Metaloproteinazy macierzy pozakomórkowej i ich tkankowe

290
K. Musiał, I. Makulska, D. Zwolińska
Metaloproteinazy macierzy pozakomórkowej i ich
tkankowe inhibitory u dzieci i młodych dorosłych
przewlekle hemodializowanych – doniesienie wstępne
KINGA MUSIAŁ, IRENA MAKULSKA I DANUTA ZWOLIŃSKA
Katedra i Klinika Nefrologii Pediatrycznej Akademii Medycznej im. Piastów Śląskich we Wrocławiu, kierownik: prof. dr hab. med. D. Zwolińska
Metaloproteinazy macierzy pozakomórkowej i ich tkankowe
inhibitory u dzieci i młodych dorosłych przewlekle
hemodializowanych – doniesienie wstępne
Matrix metalloproteinases and their tissue inhibitors
in children and young adults on chronic hemodialysis
– preliminary results
Musiał K., Makulska I., Zwolińska D.
Musiał K., Makulska I., Zwolińska D.
Katedra i Klinika Nefrologii Pediatrycznej Akademii Medycznej im.
Piastów Śląskich we Wrocławiu
Chair and Department of Pediatric Nephrology of Medical University
of Wrocław
Enzymy proteolityczne (MMPs i TIMPs) mogą odgrywać zasadniczą rolę w przebudowie naczyń i procesach miażdżycowych, ale dane
dotyczące takich zależności u pacjentów przewlekle hemodializowanych są skąpe.
Celem pracy była ocena stężeń wybranych metaloproteinaz i ich
tkankowych inhibitorów u pacjentów dializowanych z użyciem błon
polisulfonowych.
Materiał i metody. Badaniami objęto 11 dzieci i młodych dorosłych
przewlekle hemodializowanych. Grupę kontrolną stanowiło 15 dzieci z prawidłową funkcją nerek. U wszystkich badanych oznaczono w
surowicach stężenia MMP-2, MMP-9, TIMP-1 i TIMP-2 z zastosowaniem metody ELISA.
Wyniki. Mediany wartości wszystkich MMPs i TIMPs były podwyższone przed zabiegiem HD w porównaniu z grupą kontrolną
(p<0.0001) i uległy obniżeniu po pojedynczej sesji (p<0.01), jednak
pozostały wyższe niż w grupie kontrolnej (p<0.001). Wartości wskaźnika MMP-2/TIMP-2 były mniejsze niż w grupie kontrolnej zarówno
przed, jak i po sesji HD (p<0.0001), w przeciwieństwie do wskaźnika MMP-9/TIMP-1, który przed HD był wyższy, a po HD – niższy niż
wśród pacjentów z grupy kontrolnej (p<0.05; p<0.01).
Wnioski. Podwyższone stężenia wszystkich badanych parametrów
mogą wskazywać na wzmożoną aktywność procesów proteolitycznych u pacjentów hemodializowanych. Pojedyncza sesja HD z użyciem błon polisulfonowych wydaje się pogłębiać dysfunkcję układu
MMPs/TIMPs, choć efekt ten jest prawdopodobnie przejściowy.
The proteolytic system of MMPs and TIMPs may play an essential
role in vascular remodeling and atherosclerosis, but the data concerning such influence in the patients on chronic hemodialysis are
scarce.
The aim of the study was to assess the concentrations of selected
MMPs and their inhibitors in the patients hemodialyzed on the polysulfone membranes.
Material and methods. 11 children and young adults on chronic HD
were enrolled in the study, 15 age-matched subjects with normal
kidney function served as controls. The serum concentrations of
MMP-2, MMP-9, TIMP-1 and TIMP-2 were assessed by ELISA.
Results. The median values of all MMPs and TIMPs were elevated
in patients before HD vs. controls (p<0.0001) and decreased after a
single HD session (p<0.01), yet remained higher than in the control
group (p<0.001). The MMP-2/TIMP-2 ratio was decreased vs. controls both before and after a HD session (p<0.0001). Contrarily, the
MMP-9/TIMP-1 ratio before HD was higher than in controls (p<0.05),
but after HD dropped to the values lower than those in the control
subjects (p<0.01).
Conclusions. The increased concentrations of all parameters may
indicate the proteolytic overactivity in the examined population. A
single polysulfone HD session tends to deepen the MMPs/TIMPs
dysfunction, although this impact seems transient.
Słowa kluczowe: enzymy proteolityczne, remodeling naczyń,
miażdżyca, przewlekła choroba nerek
Key words: proteolytic enzymes, vascular remodeling, atherosclerosis, chronic kidney disease
Pol. Merk. Lek., 2009, XXVI, 154, 290
Pol. Merk. Lek., 2009, XXVI, 154, 290
Współczesne poglądy na temat patogenezy miażdżycy
podkreślają rolę dysfunkcji śródbłonka jako czynnika sprzyjającego rozwojowi blaszki miażdżycowej [7, 9]. Najnowsze doniesienia wskazują na rolę metaloproteinaz macierzy pozakomórkowej (matrix metalloproteinases – MMPs)
w patogenezie zmian miażdżycowych [3, 4, 6]. Enzymy te
posiadają zdolność proteolizy składników zarówno macierzy, jak i błon podstawnych [5]. MMPs odpowiadają za przebudowę tkanek i angiogenezę, ale biorą także udział w
remodelingu ścian naczyń krwionośnych i mięśnia sercowego [10]. Aktywność proteolityczna MMPs podlega ścisłej regulacji za pomocą endogennych tkankowych inhibitorów (tissue inhibitors of matrix metalloproteinases –
TIMPs), specyficznych dla poszczególnych typów MMPs
[10]. Zachwianie równowagi w układzie MMPs/TIMPs prowadzi do nasilonej proteolizy i destrukcji śródbłonka lub
do kumulacji składników macierzy z następową przebudo-
wą jej struktury, co może stanowić dodatkowy czynnik ryzyka rozwoju miażdżycy.
U chorych ze schyłkową niewydolnością nerek rozwój zmian
miażdżycowych jest dobrze udokumentowany, niewiele jednak
wiadomo na temat potencjalnego wpływu funkcji MMPs i TIMPs
na ich progresję u tych pacjentów. W pojedynczych pracach
wykazano wysokie miana MMP-2, TIMP-1 i TIMP-2 u dorosłych
hemodializowanych [11]. Przyspieszony rozwój zmian miażdżycowych charakteryzuje również dzieci z PChN [8], brak jest
natomiast doniesień na temat wpływu metaloproteinaz i ich inhibitorów na przebieg aterogenezy w tej populacji.
Celem pracy była ocena roli wybranych enzymów proteolitycznych (MMP-2, MMP-9) i ich tkankowych inhibitorów
(TIMP-1, TIMP-2) u dzieci i młodych dorosłych przewlekle
hemodializowanych jako potencjalnych markerów zmian
miażdżycowych i analiza wpływu pojedynczego zabiegu HD
na powyższe parametry.
Metaloproteinazy macierzy pozakomórkowej i ich tkankowe inhibitory u dzieci i młodych dorosłych
291
MATERIAŁ I METODY
380
360
340
MMP-2 [ng/ml]
Badaniami objęto 11 dzieci i młodych dorosłych (5 dziewczynek i 6 chłopców) w wieku 6 - 19 lat (mediana 14 lat) z przewlekłą chorobą nerek hemodializowanych w Klinice Nefrologii Pediatrycznej Akademii Medycznej we Wrocławiu. Wśród
przyczyn niewydolności nerek wyróżniono: przewlekłe odmiedniczkowe zapalenie nerek (6), przewlekłe kłębuszkowe
zapalenie nerek (4) i wrodzony zespół nerczycowy (1). Grupę kontrolną stanowiło 15 dzieci w wieku 3 - 17 lat (mediana
11 lat), diagnozowanych w Klinice z powodu moczenia nocnego i kamicy układu moczowego, z prawidłową funkcją nerek. U żadnego z pacjentów nie stwierdzono stanu zapalnego, żadne dziecko nie otrzymywało antybiotyków ani leków
immunosupresyjnych.
Krew pobierano bezpośrednio przed i po zabiegu hemodializy. Po wykrzepnięciu w temperaturze pokojowej (przez
co najmniej 30 minut) wirowano materiał (1000 g przez 10
minut), a uzyskaną surowicę przechowywano w temp. -20°C.
Stężenia MMP-2, MMP-9, TIMP-1 i TIMP-2 zostały oznaczone testem ELISA przy użyciu komercyjnych zestawów (R&D
Systems).
Dane dotyczące poszczególnych parametrów podano w
postaci mediany, dolnego i górnego kwartyla. Analizę statystyczną wykonano przy użyciu testów nieparametrycznych
(U Manna-Whitney’a, Wilcoxona) z wykorzystaniem pakietu
Statistica 8.0 (StatSoft). W badaniach korelacyjnych wykorzystano współczynnik korelacji rang Spearmana. Za wartość istotną statystycznie przyjęto p<0.05.
320
300
280
260
240
p < 0.005
220
200
180
przed HD / before HD
po HD / after HD
mediana/median
25%-75%
min-maks/min-max
Ryc. 1. Stenia MMP-2 u pacjentów hemodializowanych
Fig. 1. MMP-2 concentrations in patients on hemodialysis
1000
900
WYNIKI
Mediany stężeń MMP-2, MMP-9, TIMP-1 i TIMP-2 u chorych
hemodializowanych przed sesją na dializatorach polisulfonowych były wyższe od obserwowanych w grupie kontrolnej
(tab. 1). Po zabiegu HD wszystkie wartości uległy obniżeniu
(ryc. 1-4), jednak pozostały wyższe niż w grupie kontrolnej
(p<0.001).
Wskaźnik MMP-9/TIMP-1 wykazywał przed HD wartości
wyższe, a po zabiegu - niższe niż w grupie kontrolnej (p<0.05;
p<0.01). Wartość tego współczynnika po HD uległa obniżeniu w stosunku do wartości sprzed zabiegu (ryc. 5).
Wskaźnik MMP-2/TIMP-2 przybierał wartości mniejsze od
obserwowanych w grupie kontrolnej zarówno przed, jak i po
sesji HD (p<0.0001). Sam zabieg pozostał bez wpływu na
wartość MMP-2/TIMP-2 (ryc. 6).
Tabela 1. Mediany i kwartyle stężeń poszczególnych parametrów w badanych grupach
Table 1. The median values and interquartile ranges of selected parameters in the examined groups
Parametr / Mediana
Median
(dolny – górny
kwartyl)
(lower – upper
quartile)
Grupa kontrolna Pacjenci HD
Control group
HD patients
n = 15
n = 11
Test
MannaWhitney’a
MMP9 [ng/ml]
98.5
(95.4 - 100.8)
759.8
(737.2 - 775.7)
p=0.00
MMP2 [ng/ml]
116.3
(114.5 - 117.8)
351.9
(329.1 - 356.1)
p=0.00
TIMP1 [ng/ml]
60.2
(54.8 - 72.4)
427.5
(402.2 - 451.6)
p=0.00
TIMP2 [ng/ml]
39.5
(38.7 - 41.7)
252.6
(249.3 - 259.5)
p=0.00
wskaźnik
MMP9/TIMP1
/MMP9/TIMP1 ratio
1.6
(1.4 - 1.8)
1.8
(1.7 - 2.0)
p=0.03
wskaźnik
MMP2/TIMP2
/MMP2/TIMP2 ratio
2.9
(2.7 - 3.1)
1.4
(1.3 - 1.4)
p=0.00
MMP-9 [ng/ml]
800
700
600
500
400
300
p < 0.005
200
100
przed HD / before HD
po HD / after HD
mediana/median
25%-75%
min-maks/min-max
Ryc. 2. Stenia MMP-9 u pacjentów hemodializowanych
Fig. 2. MMP-9 concentrations in patients on hemodialysis
OMÓWIENIE
Nasze badania wykazały po raz pierwszy zwiększone stężenia metaloproteinaz i ich tkankowych inhibitorów u dzieci i
młodych dorosłych przewlekle hemodializowanych oraz znaczący wpływ pojedynczego zabiegu HD na ich wartości w
krwi obwodowej.
Żelatynazy (gelatinases) to MMPs charakterystyczne
głównie dla układu naczyniowego i mięśnia sercowego. Prowadzone dotychczas badania ujawniły obecność podwyższonych stężeń MMP-2 w surowicach pacjentów z ostrym
niedokrwieniem mięśnia sercowego oraz u dzieci z niedoborem hormonu wzrostu i otyłością [2, 12, 13]. Zwiększone
stężenia MMP-9 obserwowano u chorych z zaawansowanymi zmianami w obrębie naczyń, ostrymi incydentami wieńcowymi i z rodzinną hipercholesterolemią [1, 15]. Wykazano także bezpośredni związek między stresem oksydacyjnym a aktywnością MMP-2 i MMP-9 [14, 16]. Podobnie jak
292
K. Musiał, I. Makulska, D. Zwolińska
2,2
550
500
2,0
TIMP-1 [ng/ml]
450
400
1,8
350
1,6
p < 0.005
300
1,4
250
200
p < 0.005
1,2
150
1,0
przed HD / before HD
100
przed HD / before HD
po HD / after HD
po HD / after HD
mediana/median
mediana/median
25%-75%
min-maks/min-max
25%-75%
min-maks/min-max
Ryc. 3. Stenia TIMP-1 u pacjentów hemodializowanych
Fig. 3. TIMP-1 concentrations in patients on hemodialysis
280
260
TIMP-2 [ng/ml]
240
220
200
180
p < 0.005
160
140
120
przed HD / before HD
Ryc. 5. Wskanik MMP-9/TIMP-1 u pacjentów hemodializowanych
Fig. 5. MMP-9/TIMP-1 ratio in patients on hemodialysis
1,48
1,46
1,44
1,42
1,40
1,38
1,36
1,34
1,32
1,30
1,28
1,26
1,24
1,22
p = 0.39
przed HD / before HD
po HD / after HD
po HD / after HD
mediana/median
25%-75%
min-maks/min-max
Ryc. 4. Stenia TIMP-2 u pacjentów hemodializowanych
Fig. 4. TIMP-2 concentrations in patients on hemodialysis
w badanej przez nas populacji, zwiększenie stężeń MMP-2
we krwi obserwowano także u dorosłych pacjentów hemodializowanych [11]. Wśród prac dotyczących roli MMPs w
aterogenezie dominują doświadczenia na zwierzętach. U
myszy pozbawionych genu dla MMP-9 (MMP-9-/-) blaszki
miażdżycowe były większe i liczniejsze niż w grupie kontrolnej zdrowych zwierząt [4], co wydaje się potwierdzać
ochronną rolę żelatynazy B. Natomiast u osobników pozbawionych genu kodującego MMP-2 (MMP-2-/-) obserwowano mniejsze nasilenie powyższych zmian [6], co sugeruje
proaterogenną rolę MMP-2.
W świetle powyższych doniesień zwiększone stężenia
MMP-2 i MMP-9 w naszej grupie badanych mogą być nie
tylko skutkiem działania czynników aterogennych, takich jak
dyslipidemia, nadciśnienie, nadwaga, wzmożony stres oksydacyjny czy stan zapalny, ale także mechanizmem obronnym mającym zapobiegać niekorzystnym wpływom powyższych zaburzeń na tworzenie zmian miażdżycowych.
mediana/median
25%-75%
min-maks/min-max
Ryc. 6. Wskanik MMP-2/TIMP-2 u pacjentów hemodializowanych
Fig. 6. MMP-2/TIMP-2 ratio in patients on hemodialysis
Zaobserwowane u naszych pacjentów zwiększenie stężeń TIMP-1 i TIMP-2 jest zgodne z wcześniejszymi doniesieniami dotyczącymi dorosłych hemodializowanych [11].
Ochronną rolę TIMP-2 w zapobieganiu progresji zmian
miażdżycowych udowodniono w badaniach in vitro, podczas
gdy TIMP-1 w powyższym eksperymencie nie miało wpływu
na tworzenie i destabilizację blaszek miażdżycowych [3].
Ze względu na zróżnicowanie ról poszczególnych MMPs
i TIMPs zdecydowaliśmy się na analizę współczynników oceniających zależności między metaloproteinazami a ich specyficznymi inhibitorami. Wskaźnik MMP-9/TIMP-1 u pacjentów HD był wyższy niż w grupie kontrolnej, co może wynikać
z proporcjonalnie większego wzrostu stężeń MMP-9 (8-krotny w porównaniu z grupą kontrolną) niż TIMP-1 (7-krotny).
Analogicznie, obniżone wartości ilorazu MMP-2/TIMP-2 u
dzieci hemodializowanych są wynikiem dysproporcji między
3-krotnym zwiększeniem wartości MMP-2, a ponad 6-krotnym zwiększeniem stężeń w przypadku TIMP-2. Powyższe
Metaloproteinazy macierzy pozakomórkowej i ich tkankowe inhibitory u dzieci i młodych dorosłych
wyniki świadczą o pobudzeniu aktywności proteolitycznej
wszystkich składowych układu żelatynazy-inhibitory u dzieci
hemodializowanych, ze szczególnym naciskiem na czynniki
anty-aterogenne (MMP-9 i TIMP-2).
Wpływ pojedynczego zabiegu hemodializy na poszczególne parametry był również zróżnicowany, ponieważ obniżeniu uległy stężenia zarówno protekcyjnych, jak i destrukcyjnych składowych sieci MMP/TIMP. Największe zmniejszenie zaobserwowano w przypadku MMP-9 (4.5-krotne), co
wpłynęło na obniżenie wskaźnika MMP-9/TIMP-1 po zabiegu HD do wartości niższych niż w grupie kontrolnej i może
świadczyć o negatywnym wpływie pojedynczej sesji na mechanizmy zapobiegające tworzeniu zmian miażdżycowych.
W przypadku MMP-2/TIMP-2, obniżenie poszczególnych
składowych było proporcjonalne i wartości wskaźnika były
niższe niż w grupie kontrolnej zarówno przed, jak i po zabiegu hemodializy. Sugeruje to ponownie przewagę czynników
ochronnych (TIMP-2) nad nasilającymi aterogenezę (MMP2) w tej grupie chorych. Można więc wysnuć przypuszczenie, że w przypadku MMPs i TIMPs u dzieci i młodych dorosłych przewlekle hemodializowanych, dochodzi do pobudzenia czynników pro- i anty-aterogennych, z przewagą tych
ostatnich, a sesja HD tylko przejściowo destabilizuje powyższy układ.
WNIOSKI
Podwyższone stężenia MMP-2, MMP-9, TIMP-1 i TIMP-2 są
wyrazem wzmożonej aktywności procesów proteolitycznych
u pacjentów hemodializowanych. Pojedyncza sesja HD z
użyciem błon polisulfonowych wydaje się pogłębiać dysfunkcję układu MMPs/TIMPs, choć efekt ten jest prawdopodobnie przejściowy.
PIŚMIENNICTWO
1. El Messal M., Beaudeux J.L., Drissi A. i wsp.: Elevated serum levels of
proinflammatory cytokines and biomarkers of matrix remodeling in never-treated patients with familial hypercholesterolemia. Clin. Chim. Acta,
2006; 366: 185-189.
293
2. Głowińska-Olszewska B., Urban M., Florys B.: Ocena stężenia wybranych metaloproteinaz macierzy zewnątrzkomórkowej (MMP-2, MMP-9) u
dzieci i młodzieży z otyłością prostą. Endokrynol. Diabetol. Chor. Przemiany Materii Wieku Rozw., 2006; 12: 179-183.
3. Johnson J.L., Baker A.H., Oka K. i wsp.: Suppression of atherosclerotic
plaque progression and instability by tissue inhibitor of metalloproteinase-2. Involvement of macrophage migration and apoptosis. Circulation,
2006; 113: 2435-2444.
4. Johnson J.L., George S.J., Newby A.C. i wsp.: Divergent effects of matrix
metalloproteinases 3, 7, 9 and 12 on atherosclerotic plaque stability in
mouse brachiocephalic arteries. PNAS, 2005; 102: 15575-15580.
5. Johnson T.S., Haylor J.L., Thomas G.L. i wsp.: Matrix metalloproteinases
and their inhibitors in experimental renal scarring. Exp. Nephrol., 2002;
10: 182-195.
6. Kuzuya M., Nakamura K., Sasaki T. i wsp.: Effect of MMP-2 deficiency on
atherosclerotic lesion formation in apoE-deficient mice. Arterioscler.
Thromb. Vasc. Biol., 2006; 26: 1120-1125.
7. Libby P., Ridker P.M., Maseri A.: Inflammation and atherosclerosis. Circulation, 2001;105:1135-1143.
8. Mitsnefes M.M.: Cardiovascular disease in children with chronic kidney
disease. Adv. Chronic Kidney Dis., 2005; 12: 397-405.
9. Musiał K., Zwolińska D.: Adhesion molecules, cytokines and endothelial
dysfunction in atherosclerosis. Adv Clin. Exp. Med., 2006; 15: 971-978.
10. Newby A.C.: Matrix metalloproteinases regulate migration, proliferation,
and death of vascular smooth muscle cells by degrading matrix and nonmatrix substrates. Cardiovasc. Res., 2006; 69: 614-624.
11. Pawlak K., Pawlak D., Myśliwiec M.: Serum matrix metalloproteinase-2
and increased oxidative stress are associated with carotid atherosclerosis in hemodialyzed patients. Atherosclerosis, 2007; 190: 199-204.
12. Schmidt R., Bultmann A., Ungerer M. i wsp.: Extracellular matrix metalloproteinase inducer regulates matrix metalloproteinase activity in cardiovascular cells. Implications in acute myocardial infarction. Circulation,
2006; 113: 834-841.
13. Szczepańska-Kostro J., Kowalewski M., Urban M. i wsp.: Ocena stężenia
metaloproteinazy macierzy pozakomórkowej 2 (MMP-2), metaloproteinazy
macierzy pozakomórkowej 9 (MMP-9) i tkankowego inhibitora metaloproteinazy 2 (TIMP-2) u dzieci i młodzieży z niedoborem hormonu wzrostu. Endokrynol. Diabetol. Chor. Przemiany Materii Wieku Rozw., 2006; 12: 257-260.
14. Valentin F., Bueb J.L., Kieffer P. i wsp.: Oxidative stress activates MMP-2
in cultured human coronary smooth muscle cells. Fundam. Clin. Pharmacol., 2005; 19: 661-667.
15. Webb C.S., Bonnema D.D., Ahmed S.H. i wsp.: Specific temporal profile of
matrix metalloproteinase release occurs in patients after myocardial infarction: relation to left ventricular remodeling. Circulation, 2006; 114: 1020-1027.
16. Zalba G., Fortuno A., Orbe J. i wsp.: Phagocytic NADPH oxidase-dependent
superoxide production stimulates matrix metalloproteinase-9: implications for
human atherosclerosis. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 2007; 27: 587-593.
Adres do korespondencji:
Dr med. Kinga Musiał, Katedra i Klinika Nefrologii Pediatrycznej Akademii Medycznej im. Piastów Śląskich we Wrocławiu, 50-369 Wrocław, ul. Marii Skłodowskiej-Curie 50/52, tel. 071 733 13 50, e-mail: [email protected]