 7: 463-70.
10. Bao R, Selvakumaran M, Hamilton TC. Targeted Gene
Therapy of Ovarian Cancer Using an Ovarian-specific
Promoter. Gyn. Oncol 2002; 84: 228-34.
11. Rohr UP i wsp.: Non-small lung cancer are prime targets for p53 gene transfer mediated by a recombinant
adeno-associated virus type-2 vector Cancer Gene Ther
2003;10: 898-906.
12. Nie B i wsp.: AAV-HGFK1 and Ad-p53 cocktail therapy
prolongs survival of mice with colon cancer. Mol. Cancer Ther 2008;7: 2855-65.
13. Zhang Y i wsp.: AAV-mediated TRAIL gene expression driven by hTERT promoter suppressed human
hepatocellular carcinoma growth in mice. Life Science
2008;82: 1154-61.
14. Samulski RJ i wsp.: Targeted integration of adeno-associated virus (AAV) into human chromosome 19. EMBO
1991; 10: 3941-50.
15. Ma HI i wsp.: Intratumoral gene therapy of malignant
brain tumor in a rat model with angiostatin delivered by
adeno-associated viral (AAV) vector. Gene Ther 2002;
9: 2-11.
16. Shi W i wsp.: Adeno-associated virus-mediated gene
transfer of endostatin inhibits angiogenesis and tumor
growth in vivo. Cancer Gene Ther 2002; 9: 513-21.
17. Ponnazhagan S i wsp.:
Adeno-Associated Virus
2-Mediated Antiangiogenic Cancer Gene Therapy:
Long-Term Efficacy of a Vector Encoding Angiostatin
and Endostatin over Vectors Encoding a Single Factor.
Cancer Res 2004; 64: 1781-7.
18. Anderson R i wsp.: Construction and biological characterization of an interleukin-12 fusion protein (Flexi-12): delivery to acute myeloid leukemic blasts
using adeno-associated virus. Hum. Gene Ther 1997;
8: 1125-35.
19. Zhang JF i wsp.: Gene therapy with an adeno-associated
virus carrying an interferon gene results in tumor growth
suppression and regression. Cancer Gene Ther 1996; 3:
31-8.
20. Hmner JB i wsp.: The efficacy of combination therapy
using adeno-associated virus-interferon beta and trichostatin A in vitro and in a murine model of neuroblastoma.
J Ped. Sur 2008; 43: 177-83.
21. Paul D i wsp.: Construction of a recombinant adeno-associated virus (rAAV) vector expressing murine interleukin-12 (IL-12) Ther. 2000. 7, s. 308-315.
22. Liu Y i wsp.: Use and specificity of breast cancer antigen/milk protein BA46 for generating anti-self-cytotoxic
T lymphocytes by recombinant adeno-associated virusbased gene loading of dendritic cells. Cancer Gene Ther
2005; 12: 304-12.
Adres do korespondencji:
doc. dr hab. n. med. Maciej Małecki
Zakład Biologii Komórki
Centrum Onkologii-Instytut im. M. Skłodowskiej-Curie
ul. Roentgena 5, 02-781 Warszawa
tel. 022 546 26 20
[email protected]