(Dako Autostainer/Autostainer Plus) Nr kat. IS524
Transkrypt
(Dako Autostainer/Autostainer Plus) Nr kat. IS524
FLEX Polyclonal Rabbit Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Ready-to-Use (Dako Autostainer/Autostainer Plus) Nr kat. IS524 Przeznaczenie Do badań diagnostycznych in vitro. Przeciwciało FLEX Polyclonal Rabbit Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein, Ready-to-Use (Dako Autostainer/Autostainer Plus) jest przeznaczone do stosowania w immunohistochemii w aparatach Dako Autostainer/Autostainer Plus. Kwaśne białko włókienkowe gleju (Glial fibrillary acidic protein, GFAP) jest głównym filamentem pośrednim dojrzałych astrocytów (1), a przeciwciało to przydatne jest w identyfikacji astrocytów w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) w warunkach prawidłowych i patologicznych (2 – 4). Interpretacja kliniczna wystąpienia lub braku barwienia musi być uzupełniona przez badania morfologiczne z wykorzystaniem odpowiednich prób kontrolnych i powinna być przeprowadzana przez doświadczonego patologa z uwzględnieniem historii choroby pacjenta i innych badań diagnostycznych. Podsumowanie i wyjaśnienie GFAP to cytopazmatyczne białko filamentowe o masie 50 kDa tworzące część cytoszkieletu w astrocytach, które okazało się najbardziej swoistym znacznikiem komórek pochodzenia astrocytarnego. W centralnej domenie pałeczkowej białko GFAP wykazuje znaczącą homologię strukturalną z innymi filamentami pośrednimi (5). W zakresie funkcji uwaŜa się, Ŝe GFAP jest waŜne dla ruchomości i kształtu przez zapewnienie stabilności strukturalnej procesu astrocytarnego (1). Na skutek urazu ludzkiego OUN wywołanego obraŜeniami, zaburzeniami genetycznymi lub środkami chemicznymi astrocyty proliferują i wykazują rozległą hipertrofię masy komórkowej i procesów, przy znaczącym zwiększeniu produkcji GFAP. W przeciwieństwie, ze wzrostem złośliwości astrocytów wiąŜe się postępujący spadek produkcji GFAP. Tym samym złośliwe gwiaździaki posiadają mniej komórek nowotworowych o dodatnim, intensywnym odczynie dla GFAP niŜ mniej złośliwe gwiaździaki i preparaty prawidłowej tkanki mózgowej (5). Poza OUN czułe metody detekcji mogą wykazać obecność GFAP w komórkach Schwanna, komórkach gleju jelitowego, nowotworach ślinianek i przerzutowych rakach nerek. Ponaddo immunoreaktywność GFAP wykazano w chrząsce nagłośni, komórkach przysakdki, niedojrzałych oligodendrocytach, oponiakach brodawkowatych (1) i komórkach mięśniowo-nabłonkowych piersi (6). Patrz dokument Ogólne instrukcje wykonywania odczynów immunohistochemicznych firmy Dako lub następujące części instrukcji do systemu detekcji IHC: 1) Zasady procedury, 2) Niezbędne materiały niedostarczone z zestawem, 3) Przechowywanie, 4) Przygotowanie preparatu, 5) Wykonanie odczynu, 6) Kontrola jakości, 7) Rozwiązywanie problemów, 8) Interpretacja wyniku odczynu, 9) Ograniczenia metody. Odczynnik dostarczony Gotowe do uŜycia poliklonalne przeciwciało królicze dostarczane w postaci płynnej w buforze zawierającym białko stabilizujące i azydek sodu o stęŜeniu 0,015 mol/L. Immunogen GFAP izolowane z rdzenia kręgowego krowy. Swoistość Przeciwciało było poddawane absorpcji w fazie stałej z białkami surowicy ludzkiej i wołowej. W immunoelektroforezie krzyŜowej z uŜyciem 50 µL stęŜonego przeciwciała na cm2 powierzchni Ŝelu nie zaobserwowano reakcji z 2 µL osocza ludzkiego i 2 µL surowicy krowiej. Przeciwciało wykazuje jeden wyraźny precypitat (GFAP) z ekstraktem krowiego mózgu. Barwnik: Coomassie Brilliant Blue. W testach wykonywanych pośrednią metodą ELISA nie obserwuje się reakcji z ludzkim osoczem ani surowicą wołową. Środki ostroŜności 1. Do stosowania przez wyszkolony personel. 2. Produkt zawiera azydek sodu (NaN3), substancję chemiczną silnie toksyczną w czystej postaci. Azydek sodu, zastosowany w produkcie w stęŜeniu, które nie jest sklasyfikowane jako niebezpieczne, moŜe reagować z elementami kanalizacji wykonanymi z ołowiu i miedzi, powodując nagromadzenie silnie wybuchowych azydków metali. Po usunięciu spłukać duŜą ilością wody, aby zapobiec nagromadzeniu się azydku metalu w kanalizacji. 3. Podobnie jak w przypadku wszelkich materiałów pochodzących ze źródeł biologicznych, naleŜy stosować właściwe procedury postępowania. 4. W celu uniknięcia kontaktu z oczami i skórą naleŜy nosić odpowiednie osobiste wyposaŜenie ochronne. 5. Niewykorzystany roztwór utylizować zgodnie z lokalnymi, wojewódzkimi i krajowymi rozporządzeniami. Przechowywanie Przechowywać w temperaturze 2–8 °C. Nie stosowa ć po upływie terminu waŜności podanego na fiolce. Jeśli odczynniki są przechowywane w warunkach innych niŜ podane powyŜej, uŜytkownik musi zweryfikować takie warunki. Nie ma oczywistych oznak wskazujących na niestabilność produktu. Dlatego jednocześnie z badaniem próbek pochodzących od pacjenta naleŜy wykonywać kontrole dodatnie i ujemne. W wypadku nieoczekiwanego wyniku odczynu, którego nie moŜna wyjaśnić róŜnicami w procedurach laboratoryjnych, oraz gdy podejrzewa się problem z przeciwciałem, naleŜy się skontaktować z działem wsparcia technicznego firmy Dako. Przygotowanie próbek oraz materiały wymagane, ale niedostarczane Przeciwciała mogą być wykorzystane do znakowania utrwalonych formaliną skrawków zatapianych w parafinie. Preparaty tkankowe naleŜy pociąć na skrawki o wymiarach około 4 µm. Wymagane jest poddanie preparatów cieplnemu odmaskowaniu antygenu (HIER). Optymalne wyniki uzyskuje się w wyniku wstępnej obróbki tkanek przy uŜyciu roztworu EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High pH (10x) (Dako Autostainer/Autostainer Plus) (nr kat. K8010/K8014). (117801-003) Dako Denmark A/S IS524/PL/MNI/2009.12.04 str. 1/3 | Produktionsvej 42 | DK-2600 Glostrup | Denmark | Tel. +45 44 85 95 00 | Faks +45 44 85 95 95 | CVR No. 33 21 13 17 Odparafinowane skrawki: Do obróbki wstępnej utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie skrawków tkankowych, które zostały odparafinowane, zalecany jest odczynnik Dako PT Link (nr kat. PT100/PT101). Szczegółowe instrukcje zawiera Instrukcja uŜytkownika aparatu PT Link. Postępować według procedury wstępnej obróbki tkanek zamieszczonej w ulotce roztworu EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High pH (10x), (Dako Autostainer/Autostainer Plus) (nr kat. K8010/K8014). Dla aparatów PT Link naleŜy stosować następujące parametry: Temperatura wstępnego ogrzewania: 65 °C; temperatura i czas odmaskowania antygenu: 97°C przez 20 (±1) minut, oc hłodzić do 65°C. Usun ąć statywy na szkiełka aparatu Autostainer wraz ze szkiełkami ze zbiornika aparatu PT Link i natychmiast zanurzyć szkiełka w słoju/zbiorniku (np. PT Link Rinse Station, nr kat. PT109) wypełnionym rozcieńczonym buforem EnVision FLEX Wash Buffer (10x), (Dako Autostainer/Autostainer Plus) (nr kat. K8010) o temperaturze pokojowej. Zostawić szkiełka w buforze Wash Buffer na 1 – 5 minut. Skrawki zatapiane w parafinie: W celu odmiennego przygotowania próbek zarówno odparafinowanie, jak i odmaskowanie moŜna wykonać w aparacie PT Link z zastosowaniem zmienionej procedury. Informacje moŜna znaleźć w Instrukcji uŜytkownika aparatu PT Link. Po zakończeniu wykonywania odczynu skrawki tkankowe naleŜy poddać odwodnieniu, oczyszczeniu i nakryć za pomocą środka do trwałego zatapiania. W trakcie przygotowywania oraz podczas procedury znakowania immunohistochemicznego skrawki nie powinny wyschnąć. W celu uzyskania lepszego przylegania skrawków do szkiełek podstawowych zaleca się stosowanie szkiełek Dako Silanized Slides (nr kat. S3003). Procedura barwienia oraz materiały wymagane, ale niedostarczane Zalecanym systemem wizualizacji jest EnVision FLEX, High pH (Dako Autostainer/Autostainer Plus) (nr kat. K8010). Kolejne kroki barwienia oraz czasy inkubacji zaprogramowano wstępnie w oprogramowaniu aparatów Dako Autostainer/Autostainer Plus, przy uŜyciu następujących protokołów: Protokół wzorcowy: FLEXRTU2 (200 µL dozowanych odczynników) lub FLEXRTU3 (300 µL dozowanych odczynników) Autoprogram: GFAP (bez barwienia kontrastowego) lub GFAPH (z barwieniem kontrastowym) Dla etapu „Auxiliary” naleŜy ustawić opcję „rinse buffer ” w programach barwienia ≤10 szkiełek. W przypadku programów barwienia >10 szkiełek etap Auxiliary naleŜy ustawić na „none”. Zapewnia to porównywalne czasy płukania. Wszystkie procedury inkubacji naleŜy równieŜ przeprowadzać w temperaturze pokojowej. Szczegółowe informacje zawiera instrukcja obsługi odpowiedniego aparatu. Jeśli protokoły nie są dostępne w uŜywanym aparacie Dako Autostainer, naleŜy skontaktować się z działem wsparcia technicznego firmy Dako. Optymalne warunki mogą się zmieniać w zaleŜności od rodzaju materiału i sposobów jego przygotowania i powinny być określone indywidualnie w kaŜdym laboratorium. Aby moŜliwe było wykonanie oceny przez patologów z róŜnym nasileniem odczynu preparatów, naleŜy skontaktować się z działem obsługi/obsługą techniczną firmy Dako w celu uzyskania informacji dotyczącej zmiany programowania protokołu. NaleŜy upewnić się, Ŝe działanie zmodyfikowanego protokołu jest prawidłowe – w tym celu naleŜy ocenić, czy odczyn jest taki jak opisany w części „Charakterystyka wydajnościowa”. Zalecane jest barwienie kontrastowe hematoksyliną przy uŜyciu EnVision FLEX Hematoxylin, (Dako Autostainer/Autostainer Plus) (nr kat. K8018). Zaleca się stosowanie niewodnego, trwałego środka do zatapiania. Równolegle z odczynami na materiale pochodzącym od pacjentów naleŜy wykonywać dodatnie i ujemne próby kontrolne z uŜyciem identycznego protokołu. Dodatnia kontrola tkankowa powinna obejmować mózg i okręŜnicę, natomiast komórki/struktury powinny wskazywać odczyn reakcji taki jak opisany dla tej tkanki w części „Charakterystyka wydajnościowa” we wszystkich dodatnich preparatach. Zalecana kontrola ujemna to FLEX Negative Control, Rabbit, (Dako Autostainer/Autostainer Plus) (nr kat. IS600). Interpretacja wybarwienia Komórki znakowane przez przeciwciało wykazują odczyn cytoplazmatyczny. Charakterystyka działania Tkanki normalne: Przeciwciało znakuje astrocyty w mózgu (3), komórki gwiaździste przysadki mózgowej (7), komórki Schwanna i komórki gleju jelitowego. Dodatkowo znakowane są komórki mięśniowo-nabłonkowe piersi (6). W mózgu astrocyty wykazują odczyn z zakresu od umiarkowanego do silnego. W okręŜnicy komórki zwojów nerwowych w splocie Auerbacha i Meissnera wykazują odczyn słaby do umiarkowanego. Nie zaobserwowano odczynu w pęcherzu, tkance łącznej, wątrobie, tkance limfatycznej, mięśniach, trzustce, skórze i moczowodzie. Tkanki patologiczne: Przeciwciało oznakowało wszystkie 23 glejaki wielopostaciowe (GBM). Dla 20 z 23 GBM przynajmniej 50% komórek złośliwych dało wynik dodatni dla GFAP. Oznaczono tylko 3 z 22 przypadków raka z przerzutami do mózgu. Odczyn był zogniskowany i ograniczony do mniej niŜ 10% komórek złośliwych (3). 5/5 gwiaździaków półkulowych rzadkiego typu ziarnistego wykazało skupiony odczyn dodatni GFAP z przeciwciałem (4), które znakowało równieŜ 7/7 Ŝółtakogwiaździaków pleomorficznych (8), oraz komórki gwiaździste płata przedniego w 20/20 nowotworów przysadki mózgowej (7). W rdzeniaku (MB) desmoplastycznym przeciwciało oznakowało 8/11 przypadków. Odczyn występował w postaci skupionych obszarów komórek GFAP-dodatnich o mofrologii nowotworowej. Tylko 4/31 odmiany „klasycznej” wykazało ten rodzaj komórek nowotworowych, ale w klasycznych MB komórki GFAP-dodatnie o morfologii reaktywnych astrocytów zaobserwowano w 27/31 przypadków (9). Wykazano równieŜ, Ŝe przeciwciało znakuje 15/38 nerwiaków osłonkowych (38%) i 2 przypadki nerwiakowłókniaków splotowatych, podczas gdy 16 przypadków nerwiakowłókniaków skórnych dało wynik ujemny (10). W róŜnych chorobach piersi pochodzenia nowotworowego i pozanowotworowego procent komórek mięśniowo-nabłonkowych reagujących z przeciwciałem był znacząco zwiększony w stosunku do piersi prawidłowej, podczas gdy odczynu dodatniego nie stwierdzono w złośliwych komórkach 183 raków piersi róŜnych typów (6). W badaniu, którym objęto 36 pacjentów przeciwciało nie znakowało oponiaków (11). Piśmiennictwo (117801-003) Dako Denmark A/S 1. Eng LF, Ghirnikar RS, Lee YL. Glial fibrillary acidic protein: GFAP-thirty-one years (1969-2000). Neurochem Res 2000;25:1439-51. 2. Reske-Nielsen E, Oster S, Reintoft I. Astrocytes in the prenatal central nervous system. Acta path microbiol immunol scand Sect. A 1987;95:339-46. 3. Oh D, Prayson RA. Evaluation of epithelial and keratin markers in glioblastoma multiforme. An immunohistochemical study. Arch Pathol Lab Med 1999;123:917-20. IS524/PL/MNI/2009.12.04 str. 2/3 | Produktionsvej 42 | DK-2600 Glostrup | Denmark | Tel. +45 44 85 95 00 | Faks +45 44 85 95 95 | CVR No. 33 21 13 17 4. Geddes JF, Thom M, Robinson SFD, Revesz T. Granular cell change in astrocytic tumors. Am J Surg Pathol 1996;20:55-63. 5. Rutka JT, Murakami M, Dirks PB, Hubbard SL, Becker LE, Fukuyama K, et al. Role of glial filaments in cells and tumors of glial origin: a review. J Neurosurg 1997;87:420-30. 6. Viale G, Gambacorta M, Coggi G, Dell'Orto P, Milani M, Doglioni C. Glial fibrillary acidic protein immunoreactivity in normal and diseased human breast. Virchows Arch A Pathol Anat 1991;418:339-48. 7. Morris CS, Hitchcock E. Immunocytochemistry of folliculo-stellate cells of normal and neoplastic human pituitary gland. J Clin Pathol 1985;38:481-8. 8. Powell SZ, Yachnis AT, Rorke LB, Rojiani AM, Eskin TA. Divergent differentiation in pleomorphic xanthoastrocytoma. Evidence for a neuronal element and possible relationship to ganglion cell tumors. Am J Surg Pathol 1996;20:80-5. 9. Giangaspero F, Chieco P, Ceccarelli C, Lisignoli G, Pozzuoli R, Gambacorta M, et al. "Desmoplastic" versus "classic" medulloblastoma: comparison of DNA content, histopathology and differentiation. Virchows Arch A Pathol Anat 1991;418:207-14. 10. Kawahara E, Oda Y, Ooi A, Katsuda S, Nakanishi I, Umeda S. Expression of glial fibrillary acidic protein (GFAP) in peripheral nerve sheath tumors. A comparative study of immunoreactivity of GFAP, vimentin, S-100 protein, and neurofilament in 38 schwannomas and 18 neurofibromas. Am J Surg Pathol 1988;12:115-20. 11. Thompson L, Bouffard JP, Sandberg GD, Mena H. Primary ear and temporal bone meningiomas: a clinicopathologic study of 36 cases with a review of the literature. Mod Pathol 2003;16:236-45 Kawahara. Objaśnienie symboli Numer katalogowy Temperatura przechowywania ZuŜyć przed Wyrób medyczny do diagnostyki in vitro Zawartość wystarcza na <n> testów Producent Sprawdzić w instrukcji stosowania Numer serii (117801-003) Dako Denmark A/S IS524/PL/MNI/2009.12.04 str. 3/3 | Produktionsvej 42 | DK-2600 Glostrup | Denmark | Tel. +45 44 85 95 00 | Faks +45 44 85 95 95 | CVR No. 33 21 13 17